Een nieuwe methode van de Drug aan Multiple zebravis ( Danio rerio) En de kwantificering van Terugtrekking

Samenvatting

Een nieuwe methode voor het verminderen van variabiliteit bij het blootstellen van vissen aan geneesmiddelen wordt uitgelegd. Vissen die werden blootgesteld aan verschillende patronen van ethanolblootstelling bleken veranderde angstniveaus te hebben tijdens ontwenning in een licht/donker scototaxisch onderzoek.

Samenvatting

Angsttesten bij zebravissen worden vaak bestudeerd in combinatie met de toepassing van farmacologische substanties. In deze studies worden vissen routinematig gevangen en getransporteerd tussen thuisaquaria en doseringstanks. Om de gemakkelijke toediening van verbindingen te verbeteren, werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het overbrengen van vissen tussen tanks voor medicijntoediening. Inzetstukken die zijn ontworpen voor het afzetten, werden gebruikt om groepen vissen in de medicijnoplossing over te brengen, waardoor nauwkeurige dosering van alle vissen in de groep mogelijk werd. Dit verhoogt de precisie en efficiëntie van dosering, wat erg belangrijk wordt bij lange schema's van herhaalde medicijntoediening. We implementeerden deze procedure voor gebruik in een studie die het gedrag van zebravissen in de licht/donker-test onderzocht na toediening van ethanol met verschillende schema's van 21 dagen. Bij vissen die dagelijks matige hoeveelheden alcohol kregen, was er een significant verschil in locatievoorkeur na 2 dagen ontwenning in vergelijking met de controlegroep. Echter, een significant verschil in locatievoorkeur in een groep die werd blootgesteld aan wekelijkse binge-toediening, werd niet waargenomen.

Dit protocol kan worden gegeneraliseerd voor gebruik met alle soorten verbindingen die wateroplosbaar zijn en kan worden gebruikt in elke situatie waarin het gedrag van vissen tijdens of na lange schema's van medicijntoediening wordt onderzocht. De licht/donker-test is ook een waardevolle methode om op ontwenning geïnduceerde veranderingen in angst te beoordelen.

Inleiding

De zebravis (Danio rerio) is een klein teleost soorten van oorsprong uit India, dat is een bruikbaar model organisme voor gedragsverandering ¹ en medisch onderzoek ^2,3. Zebravis worden ook vaak gebruikt bij het testen van verschillende farmacologische stoffen om hun impact op het gedrag karakteriseren. Diverse doseringen en schema van toediening zijn gebruikt om het gedrag van de zebravis na de toediening van verbindingen zoals stimulantia ^4, anxiolytica ⁵ en ethanol ^6-8 onderzoeken.

Ons laboratorium heeft het effect van verschillende schema ethanol toediening op zebravis angst en beweging in de goed gevalideerde licht / donker assay ^{9, 20,} ook bekend als de scototaxic assay onderzocht. Een nieuwe wijze van toediening ethanol werd ontwikkeld om de efficiëntie voor herhaalde dagelijkse toediening toenemen gedurende een lange periode (21 dagen) ⁶ . Eerder gebruikte werkwijzen waren praktisch echter zochten we een methode verrekening verminderd met bijbehorende tijdskosten ontwikkelen, en men tegelijkertijd nauwkeurig tijdgestuurde toediening van het geneesmiddel van belang grote aantallen vissen. In traditioneel onderzoek met behulp van ethanol, worden zebravis gesaldeerd en overgebracht van de ene naar de andere tank met de juiste mengsel van ethanol en water ^10-12. Hoewel deze methode is algemeen aanvaard, kan saldering zebravis de variabiliteit in de tijd genomen om te introduceren en te verwijderen van de vis uit de drug oplossing te verhogen. Daarom kan de exacte blootstelling aan de verbinding van belang variëren in de loop van een experiment met herhaalde toediening. Een methode die bronnen van fouten als gevolg van de variabiliteit in het vervoer tijden reduceert is dus wenselijk. Met onze methode kunnen we alle vissen tegelijk bewegen, waardoor identieke doseertijd per vis. Na blootstelling aan ethanol (hier beschreven) kunnen zebravissen worden getest in elke number gedrags- testen, waaronder die angst beoordelen. Doseren groepen van vis met behulp van de nieuwe methode heeft praktische toepassingen buiten het vermogen om nauwkeurig te repliceren en te standaardiseren dosering tussen onderwerpen en over groepen van vis. De komst van nieuwe software die het mogelijk maakt voor het volgen van meerdere vissen in een keer kan zien onderzoekers maken gebruik van onze methoden om herhaalbaarheid en nauwkeurigheid in hun experimenten. Gezien het wijdverbreide gebruik van zebravis als modelorganisme voor Behavioral Neuroscience, zal deze methode de efficiëntie en bruikbaarheid in de toekomst farmacologische studies te verhogen.

