Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus

Summary

RNA-Seq-analyses worden steeds belangrijker voor het identificeren van de moleculaire grondslagen van adaptieve eigenschappen bij niet-modelorganismen. Hier wordt een protocol beschreven om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren tussen diapauze en niet-diapauze Aedes albopictus muggen, van het kweken van muggen tot RNA-sequencing en bioinformatica-analyses van RNA-Seq-gegevens.

Abstract

Fotoperiodische diapauze is een belangrijke aanpassing die individuen in staat stelt om te ontsnappen aan barre seizoensomstandigheden via een reeks fysiologische veranderingen, met name ontwikkelingsarrestatie en verminderde stofwisseling. Wereldwijd genexpressieprofiel via RNA-Seq kan belangrijke inzichten bieden in de transcriptionele mechanismen van fotoperiodische diapauze. De Aziatische tijgermug, Aedes albopictus, is een uitstekend organisme voor het bestuderen van de transcriptionele basis van diapauze vanwege zijn gemakkelijke opvoeding, gemakkelijk geïnduceerde diapauze en de beschikbare genomische bronnen. Dit manuscript presenteert een algemene experimentele workflow voor het identificeren van door diapauze geïnduceerde transcriptionele verschillen in A. albopictus. Opvoedingstechnieken, voorwaarden die nodig zijn om diapauze en niet-diapauze ontwikkeling te induceren, methoden om het percentage diapauze in een populatie te schatten, en RNA-extractie en integriteitsbeoordeling voor muggen worden gedocumenteerd. Een workflow om RNA-Seq-gegevens van Illumina-sequencers te verwerken, culmineert in een lijst van differentieel tot expressie gebrachte genen. De representatieve resultaten laten zien dat dit protocol kan worden gebruikt om effectief genen te identificeren die differentieel gereguleerd zijn op transcriptioneel niveau in A. albopictus als gevolg van fotoperiodische verschillen. Met bescheiden aanpassingen kan deze workflow gemakkelijk worden aangepast om de transcriptionele basis van diapauze of andere belangrijke levensgeschiedeniskenmerken in andere muggen te bestuderen.

Introduction

Snelle vooruitgang in next-generation sequencing (NGS) technologieën biedt spannende mogelijkheden om de moleculaire basis van een breed scala aan genetisch complexe ecologische aanpassingen te onderzoeken in een grote diversiteit aan niet-modelorganismen^1–3. Deze aanpak is uiterst krachtig omdat het een basis legt voor populatie- en functionele genoomstudies van organismen met een bijzonder interessante en/of goed beschreven ecologie of evolutionaire geschiedenis, evenals organismen van praktisch belang, zoals landbouwplagen en ziektevectoren. Daarom leiden NGS-technologieën tot snelle vooruitgang op het gebied van ecologie en hebben ze het potentieel om problemen aan te pakken zoals het begrijpen van de mechanistische basis van biologische reacties op snelle hedendaagse klimaatverandering⁴, de verspreiding van invasieve soorten⁵ en gastheer-pathogeeninteracties^6,7.

Het buitengewone potentieel van NGS-technologieën voor het beantwoorden van fundamentele en toegepaste vragen in ecologie en evolutionaire biologie is gedeeltelijk te danken aan het feit dat deze benaderingen op elk organisme kunnen worden toegepast tegen een matige kostprijs die haalbaar is voor de meeste onderzoekslaboratoria. Bovendien bieden deze benaderingen genoombrede informatie zonder de vereiste van a priori genetische bronnen zoals een microarray-chip of complete genoomsequentie. Niettemin vereist het maximaliseren van de productiviteit van NGS-experimenten zorgvuldige overweging van experimenteel ontwerp, inclusief kwesties zoals de ontwikkelingstiming en weefselspecificiteit van RNA-bemonstering. Bovendien zijn de technische vaardigheden die vereist zijn om de enorme hoeveelheden gegevens te analyseren die door deze experimenten worden geproduceerd, vaak tot enkele honderden miljoenen DNA-sequentie-lezingen, een bijzondere uitdaging geweest en hebben ze de wijdverbreide implementatie van NGS-benaderingen beperkt.

