In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

Samenvatting

In deze video artikel beschrijven we de in vitro synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen.

Samenvatting

De afgifte van exogene coderende synthetische messenger RNA (mRNA) voor inductie van eiwitsynthese in gewenste cellen enorm potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde, fundamentele celbiologie, behandeling van ziekten en herprogrammering van cellen. We beschrijven hier een stapsgewijze protocol voor het genereren van gemodificeerde mRNA met verminderde immuunactivatie en potentieel verhoogde stabiliteit, kwaliteitscontrole van geproduceerde mRNA, transfectie van cellen met mRNA en verificatie van de eiwitexpressie geïnduceerd door flowcytometrie. Tot 3 dagen na een transfectie met eGFP mRNA, de getransfecteerde HEK293 cellen eGFP. In deze video artikel, wordt de synthese van eGFP mRNA beschreven als een voorbeeld. Echter, de procedure worden toegepast voor de productie van andere gewenste mRNA. Met de synthetische gemodificeerde mRNA, kunnen cellen worden geïnduceerd om de gewenste eiwitten, die zij normaal gesproken niet tot expressie transient expressie.

Inleiding

In cellen de transcriptie van messenger RNA (mRNA) en de volgende translatie van mRNA in de gewenste eiwitten de goede werking van de cellen. Erfelijke of verworven genetische aandoeningen kan leiden tot onvoldoende en disfunctionele synthese van eiwitten en ernstige ziekten. Dus een nieuwe therapeutische benadering voor de produktie van ontbrekende of defecte eiwitten induceren exogene levering van synthetisch gemodificeerde mRNA in cellen, die codeert voor het gewenste eiwit. Daardoor worden cellen geactiveerd om functionele eiwitten, die ze normaal niet produceert of zou uiteraard niet moeten synthetiseren. Met deze benadering kunnen genetische aandoeningen worden gecorrigeerd door het inbrengen van mRNA dat codeert voor de defecte of ontbrekende eiwit ^1. De mRNA therapie kan ook worden gebruikt voor vaccinatie eiwit antigenen die worden uitgedrukt door tumorcellen of pathogenen synthetiseren. Daardoor kan gastheerimmuunsysteem worden geactiveerd om effectief elimineren tumorcellen of Infe voorkomenCTIES ^2,3. Bovendien afgelopen jaren mRNA succes gebruikt geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) genereren. Hiertoe werden fibroblasten getransfecteerd met mRNA induceren de expressie van herprogrammering factoren ^4-6 en om te zetten in iPSCs met een enorm potentieel regeneratieve geneeskunde.

Eerder is het gebruik van conventionele mRNA geassocieerd met lage stabiliteit en sterke immunogeniciteit. Aldus klinische toepassingen van conventionele mRNA beperkt. De vervanging van cytidine en uridine van 5-methylcytidine en pseudouridine in het mRNA-molecuul door Kariko en collega rendered mRNA-moleculen stabiel in biologische vloeistoffen en drastisch verminderd immuunactivatie ^7-10, die nu kan de klinische toepasbaarheid van gemodificeerde mRNA.

Met synthetisch geproduceerde gemodificeerde mRNA, kan gewenst gen transcripten tijdelijk worden geleverd in vivo ¹¹of in vitro om eiwitexpressie te induceren. De geïntroduceerde mRNA wordt vertaald onder fysiologische omstandigheden door de cellulaire translatie machinerie. Wegens gebrek aan integratie in het gastheergenoom opzichte virale gentherapie vectoren, is het risico van oncogenese voorkomen ^12,13. Zo zal de behandeling met behulp van gemodificeerde synthetische mRNA krijgen betere klinische acceptatie in de toekomst.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de productie van gemodificeerde mRNA (figuur 1), transfectie van cellen met mRNA en de evaluatie van eiwitexpressie in getransfecteerde cellen.