In het huidige paradigma, werd een herhaalde doseringsschema gebruikt die ongeveer weerspiegelt de menselijke drinken schema. Vissen werden willekeurig toegewezen aan één van drie groepen: controle, dagelijkse matige, of wekelijkse-binge. Het doseringsschema was 21 dagen duurden gekozen omdat het aanzienlijk belichtingstijden in eerdere studies ⁷ overschreden. Controlevissen ontvangen nul alcohol, ontving dagelijks matige vis 0,2% alcohol een keer per dag, en wekelijks binge-vis ontvingen 1,4% alcohol een keer per week. Het licht / donker taak werd gebruikt om angst te beoordelen na 2 dagen van terugtrekking. Dit is een relatief eenvoudige test te beheren met een rechthoekige arena waarin de wanden enerzijds zijn wit en anderzijds donker ⁹ gebruikt. Volwassen zebravissen robuust voorkeur aan de donkere kant van de arena onder controle condities ^6,9,13. Toegenomen angst is operationeel gedefinieerd als aanzienlijk meer tijd in de donkere zone en verminderde angst kan worden aangenomen wanneer de vis besteedt relatief meer tijd in de lichte zone. Met motion-tracking software, kunnen andere informatieve variabelen ook worden gekwantificeerd, zoals gemiddelde snelheid, immobiliteit, meanderende, en zone overgangen ^14.

De dosering methode ontwikkeld in ons laboratorium kan worden toegepast op elk onderzoek waarbij in water oplosbare verbindingen worden toegediend aan één of meer zebrafish. Veel andere farmacologische middelen die kunnen profiteren van deze methodiek worden momenteel getest in de zebravis. Gewoonlijk geteste verbindingen omvatten nicotine, chloordiazepoxide, buspiron en scopolamine, die zijn opgelost in een soortgelijke wijze ethanol; door mengen van de juiste hoeveelheid van de chemische stof in water. Daarom is het algemene toepassingsgebied van deze procedure is veel breder en niet beperkt tot ethanol. Bovendien na toediening van geneesmiddelen voor meerdere dagen, de licht / donker taak is slechts één van vele gedragstesten die kunnen worden toegepast. Na toediening van het geneesmiddel of tijdens de terugtrekking, andere populaire assays die kunnen worden gebruikt zijn onder andere de roman tank duiken-test ¹⁵ en tests van sociaal gedrag zoals shoaling ^16. De volgende procedure zal een efficiënte methode van herhaaldelijk overbrengen groepen van vis of van individuele vissen in oplossingen die een farmacologische verbinding van belang te schetsen. Bovendien, het proces van het testen van angst met de licht / donker-testin groepen van vis die in intrekken na blootstelling aan lange lijsten van alcohol toediening worden beschreven.