Recente RNA-Seq-onderzoeken naar de transcriptionele basis van diapause bij de invasieve en medisch belangrijke mug Aedes albopictus bieden een nuttig voorbeeld van enkele van de experimentele protocollen die kunnen worden toegepast om NGS-technologie met succes toe te passen op het bestuderen van de moleculaire basis van een complexe ecologische aanpassing in een niet-modelorganisme^8–10. A. albopictus is een zeer invasieve soort die inheems is in Azië, maar onlangs Noord-Amerika, Zuid-Amerika, Europa en Afrika heeft geïnvasieerd^11,12. Net als veel gematigde insecten overleven gematigde populaties van A. albopictus de winter door een type dormantie in te gaan dat fotoperiodische diapause wordt genoemd. In A. albopictus leidt blootstelling van poppen en volwassen vrouwtjes aan korte (herfst) daglengtes tot de productie van diapause-eieren waarin embryologische ontwikkeling is voltooid, maar de pharate-larve in het chorion van het ei een ontwikkelingsstilstand ingaat die het ei ongevoelig maakt voor het uitkomen-stimulus^15–17. Diapause-eieren zijn beter bestand tegen uitdroging^5,18 en bevatten meer totale lipiden¹⁹ dan niet-diapause-eieren. Fotoperiodische diapause in A. albopictus is dus een door de moeder gecontroleerde, adaptieve fenotypische plasticiteit die essentieel is voor het overleven van de barre omstandigheden van de winter in gematigde omgevingen. Ondanks de goed begrepen ecologische betekenis van fotoperiodische diapause bij een breed scala aan insecten^20,21, is de moleculaire basis van deze cruciale aanpassing niet goed gekenmerkt in welk insect²². In organismen zoals A. albopictus die een embryonale diapause ondergaan in het pharate-larvestadium, blijft het een bijzonder aantrekkelijke uitdaging om te begrijpen hoe het fotoperiodische signaal dat door de moeder wordt ontvangen aan het nageslacht wordt doorgegeven en blijft bestaan gedurende het verloop van de embryonale ontwikkeling om arrestatie in het pharate-larvestadium te veroorzaken.

Dit protocol beschrijft muggenkwekerij, experimenteel ontwerp en bioinformatica-analyses voor NGS-experimenten (transcriptoomsequentie) uitgevoerd om transcriptionele componenten van fotoperiodische diapause in A. albopictus te verduidelijken. Dit protocol kan worden gebruikt voor aanvullende studies van diapause in A. albopictus, kan worden aangepast om diapause in andere nauw verwante soorten te onderzoeken, zoals andere aedine muggen die eidiapause ondergaan²³, en is ook meer algemeen relevant voor het toepassen van NGS-benaderingen om de transcriptionele basis van elke complexe aanpassing in elk insect te bestuderen.