Protocol

1. Vergroting van plasmiden die Vereiste codering van DNA-sequenties (CDS)

1. Voorverwarmen SOC medium, dat is opgenomen in de transformatie kit, tot kamertemperatuur en de LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline bij 37 ° C. Equilibreer het waterbad tot 42 ° C.
2. Dooi een flacon van chemisch component E. coli op ijs.
3. Voeg 1-5 ul van het plasmide (10 pg tot 100 ng) met de CDS in de flacon met chemisch component E. coli en meng voorzichtig. Laat de cellen niet meng door pipetteren. Na het toevoegen van plasmiden, meng door het buisje te tikken.
4. Incubeer het mengsel op ijs gedurende 30 min.
5. Heat-shock de E. coli gedurende 30 seconden bij 42 ° C in een waterbad zonder schudden.
6. Plaats de flacon op ijs gedurende 2 minuten.
7. Voeg 250 ul voorverwarmde SOC medium om de E. coli en schud de bacteriën horizontaal bij 300 rpm gedurende 1 uur bij 37 ° C in een bacteriële incubator.
8. Spread 100 ui en 150 ui van transformatiemengsel op voorverwarmd LB agarplaten, de platen om en incubeer overnacht bij 37 ° C.
9. Nadat kolonies zichtbaar, enten een enkele kolonie van elke plaat in een 15 ml kweek buis met 5 ml LB-medium met 100 ug / ml ampicilline. Incubeer ze een nacht bij 37 ° C onder schudden bij 300 rpm tot cultuur in late log of stationaire fase.
10. Voor de lange termijn opslag van getransformeerde E. coli Pipetteer 75 ul 100% glycerol in het cryovial. Voeg 225 ul van de bacteriecultuur (ingevroren voorraad zal 25% glycerol), goed mengen en opslaan van de cryovial bij -80 ° C.
11. Isoleer de plasmiden die de gewenste CDS met een plasmide zuivering kit volgens instructies van de fabrikant.
12. Bepaal de plasmideconcentratie met een spectrofotometer.
13. Aliquots van 20 pl en opgeslagen bij -20 ° C gedurende langere tijd.

_title "> 2. Versterking van plasmide Inserts en toevoegen van Poly T-tail door Polymerase Chain Reaction (PCR)

1. Opmerking: Om de DNA-matrijs voor de in vitro transcriptie (IVT), de CDS van belang hier eGFP, wordt geamplificeerd met behulp van PCR verkregen. Tegelijkertijd wordt een poly T-staart van 120 thymidinen (T) op het insert toegevoegd onder gebruikmaking van een reverse primer met een T ₁₂₀ extensie. Waarbij de aangemaakte mRNAs verkrijgen van een poly A-staart met een gedefinieerde lengte na IVT.
2. Bereid PCR mengsel zoals beschreven in tabel 1.
3. Meng de reactie mix grondig. OPMERKING: PCR product kan worden gebruikt in 4-5 IVT reacties. Om het DNA template bedrag voor IVT verhogen, kan totale volume van het PCR mengsel worden verhoogd. Verschillende PCR buisjes die elk 100 pi PCR mengsel worden gebruikt om een ​​voldoende opbrengst aan PCR product.
4. Plaats de PCR buizen in een thermocycler en laat de PCR met de PCR cycling protocol (Tabel 2).
5. Het schoonmaken van de PCR reactie met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant en elueer het DNA met 20 ul nuclease-vrij water.
6. Meet de concentratie van het DNA met een spectrofotometer. OPMERKING: De gedetecteerde DNA-concentratie is ongeveer 300 pg / ml. Derhalve dient de verwachte totale ~ 6 ug. De hoeveelheid van DNA van andere eiwitten kan afhankelijk van de lengte van CDS, hoeveelheid plasmide gebruikt voor PCR, annealing temperatuur van primers en cyclusnummer.
7. Bevries het DNA bij -20 ° C gedurende een lange tijd of zodanig gebruikt voor IVT.

3. Controle Stap: Kwaliteit van de PCR-product

1. De kwaliteit van het PCR product door gel elektroforese DNA.
2. Meng de gewenste hoeveelheid agarose met 1x TBE in een kolf. Voor een 1% agarose gel, voeg 0,5 g agarose 50 ml 1x TBE.
3. Magnetron tot de agarose is opgelost. Laat het niet koken. Zorg ervoor dat de agarose volledig in oplossing.
4. Voeg 5 gl nucleïnezuur gel vlek 50 ml agarose gel.
5. Giet de gel in een agarosegel doos, zet de kam, en wacht ongeveer 1 uur totdat de gel gestold.
6. Verwijder de kam en plaats de doos gel in een gel lade.
7. Meng 2 pl (200 ng) van 80-10,000 bp DNA ladder en 200 ng PCR-product met elk 2 pl 6x laadbuffer in een totaal volume van 12 pl.
8. Laden DNA monsters voorzichtig in de putjes van de agarose gel.
9. Met behulp van 1x TBE als running buffer, lopen de agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur.
10. Visualiseren DNA banden op een beeldvormingssysteem (figuur 2).