Protocol

Alle procedures en gedragsmatige testen werden goedgekeurd door MacEwan University's Animal Research Ethics Board onder protocol nummer 06-11-12, dat is in overeenstemming met de Canadese Raad voor Animal Care's richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Bereid Doseren Tanks, Solutions, en het toedieningsschema

1. Bereid een toedieningsschema dat de dieren worden toegediend in dezelfde omgeving en gedurende dezelfde tijd van de dag aan een verwart tijd of vertekenende visuele stimuli voorkomen.
2. Verkrijgen van zoveel identiek, 1.5 L, duidelijke polypropyleen paai tanks als nodig is voor het aantal groepsgrootte. Gebruik groepen van 8 vissen per tank, waardoor voor 2 groepen van vis te testen per dag later in de procedure (zie stap 3). Gebruik een vuilwatertank en één doseertank per groep (2x totaal aantal groepen).
   1. Plaats 400 pm paai inserts in alle opslagtanks. Fziek de tanks met water leefgebied of omgekeerde osmose water op de juiste temperatuur (zebravis, 25-28 ° C) die overeenkomt met de temperatuur vis gewoonlijk ondergebracht bij.
      LET OP: Er kunnen ongewenste chemische interacties tussen sommige drugs en de chemische bestanddelen van gebufferd leefgebied water. In deze situatie gebruik omgekeerde osmose water gebufferd met minimale of geen aquarium zouten voor toediening, en voor de controlegroepen.
   2. Zorg ervoor dat de tanks zijn in een neutrale omgeving te conditioneren vis op externe visuele prikkels tijdens de dosering te vermijden.
3. Bereid de drug oplossing. Meng de geschikte hoeveelheid van het geneesmiddel met leefgebied water in de paai tanks. Bereid de 0,2% ethanoloplossing combineert 3 ml van een hoogwaardige ethanol (95% niet-gedenatureerde ethanol) met 1.497 ml water. Bereid de 1.4% ethanoloplossing door het combineren 21 ml ethanol met 1.479 ml water.

2. Verrekening Vis en Ethanol Administration Procedure

1. Zorgvuldig netto vis uit hun habitat tanks en de overdracht naar de juiste vuilwatertank met de paai insert. Idealiter, het huis van de vis in de paaitijd insert te elimineren netten helemaal.
2. Met alle vissen in hun respectieve deelneming tanks, til de paai plaatst uit de vuilwatertank en plaats deze in de juiste drug schoonwatertank (Figuur 1A).
   1. Noteer de dosering als voorgeschreven. Gebruik 30 min in ethanol oplossing voor de hier beschreven procedure.
   2. Indien mogelijk, assistenten helpen bij de overdracht van alle experimentele groepen aan de geneesmiddeloplossing tegelijkertijd nauwkeurige dosering te garanderen. Alternatief: breng één groep tegelijk en bijhouden van afzonderlijke groepen 'doseren keer (Figuur 1A).
3. Aan het einde van de vereiste doseringsperiode, verwijder de vis uit de ethanoloplossing door voorzichtig optillen van de paai inzetstukout van de drug-oplossing en het plaatsen voorzichtig terug in de vuilwatertank.
4. Zachtjes net de vis in de opslagtanks en plaats ze terug in hun leefgebieden tot de volgende geplande dosering tijd, of plaats de paai steek terug in de vuilwatertank te netting elimineren.
5. Zoals eerder, indien mogelijk vermeld binnen de parameters van stallen materiaal, huis dieren in dezelfde tank en paai inzetstuk wordt gebruikt als vuilwatertank. Dit zal elimineren saldering helemaal tijdens de toediening procedure.