Protocol

1. opkweek van larven van Two A. albopictus Groepen naar volwassenheid

1. Stel twee fotoperiode kasten met programmeerbare verlichting bij 21 ° C voor optimale expressie diapause ¹⁶ en circa 80% relatieve vochtigheid.
   1. Programma een kast voor een 16L: 8D licht: donker cyclus (een niet-diapause inducerende LD fotoperiode). Stel de tweede kast voor een 8L: 16D licht: donker cyclus (diapause inducerende) ^13.
   2. 'Lichten aan' programma op hetzelfde moment in beide kasten te circadiane tijd tussen fotoperiodiciteit synchroniseren.
2. Bereken de hoeveelheid eieren die nodig zijn om het experiment uit te voeren. Streven naar 300-500 eieren per kooi. Ten minste drie repliceren diapause kooien en drie repliceren niet diapause kooien zijn nodig voor RNA genereren. Deze totalen op 1,800-3,000 eieren per experiment ca..
   1. Luik van de eieren door onderdompeling ei papers in ca. 500 ml gedemineraliseerd H ₂ O.
   2. Voeg ca. 1 ml voedsel slurry bestaande uit begane hondenvoer en pekelgarnalen zoals eerder beschreven ^24. Bedek container met gaas, en houden het gaas op zijn plaats met een rubberen band.
   3. Plaatsen in de LD fotoperiode kast voor ca. 24 uur.
3. Overdracht uitgekomen larven 10 x 10 x 2 cm petrischalen gevuld met ongeveer 90 ml gedeïoniseerd _H2O
   1. Onderhouden ca. 30 larven per gerecht. Transfer larven te reinigen gerechten elke 48-72 uur, bijvoorbeeld elke maandag, woensdag en vrijdag (MWF) ^24.
   2. Feed ca. 1 ml voedsel slurry bestaande uit begane hondenvoer en artemia in gedeïoniseerd water om de MWF zoals eerder beschreven ^24.
4. Opgezet 3-4 volwassen kooien voor elk fotoperiode behandeling, waarbij elke kooi bestaat uit een biologische repliceren.
   1. Van weerszijden van 9,5 L emmers, uitgesneden een 10-by-14 cm gat, en een ander gat met een diameter van 15 cm. CoVer de eerste met gaas. Knip ongeveer een voetlengte van orthopedische kous en plak ene uiteinde rond de binnenkant van de andere opening.
   2. Snijd het voeteneinde van de kous af en knoop shut - geopend wanneer toegang tot het inwendige van de kooi nodig. Voor de kooi deksel, knip alle van het interieur, waardoor alleen de velg, en vervang het interieur plastic met gaas ^24.
   3. Let op de fotoperiode, repliceren nummer, kooi startdatum, en andere informatie om het experiment met een permanent marker op de zijkant van de kooi relevant.
5. Lijn de onderkant van de volwassen kooien met natte filtreerpapier. Bevochtig het filter papier met genoeg gedeïoniseerd H ₂ O aan lokale luchtvochtigheid te verhogen in de kooi, maar vermijd stilstaand water, die ovipositie kan stimuleren op het filterpapier ^24. Controleer het filterpapier dagelijks drogen, opnieuw nat indien nodig.
6. Om voldoende eieren te produceren voor een RNA-bibliotheek, ten minste 100 wijfjes / 9.5 L cage, met niet meer dan 500 muggen per kooi.
7. Verzamel poppen MWF en plaats in een klein kopje schone H ₂ O in een dichtheid van niet meer dan 50 poppen per 25 ml H ₂ O. Breng de poppen beker aan een volwassene kooi. Plaats kooien in de respectieve fotoperiode kabinet - A. albopictus poppen zijn lichtgevoelige ^15.
8. Dagelijkse zorgen dat H ₂ O in de cups is schoon en helder, en het verwijderen van dode poppen, omdat ophoping van dode poppen massale sterfte kan veroorzaken. Verwijder H ₂ O kopjes na alle poppen te voorschijn komen.
9. Plaats biologische rozijnen op de top gaas van de kooi aan suiker voor voortgekomen volwassenen. Monitor rozijnen, en elke 3-5 dagen te veranderen hen om schimmel stapeling te voorkomen.

2. Onderhoud van volwassenen aan het Koppelen en eieren toestaan

1. Handhaaf kooien bij hoge luchtvochtigheid (ong. 80%) door langs de kooi bodem met een vochtig filtreerpapier, en toegang tot niet- beschimmelde rozijnen, zoals hierboven beschreven (sections 1.5 en 1.9).