4. In vitro transcriptie (IVT)

1. OPMERKING: Na PCR werd het plasmide inserts worden geamplificeerd en een poly T-staart toegevoegd. Tijdens de IVT wordt genetische informatie getranscribeerd van DNA naar RNA. De gegenereerde mRNA transcript wordt gebruikt om eiwitten in cellen.
2. Reinig de werkruimte en pipetten met een RNase decontamination oplossing. Gebruik PCR schoon en steriel dual-filter pipet tips en vaak veranderen handschoenen om besmetting te minimaliseren van de reactie vermengt met RNases.
3. Bereid de NTP / cap analoog mengsel als beschreven in Tabel 3.
4. Meng de NTP / dop analoge mengsel goed door vortexen en spin down kort.
5. Monteer de IVT reactiemengsel zoals beschreven in Tabel 4.
6. Meng de IVT reactiemengsel grondig door de pipet voorzichtig op en neer. Centrifugeer de PCR-buis kort het mengsel verzamelen op de bodem van de buis.
7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur in een thermomixer.
   OPMERKING: De optimale incubatietijd afhankelijk van de lengte van de inserties en transcriptionele efficiëntie van template gegeven. Voor korte inzetstukken (<500 nt), kan een langere incubatietijd voordelig zijn. Een tijdsverloop experiment kan worden gedaan om de optimale incubatietijd voor een maximale opbrengst te bepalen. Daarom zetten IVT reacties, voor example, 1, 2, 3, 4, 6 uur en overnacht incubatie en bepalen de hoeveelheid mRNA. De kinetiek van de in vitro transcriptie voor het genereren van eGFP mRNA wordt getoond in figuur 3.
8. Om het matrijs-DNA te verwijderen, 1 gl DNase (2 U / pl) aan de IVT reactiemengsel mengen en incubeer 15 min bij 37 ° C.
9. Zuiver het reactiemengsel met een RNA zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Elueer het gemodificeerde mRNA van de spinkolom membraan tweemaal met 40 ul nuclease-vrij water. OPMERKING: De gedetecteerde RNA-concentratie is ongeveer 1500 pg / ml. Derhalve dient de verwachte totale ~ 120 ug. De hoeveelheid mRNA gesynthetiseerde andere eiwitten kan afhankelijk van de lengte van CDS en de hoeveelheid PCR product voor IVT.

5. Behandeling van gezuiverde mRNA met Antarctische Phosphatase

1. OPMERKING: De gegenereerde mRNA behandeld met fosfatase verwijderen 5 'trifosfaten, die kunnen worden herkend door RIG-I en tot immuunactivatie. Bovendien is de fosfatase behandeling voorkomt opnieuw circularization als zelfstandige ligatiereactie.
2. Voeg 9 ul van 10x reactiebuffer Antarctische fosfatase tot 79 pl gezuiverd mRNA oplossing. Voeg vervolgens 2 pl Antarctische fosfatase (5 U / ul) en het monster wordt zachtjes mengen. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 30 min.
3. Zuiver het reactiemengsel met een RNA zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Elueer het gemodificeerde mRNA van de spinkolom membraan tweemaal met 50 ul nuclease-vrij water.
4. Meet de concentratie van het gemodificeerde mRNA met een spectrofotometer. Controleer dat de verhouding van de absorptie bij 260 nm / 280 nm _(A260 / _A280) is ≥ 1,8 en de verhouding A ₂₆₀ / A ₂₃₀ is 2,0, wat aangeeft zuiverheid.
   OPMERKING: De verwachte totale opbrengst moet ongeveer 90 ug te zijn, dat is sufficient ongeveer 36 mRNA transfecties.
5. Stel de concentratie van mRNA tot 100 ng / pl door toevoeging van nuclease-vrij water.
6. Aliquot het gemodificeerde mRNA in single-aliquots vereist voor transfecties en bewaar bij -80 ° C. Vermijd meerdere bevriezen en ontdooien cycli. Goed voorbereid en opgeslagen mRNA stabiel gedurende vele jaren. Tijdens het werken, altijd de gewijzigde mRNA op ijs.

