Telomerase wordt tot expressie gebracht in de neonatale hersenen en ook in verschillende regio's van de volwassen hersenen. We presenteren een niet-toxische, tijdbesparende TRAP-assay voor de analyse van telomerase-activiteit in verschillende regio's van de muizenhersenen en voor het detecteren van verschillen in telomerase-activiteit tussen mannelijke en vrouwelijke muizenhersenen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Telomerase activiteit in de verschillende regio's van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Telomerase, een ribonucleoproteïne, is verantwoordelijk voor het handhaven van de telomeerlengte en daarmee het bevorderen van genomische integriteit, proliferatie, en levensduur. Bovendien telomerase beschermt de mitochondriën tegen oxidatieve stress en resistentie tegen apoptose, suggereert de mogelijke betekenis voor de overlevende van niet-mitotische, zeer actieve cellen zoals neuronen. We hebben eerder werd aangetoond dat telomerase nieuwe activatoren telomerase activiteit en expressie in de verschillende muizen hersengebieden verhogen en motorische neuronen cellen tegen oxidatieve stress. Deze resultaten versterken het idee dat telomerase is betrokken bij de bescherming van neuronen uit verschillende letsels. Om de rol van telomerase in de hersenen onderstrepen we hier vergelijken de activiteit van telomerase in mannelijke en vrouwelijke muizenhersenen en de afhankelijkheid van de leeftijd. TRAP assay is een standaard methode voor het detecteren van telomerase-activiteit in verschillende weefsels of cellijnen. Hier laten we de analysis van telomerase-activiteit in drie gebieden van de hersenen van muizen door niet-denaturerende eiwit extractie middels CHAPS lysis buffer gevolgd door modificatie van de standaard TRAP assay.
In deze 2 stappen assay endogene telomerase verlengt specifieke telomerase substraat (TS primer) door toevoeging van TTAGGG 6 bp herhalingen (telomerase reactie). De telomerase reactieproducten worden versterkt door PCR-reactie het creëren van een DNA-ladder van stappen 6 bp. De analyse van de DNA ladder wordt door 4,5% hoge resolutie agarose gelelektroforese gevolgd door kleuring met zeer gevoelige nucleïnezuur vlek.
Vergeleken met de traditionele TRAP assay die gebruik 32 P gemerkt radioactief dCTP voor DNA detectie en polyacrylamide gelelektroforese oplossing van het DNA ladder Dit protocol biedt niet giftige tijdbesparende TRAP-assay voor het evalueren van telomerase-activiteit in de hersenen van muizen, tonen de mogelijkheid om detecteren verschillen in telomerase activiteit in de verschillende vrouwelijke en mannelijke regio muizenhersenen.
Inleiding
Telomerase is een ribonucleoproteïne uit telomerase reverse transcriptase (TERT), de katalytische subeenheid van telomerase, en een RNA component (TERC). De canonieke rol van telomerase is de juiste lengte van de telomeren behouden door toevoeging van repetitieve sequenties (TTAGGG) de telomere eindigt derhalve bevordering genomische integriteit en celproliferatie 1. Aanvullende functies werden toegeschreven aan TERT in cellen, dwz resistentie tegen apoptose geïnduceerd door verschillende beschadigende middel 2 verleent beschermt menselijke mesenchymale stamcellen uit oxidatieve stress 3, en speelt een pro-survival rol in volledig gedifferentieerde neuronen door deelneming aan positieve RNA TIA1 granules 4.
TERT- wordt uitgedrukt en zich hoofdzakelijk bezighield met somatische delende cellen en in de meeste vormen van kanker, terwijl het enzym expressie en activiteit niveaus strak zijn geregeld in niet-delende cellen 5,6. Studies hebben aangetoond dat in de rOdent hersenen, telomerase-activiteit niet herkend door postnatale dag 10, terwijl TERT mRNA wordt op lagere niveaus in de volwassenheid 7. Andere studies toonden telomerase activiteit in de volwassen sub-ventriculaire zone, de bulbus olfactorius, de hippocampus en in de volwassen cortex en cerebellum 8. We hebben onlangs aangetoond dat nieuwe verbindingen die telomerase expressie en activiteit te verhogen in de hersenen en ruggenmerg uitgeoefend neuroprotectieve effecten in N-methyl-D-aspartaat (NMDA) - geïnjecteerde muizen vertraagde het ontstaan en de progressie van amyotrofische laterale sclerose ziekte in SOD1 transgene muizen en verhoogde de overleving van motorische neuronen in het ruggenmerg van deze muizen 9. Om volledig de pro-survival rol van telomerase in neuronen en in de hersenen, is het essentieel om een eenvoudige en relatief gevoelig snelle test voor het detecteren van telomerase-activiteit in de verschillende gebieden van de hersenen ontwikkelen.