3. Bloed van borstvoeding

1. Bereid bloed toevoer vrouwen tussen 2-6 dagen na verpopping opdat vrouwen zijn blootgesteld aan ten minste acht ondubbelzinnige korte dagen vóór het leggen van eitjes begint bijna 100% diapause eieren ^14.
2. Bereid de Hemotek Membrane Feeding systeem. Steek het voeden van eenheden in de voeding. Regel de temperatuur van elke eenheid tot 37 ° C met stelschroef. Gebruik een elektronische thermometer en sonde naar de temperatuur van de toevoereenheid tijdens de kalibratie te meten.
3. Bereid de maaltijd reservoir. Strek een vierkant van collageen voeden membraan over de opening van de maaltijd reservoir en zet hem vast met een O-ring. Trek de hoeken om rimpels te verwijderen zorgvuldig; trim de overtollige membraan met een schaar.
   OPMERKING: kan Collageen membraan niet goed werken voor alle soorten muggen, en het kan nodig zijn om verschillende soorten trachten de optimale membraan vinden als het werken met eenanders dan A. species albopictus. Parafilm werkt goed met Culex pipiens.
   1. Indien bloed wordt opgeslagen bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor gebruik.
   2. Houd het reservoir, zodat het membraan naar beneden is gericht, worden niet ondersteund, en de vulopeningen naar boven. Gebruik een pipet of een spuit aan het reservoir te vullen met ongeveer 3 ml volbloed uit kippen die natriumcitraat heeft als een anti-stollingsmiddel. Verzegelen vulopeningen met plastic pluggen.
4. Bevestig het bereid reservoir naar de feeder door te schroeven op de nok van de warmteoverdracht plaat op de bodem van de feeder. Keer de feeder en plaats het op de top van de kooi, membraan naar beneden, zodat de muggen kunnen voeden door het gaas van de kooi. Houd de feeder op de kooi ongeveer 45 min voedering maximaliseren.

4. Stimuleer Ovipositie

1. Vier tot vijf dagen na het bloedmeel, uitrusten elke kooi met een donker gekleurde 50 ml cbekleed met ongebleekt zaadontkieming papier (ei papier) of structuur niet gebleekt papier handdoek en vul de helft met gedemineraliseerd water ^9. Indien meer dan 250 muggen in een kooi, gebruikt twee kopjes.
   OPMERKING: Voor kleine kooien of single-vrouw flacons, kan "hooi infuus" in ovipositie containers ovipositie toenemen als gevolg van de geur van de microbiële flora ^25.

5. Verzamel en Store Eieren

1. Aanvangen eierverzameling binnen 4-5 dagen bloed geeft, omdat de productie van eieren piekt meestal ongeveer vijf dagen na het bloed voeden, en dan zakt de komende week.
2. Variëren eierverzameling frequentie op behoeften van het experiment. Voor algemene doeleinden, verzamelen ei papers over een MWF schema. Verwijder ei papers uit elke kooi en te vervangen door nieuw papier. Plaats onlangs verwijderd papieren in petrischaaltjes en op te slaan in SD fotoperiode kabinet om verstorende effecten van ei opslag te vermijden.
3. Laat ei papieren om opnieuw belangrijkste nat voor 2 dagen na het leggen van eitjes te serosale cuticula vorming, die ei verdroging weerstand ²⁶ verhoogt mogelijk te maken.
4. Ongeveer 48 uur na inzameling, droge eieren in de open lucht. Droog het papier zodanig dat het slap en licht vochtig aanvoelt, maar niet zo nat dat het papier is donker van H ₂ O of stimuleert het uitbroeden van de eieren.
   OPMERKING: een 6.5 "x 4" papier kan ongeveer 3,5 uur duren om te drogen. Wees voorzichtig niet te over-droog ei papers, omdat dit zal resulteren in ei verdroging ^27.
5. Extra reserve eieren van zowel LD en SD fotoperiodiciteit om diapause incidentie te beoordelen en de fotoperiodische effect (zie Meten diapause, hoofdstuk 6).
6. Voor de lange termijn opslag, houden ei papieren bij 21 ° C en ongeveer 80% vochtigheid in petrischaaltjes. Houd petrischalen in een Tupperware opslaghouder met een fles water plaatselijke vochtigheidsgraad te handhaven embryonale ontwikkeling vindt 4-5 dagen bij 21 ° C.