3. Behavioral Testen

1. Verkrijgen van een licht / donker arena 9,5 cm breed en 55 cm lang en 9,5 cm diep met een witte waterdichte vloer (Figuur 1B). Plak wit en zwart waterdichte niet-reflecterend papier aan de binnenwanden van de arena met behulp van klittenband, waarbij de helft van de arena bedekt met witte en de helft bedekt met zwart. Vul de arena tot een diepte van 5 cm met leefgebied water bij een temperatuur van 25-28 ° C. Maintain deze temperatuur tijdens testen.
2. Minimaliseer externe visuele prikkels door de aanleg van een witte driezijdige behuizing voor de arena te zijn gelegen in. Zorg ervoor dat de testruimte heeft diffuus overhead verlichting die niet reflecties op het wateroppervlak veroorzaakt, maar toch voldoende helder voor de beweging tracking software, of post -hoc handleiding kwantificering van videobeelden.
3. Plaats de arena in de behuizing en zet de opname en bewegingsanalyse parameters van het gedrag tracking software. Stel de proef duur 5-15 min, afhankelijk van de onderzoeksvraag.
   LET OP: Hier gebruikten we 5 min.
4. Vervoer de groep vissen te worden getest om het onderzoeksgebied in het leefgebied tank en plaats ze buiten de arena behuizing. Acclimatiseren de vis gedurende 10 minuten.
5. Zachtjes net een vis uit de betreffende groep en plaats in het midden van de licht / donker-arena, en zorg ervoor dat de vis los wanneer het wordt evenwijdig aan de lange as van de arena om AVOid vertekenende de vis aan de lichte of donkere zone.
6. Beginnen met opnemen gedrag onmiddellijk nadat het dier wordt vrijgelaten. Kijk voor alle software problemen met het bijhouden van de vis of voor vis springen of invriezen. Draai de arena 180 ° na de helft van de proefpersonen getest één verwart raakt door vooroordelen gevolg van welke kant van de arena is gericht naar het open uiteinde van de behuizing.
7. Na de proefperiode is afgelopen, zachtjes net en haal de vis uit de arena om een ​​vuilwatertank of leefgebied tank.

4. Analyse

1. Onderzoeken de tijd doorgebracht in het licht versus donker zones. Voor elke groep en elke vis, het verkrijgen van de relatieve tijd doorgebracht in de lichte en donkere zones en analyseren met behulp van een one sample t-test (of Wilcoxon test voor niet-parametrische gegevens; verschil met (de helft van het totale proces tijd) 150 sec) te bepalen of groepen significant liever een ruimte boven de andere.
2. Te vergelijken voorkeuren, berekenen een preference index door aftrekken van de tijd doorgebracht in de lichte zone van de tijd doorgebracht in de donkere zone en vergelijk de verschillen tussen groepen. t- tests kunnen worden gebruikt om twee groepen te vergelijken. Vergelijk meerdere groepen met een one-way variantie analyse met behulp van Tukey's HSD post hoc-test waar nodig (of de Kruskal-Wallis-test met Dunn's meervoudige vergelijking post hoc test voor niet-parametrische data).
3. Vergelijk snelheid, aantal zone overgangen, meanderende en immobiliteit tussen groepen. Gebruik one-way variantie-analyse met behulp van Tukey's HSD post hoc-test waar nodig (of de Kruskal-Wallis-test met Dunn's meervoudige vergelijking post hoc test voor niet-parametrische data).

Resultaten

Om de nauwkeurigheid en controle farmacologische studies zebravis is het belangrijk om tijd de duur van ethanol toediening consistent en nauwkeurig beschreven behouden. Onze procedure kan het gemak en de doorvoer van de dosering procedure te verhogen. De toediening van ethanol op een wekelijkse-binge of dagelijks matige schema resulteerde in gewijzigde angst niveaus, gemeten met de licht / donker-test, in vergelijking met controles. Wanneer onderzocht twee dagen na de laatste toediening zebravis in de controlegroep (die...

Discussie

Vorige studies met toediening van het geneesmiddel in de zebravis hebben gewoon vertrouwd op saldering vis om ze te vervoeren van hun huis tank in de drug oplossing ^12,16. Saldering is niet altijd consistent en duurt vaak langer dan verwacht als gevolg van de ontsnapping respons van de zebravis, die aanzienlijke individuele variatie heeft. Traditionele overdrachtsmethoden, hoewel nuttig, kan worden verbeterd door de hoeveelheid van de totale tijd doorbrengen vis buiten water, evenals het verminderen van de ho...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Behuizingssysteem voor tafelblad met drie planken	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Kuittank met 400 μm schot	Aquatic Habitats	N/A
Pure graanethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Software voor bewegingsregistratie	Noldus Information Technology
Pipet	Eppendorf Canada
Licht/donker-arena	Custom		Constructeer volgens de procedurebeschrijving. 9.5 cm breed, 9.5 cm diep, 55 cm lang.