De telomeer rEPEAT amplificatie protocol (TRAP) is een bekende gevoelige test combineert de canonieke activiteit van telomerase en de polymerase kettingreactie (PCR). In deze assay, telomerase voegt TTAGGG herhaalt een telomerase substraat (TS primer) oligonucleotide, gevolgd door PCR-amplificatie waarbij 6 baseparen (bp) DNA-ladder met de TS reverse primer genereert -. ACX 32P gemerkte dCTP worden gebruikt om te detecteren lage hoeveelheid PCR producten. De DNA ladder wordt opgelost door sequentiebepaling polyacrylamide gelelektroforese (PAGE). Zowel de intensiteit van de DNA-banden en de lengte van de DNA ladder weerspiegelen de hoeveelheid actief enzym moleculen en hun processivity respectievelijk 10.
Dit traditionele test houdt een aantal grote problemen: Het gevaar van blootstelling aan radioactieve stoffen, grote en moeilijk te sequencing PAGE en de tijd het verbruik van de gel lopen en blootstelling van het radioactieve product film verwerken ('s nachts in beide gevallen).
Dit protocol biedt een verbeterde niet-radioactieve agarose mini-gel gebaseerde bepaling. De DNA 6 bp ladder wordt opgelost met 4,5% hoge-resolutie agarose gel en de detectie wordt bereikt met zeer gevoelige nucleïnezuur vlek. De combinatie van het gebruik van hoge resolutie agarose mini-gel en gevoelige nucleïnezuur kleuring biedt eenvoudig te hanteren assay, wordt voorkomen van blootstelling aan radioactiviteit en aanzienlijk verkort overall duration assay van 3 dagen tot enkele uren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven in de Ben-Gurion Universiteit (IL-39-08-2010).
1 Mouse Brain Eiwitextractie
- Bereid 3 buisjes van 15 ml die elk 5 ml Ringer's oplossing en plaats buisjes op ijs.
- Offer de muis met behulp van isofluraan anesthesie (LET OP - Gebruik van chemische kap) gedurende 10-20 sec gevolgd door cervicale dislocatie en onmiddellijke onthoofding.
- Verwijder de hersenen uit de schedel en spoel een paar seconden met ijskoude Ringer's oplossing om schade aan het hersenweefsel voorkomen.
- Met een chirurgisch mes, scheid de cerebellum (CR) en hersenstam (BS) van de frontale cortex. Vervolgens scheiden de kleine hersenen van de hersenstam en snijd de frontale kwab (FL) van de frontale cortex; verwijder het reukorgaan van de frontale kwab. Plaats de 3 gebieden van de hersenen in de aangewezen 15 ml buizen.
- Homogeniseer het weefsel in elke buis. Fr toevoegenoplossing ESH ijskoud Ringer's zodat elke buis bevat hetzelfde volume en centrifugeer gedurende 7 min bij 800 x g.
- Verwijder het supernatant en voeg 100 pl CHAPS lysis buffer aan elke buis. Meng goed door de oplossing enkele malen (~ 10) door een 1 ml spuit met een 21 G naald en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Breng de inhoud van elke buis in nieuw micro-centrifugebuis en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 13.000 x g. Breng de bovenstaande om een nieuwe micro-centrifugebuis en bepalen van de eiwitconcentratie met behulp van een eerder vastgestelde methode. Bewaar de eiwitextracten in aliquots van 10 pi bij -80 ° C.
2 TRAP Assay Voorbereiding van instrumenten, Reaction Solutions, en Protein Verwatering Berekeningen
- Bereid juiste aantal gelabelde micro-centrifuge buizen voor proteïne-extract verdunningen en telomerase reactie buffer. Voer alle pipetteren in het protocol met behulp van filter tips om besmetting te voorkomen.
- Ontdooi de volgende oplossingen op het ijs: TRAP reactie mix 10x, TS primer, dNTP's, UPW en proteïne-extracten (zie tabel van materialen voor reagentia en reagentia concentraties).
- Verdun de oplossing van het eiwit extract tot een eindconcentratie van 1 ug / ul met ultrazuiver water (UPW).
3 Telomerase Reaction
- Bereid telomerase reactiemengsel door toevoeging van de volgende opties om een micro-centrifugebuis: 2 pi TRAP mix (10x), 1 ui TS primer (0,1 ug), 1 ui dNTPs (10 mm) en 15 ul UPW. Voor meerdere monsters, vermenigvuldig bovengenoemde volumes door het aantal monsters, plus 1.
- Voeg 19 ul van het reactiemengsel aan elke reageerbuis en voeg 1 pl van het verdunde proteïne extract (1 ug eiwit) aan elke buis voor een eindvolume van 20 pi.
- Plaats de reageerbuisjes in een 30 ° C voorverwarmd waterbad gedurende 45 minuten.
4. PCR Reaction
- Vijftien min voor het einde van de telomerase reactie ontdooien de volgende oplossingen: ACX primer, Titanium Taq buffer, UPW.