6. Controle Stap: Kwaliteit van Gesynthetiseerd Gemodificeerde mRNA

1. Controleer de kwaliteit van gemodificeerde mRNA door RNA gelelektroforese.
2. Meng de gewenste hoeveelheid agarose met 1x TBE in een kolf. Voor een 1% agarose gel, voeg 0,5 g agarose 50 ml 1x TBE.
3. Magnetron tot de agarose is opgelost. Laat het niet koken. Zorg ervoor dat de agarose volledig in oplossing.
4. Voeg 5 gl nucleïnezuur gel vlek 50 ml agarose gel.
5. Giet de gel in een agarosegel doos, zet de kam, en wacht ongeveer 1 uur totdat de gel is solidified.
6. Verwijder de kam en plaats de doos gel in een gel lade.
7. Meng 3 pl (3 ug) van 0,5-10 kb RNA Ladder en 200 ng mRNA gesynthetiseerd gemodificeerd met elk 7 ul loading buffer in een totaal volume van 10 pl. De samenstelling van de laadbuffer wordt beschreven in Tabel 5.
8. Denatureren de ladder en het mRNA monsters bij 70 ° C gedurende 10 min.
9. Laadt de ladder en de mRNA monsters op 1% agarose gel zorgvuldig.
10. Voer elektroforese bij 100 V gedurende 1 uur met 1x TBE als loopbuffer.
11. Visualiseren ladder en mRNA banden op een UV transilluminator en foto met een gel documentatiesysteem (figuur 4).

7. Voorbereiding van Cellen voor transfectie

1. Plaat 2 x10 ⁵ cellen (HEK293 cellen) per putje van 12-well plaat.
2. Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C in een cel incubator. OPMERKING: Op de dag van transfectie, moet de cellen hebben reached 80-90% samenvloeiing.

8. Het uitvoeren van mRNA Transfectie van Cellen

1. Ontdooi de gewijzigde mRNA.
2. Genereren lipoplexen voor transfectie.
3. Voeg 25 pl (2,5 ug) van gemodificeerde mRNA en 2 pl kationisch lipide transfectie reagens 473 ul Opti-MEM (minimaal essentieel medium) I gereduceerd serum medium om de transfectie mengsel voor transfectie van een putje van een 12-wells plaat genereren. Opschalen volumes volgens het aantal putten te transfecteren. Als negatieve controle, bereiden een transfectie mengsel zonder mRNA.
4. Meng de componenten voorzichtig door pipetteren. Incubeer de transfectie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 min lipoplexen voor transfectie genereren.
   OPMERKING: De transfectie mengsel bevat geen antibiotica. Dus, zorg om de steriliteit te waarborgen en tegelijkertijd de behandeling van de cellen.
5. Was de cellen met 500 gl DPBS / putje.
6. Voeg 500 ul transfectie mengsel een putje van een 12-well plaTE.
7. Incubeer de cellen gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% _CO2.
8. Zuig het transfectie mengsel en voeg 1 ml volledig celkweekmedium aan de cellen.
9. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de cel incubator.
10. Voer fluoriscentiemicroscopische analyseert met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 5). OPMERKING: Om de expressie van andere eiwitten in cellen, die worden geproduceerd door transfectie met andere mRNA dan eGFP codering mRNA te onderzoeken, kunnen de cellen worden gekweekt op dekglaasjes. Dan de transfectie kan worden uitgevoerd en de cellen worden gekleurd met geschikte antilichamen en door fluorescentiemicroscopie geanalyseerd.

9. Flowcytometrische Analyses van eGFP Expressie in cellen

1. Verwijderen celkweekmedium uit de putjes en spoel elk putje met 1 ml DPBS (zonder calcium en magnesium). Voeg 500 ul trypsine / EDTA per putje om de cellen los van het oppervlak van celkweek platen. Voeg vervolgens 500gl per putje TNS trypsine te inactiveren.
2. Centrifugeer de losgemaakte cellen gedurende 5 minuten bij 300 g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant zodat alleen de pellet. Resuspendeer de celpellet in 150 ui cel fixatie oplossing en breng de celsuspensie in een flowcytometrie buis.
3. Analyseer het percentage van eGFP expressie brengende cellen en de fluorescentie-intensiteit met Geo Mean (geometrisch gemiddelde fluorescentie-intensiteit) (Figuur 6).

10. Meting van Protein Expression Over Time

1. Voer mRNA transfectie van cellen in 3 wells van een 12-well plaat zoals beschreven in stap 8. Bovendien incubeer 3 putjes van HEK293 cellen met de transfectie mengsel zonder toevoeging van mRNA.
2. Meet de expressie van eGFP 1, 2 en 3 dagen na transfectie met de duur van eiwitexpressie (figuur 7) te evalueren.

Resultaten

Met een pcDNA 3.3 plasmide dat de CDS van eGFP, de synthese van gemodificeerde eGFP mRNA werd vastgesteld (figuur 1). Na insertie amplificatie met PCR en poly T-tailing is een duidelijke band met een lengte van ongeveer 1100 bp gedetecteerd (Figuur 2). Verhogen van de IVT tijd Augmented de opbrengst van mRNA (figuur 3). Na de IVT, werd een duidelijke band mRNA met een lengte van ongeveer 1100 bp gedetecteerd, hetgeen overeenkomt met de lengte van eGFP mRNA te produceren...

Discussie

De mRNA therapie enorm potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde, behandeling van ziekten en vaccinatie. In deze video tonen we de productie van een gestabiliseerd, gemodificeerd mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen. Met dit protocol kunnen andere gewenste mRNA gegenereerd. De in vitro synthese van gemodificeerde mRNA kan de transfectie van cellen met gewenste mRNA expressie van doeleiwitten induceren. Daardoor wordt het gewenste eiwit transiënt tot expressie gebracht onder fysiologische...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Celcultuur
DMEM, hoge glucose	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	100x
L-glutamine	PAA	M11-004	200 mM
DPBS zonder calcium en magnesium	PAA	E15-002
0,04% Trypsin / 0,03% EDTA	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Trypsin Neutralizing Solution, 0,05% trypsine-inhibitor in 0,1% BSA
HEK-293 cellen	ATCC	CRL-1573
Consumables
Tissucuur platen, 12-well	Corning	3512
Celcultuur fles (75 cm2)	Corning	430641
DNase-en RNase-vrije 1,5 ml steriele microcentrifuge buisjes	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml conische buisjes	greiner bio-one	188271
PCR schone en steriele epT.I.P.S. dualfilter pipettenpunten	Eppendorf	10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1.000 µl: 022491253
Cryovial	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
14 ml polypropyleen ronde bodem buis voor bacteriecultuur	BD Falcon	352059
Plasmidversterking en zuivering
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid	Addgene	26822
One Shot Top10 chemisch component Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Steriele water (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medium (Luria/Miller)	Carl Roth	X968.1	Los op 25 g L-1 in steriele water.
LB agar (Luria/Miller)	Carl Roth	X969.1	Los op 40 g L-1 in steriele water.
Ampicillin Ready Made Solution	Sigma Aldrich	A5354	100 mg/ml
Glycerol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
mRNA productie
HotStar HiFidelity Polymerase Kit	Qiagen	202602
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Kit	Life Technologies	AM1334
5-Methylcytidine-5´-trifosfaat	Trilink	N1014	5-Methyl-CTP
Pseudouridine-5´-trifosfaat	Trilink	N1019	Pseudo-UTP
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structuur analoog	New England Biolabs	S1411L
RiboLock RNase Inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µl
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µl (van MEGAscript T7 Kit)
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	MO289S
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
RNaseZap oplossing	Life Technologies	AM9780
Transfectie
Lipofectamine 2000 Transfectie Reagens	Invitrogen	11668-019	Cationic lipid transfectiereagens
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Invitrogen	11058-021	Verbeterd Minimum Essentieel Medium (MEM) dat een vermindering van Foetale Rundserum (FBS) suppletie mogelijk maakt
Gelelektroforese
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Gelred Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003	10.000x in water
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder	Peqlab	25-2210
Flow cytometry analyses
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x concentraat
Primer voor insertversterking en poly (T) staart PCR
Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM	Ella Biotech		5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´
Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM	Ella Biotech		5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´
Apparatuur
Cel incubator	Binder		CO2 (5%) en O2 (20%)
CASY celteller	Schärfe System
Steriele werkbank	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Bacterie incubator	Incutec
Waterbad
ScanDrop spectrofotometer	Analytic Jena
PCR thermocycler	Eppendorf
Microcentrifuge	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixer	Eppendorf