- Bereid PCR reactie mix door het toevoegen van de volgende opties om een micro-centrifuge buis: 2,5 ul Titanium Taq Buffer (10x), 1 ui ACX primer (0,1 ug), 2 pi UPW (1 pi bij IC wordt gebruikt) en 0,5 ul Titanium Taq Polymerase (50x). Voor meerdere monsters, vermenigvuldig bovengenoemde volumes door het aantal monsters plus 2.
- Voeg 6 ul van de PCR-mix elke PCR-buis en voeg het gehele volume van de telomerase reactiemengsel (20 pi) aan elke buis voor een eindvolume van 26 pi.
- Plaats de PCR-buisjes om een PCR thermo fietser en start het volgende programma:
- 90 ° C - 2 min.
- 94 ° C -. 30 sec *
- 60 ° C -. 30 sec *
- 72 ° C -. 45 sec *
- 72 ° C - 2 min.
WINKEL PCR producten bij -20 ° C.
* = 34 cycli
5. Agarose Mini-gel Voorbereiding, Monsters Hardlopen, en gelkleuring
- Voeg 25 ml gekoelde elektroforese buffer (TBE) en een roerstaaf in een bekerglas dat 2-4 maal het volume van de bufferoplossing en langzaam strooi 1,125 g van de hoge-resolutie (HR) agarose poeder terwijl de oplossing snel geroerd . Verwijder het roerstaafje, dek het bekerglas af met een plastic folie en prik in een klein gaatje voor de ventilatie. Verhit de beker in de magnetron op "Low" stroom voor 3 min en dan overschakelen op "Hoog" kracht en verwarm de oplossing in korte pulsen met zorg niet te leiden tot morsen. Merk op dat wanneer het schuim door verhitting wordt grote bellen en verdwijnt na een paar seconden, de agarose klaar.
- Zet de gel een horizontale mini-gel apparaat, nadat de gel stolt bij kamertemperatuur zodat de gel te koelen gedurende 20 minuten bij 4 ° C vóór gebruik.
- Laad elke baan met 25 ul van TRAP monster (20 ul TRAP PCR-producten en 5 ul 6x gel-loading dye) en lopen op 110 V gedurende 3 uur in een 4 ° C koude kamer.
- Bereid nucleïnezuur vlek 3x werkende oplossing door het toevoegen van 15 pi 10,000x nucleïnezuur vlek, stock oplossing tot 50 ml dubbel gedestilleerd water (DDW) met 0,1 M NaCl (0,29 g). Vlekken op de gel gedurende 20 minuten onder voorzichtig schudden.
- Gebruik UV transilluminator met 302 nm golflengte aan de TRAP ladder DNA-banden te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hele cellen eiwitextracten werden bereid uit de frontale kwab (FL), hersenstam (BS) en cerebellum (CR), verkregen uit 3 CD-1 vrouwelijke en 3 mannelijke CD-1-muizen op de leeftijd van 1 en 3 maanden voor de gewijzigde TRAP assay en 3 CD-1 mannelijke muizen op de leeftijd van 2 maanden oud voor de radioactieve TRAP assay. Telomerase-activiteit werd gedetecteerd in 1 ug eiwit extract met behulp van de gemodificeerde TRAP-test en 2 pg eiwitten te extraheren voor de radioactieve TRAP assay. Detectie van telomerase-activitei...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Analyse van telomerase-activiteit in de hersenen van muizen via de TRAP assay bestaat uit 4 belangrijke stappen: 1) proteïnen extractie uit specifieke gebieden van het hersenweefsel 2) TS primerverlenging door telomerase - telomerase reactie 3) amplificatie van het telomerase reactieproducten door PCR 4 ) scheiding van de PCR producten met behulp van hoge resolutie agarose gel.
Deze gemodificeerde TRAP assay worden twee belangrijke problemen die ontstaan uit de traditionele assay: het gebr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door B.G. Negev-technologie en de bijdrage van Linda Powers.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| TRAP Mix (10x) | Handmatig gemaakt, meng het volgende in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5% TWEEN (verkocht door Sigma). Aliquots worden ingevroren bij -20 °C. | ||
| Ringer's oplossing | Handmatig gemaakt, meng het volgende in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L D-(+)-glucose watervrij. | ||
| Isofluraan | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Zorgvuldig hanteren in een chemische kap |
| dNTP's (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligo's besteld in DRY-formaat en UPW toegevoegd volgens vereiste concentratie | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligo's besteld in DRY-formaat en UPW toegevoegd volgens vereiste concentratie | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Elke hoogwaardige hoog-resolutie agarose kan geschikt zijn |
| Mini-gel apparaat | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic Acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligo's besteld in DRY-formaat en UPW toegevoegd volgens vereiste concentratie | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Voeg PMSF (proteaseremmer) toe tot een eindconcentratie van 1 mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 muizen | HARLAN Laboratories INC. |
Referenties
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602(2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