ove_title "> 6. Meet diapause Incidentie

1. Gebruik extra gereserveerd embryo's (zie Stimuleer Ovipositie, hoofdstuk 4) die 7-20 dagen oud aan het diapause reactie te kwantificeren zijn.
2. Noteer het aantal eieren aanwezig op elk ei papier.
3. Stimuleer eieren uit te broeden door het volledig onder te dompelen individuele ei papieren in een 90 ml petrischaal met ongeveer 80 ml ​​gedeïoniseerd H ₂ O. Voeg ongeveer 0,25 ml voedsel drijfmest.
4. Na 24 uur tally het aantal larven gearceerde eerste instar. Plaats de petrischaal op een zwarte ondergrond larven visualiseren en plaats een lichtbron aan één zijde van de schaal. Larven af ​​te stappen van de lichtbron, waardoor een duidelijke aantekening van individuele larven. Verwijder individuele larven met een pipet, terwijl het tellen te voorkomen vertellen individuele larven.
5. Plaats ei papieren in een nieuwe petrischaal en opnieuw droog. Re-hatch eieren na ~ 1 week en opnieuw tally eieren uitgebroed met behulp van de bovenstaande methode.
6. Plaats ei papieren met de resterende u n-uitgebroede eieren in nieuwe 90 ml Petrischalen met ongeveer 80 ml ​​bleeksop ^28. Zorg ervoor dat het ei papieren volledig worden ondergedompeld in het bleken oplossing en laat onder een zuurkast 's nachts om de geur van bleekwater te voorkomen.
   Opmerking bleken oplossing kan worden bewaard ~ 1 week bij 4 ° C, maar moet verder worden vers gemaakt.
7. Inspecteer de eieren met behulp van een lichtmicroscoop als het bleken zal het chorion wissen en visualisatie van bevruchte, niet-uitgekomen eieren. Wanneer het bevruchte ei wordt het ei een gebroken witte kleur met ogen die als twee kleine zwarte stippen tegenover elkaar op de dorsale zijde. Tally het aantal niet-uitgekomen, bebroede eieren ^13.
8. Bepaal diapause incidentie met de volgende formule:% diapause = geen. bebroede un-uitgebroede eieren / (no. uitgebroede eieren + no. bebroede un-uitgebroede eieren) x 100 ^13.

7. RNA-extractie uit Eieren / pharate Larven

NHOUD "> LET OP: Gebruik Trizol in een laminaire stroming kap.

1. Borstel mug eieren met de ontwikkeling van embryo's of pharate larven op verschillende tijdstippen ontwikkeling van ei papieren om glas slijpmachines met behulp van een kameel-borstel. Maal de eieren in Trizol (1 ml per 50-100 mg weefsel) tot het volledig verpulverd. Gebruik minimaal 400 eieren per bibliotheek voldoende RNA verkregen.
   1. Alternatief snap bevriezen eieren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C in microcentrifuge buisjes tot een maand voor malen in Trizol.
2. Voer RNA extractie Trizol gevolgd door isopropanol precipitatie volgens de instructies van de fabrikant.
3. Behandel de bank met RNase decontaminatie-oplossing of andere middelen om eventuele resten nucleases verwijderen om RNA degradatie te voorkomen.
   1. Behandel de geëxtraheerde RNA met DNase. Volgens de instructies van de fabrikant, incubeer de RNA monsters met DNase gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Gebruik 1 & #181, l DNase tot 10 ug RNA in 50 pl reactie. Verhoog de hoeveelheid DNase als er meer dan 10 ug RNA in één reactie.
   2. DNase inactiveren door toevoeging van 5 pi gesuspendeerd DNase inactivatie reagens. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur mengen driemaal in incubatieperiode (zacht vortexen).
   3. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1,5 min. Breng het supernatant dat het behandelde RNA monsters verse buizen voor daaropvolgende stappen.
4. Beoordeel de kwaliteit van de totale RNA monsters door fluorometrie. Stuur de monsters naar een specialiteit faciliteit met de juiste instrument voor deze taak. De faciliteit zal on-chip gelelektroforese uit te voeren om de grootte van de RNA-soorten in het monster, gevisualiseerd door fluorescerende kleurstof ingeprent in de chip te bepalen. De resultaten zullen worden geretourneerd als een elektroferogram.
   1. Bepaal de integriteit van totaal RNA monsters door de aanwezigheid of afwezigheid van afbraakproducten, zoals blijkt uit de aanwezigheid of pieken tussen het 18S en 5S ribosomale RNA pieken op het verkregen elektroferogram (Figuur 1B).

8. RNA Sequencing

1. Stuur totaal RNA monsters met een voldoende hoge kwaliteit (Figuur 1A) en hoeveelheid (meestal> 3 ug per bibliotheek) naar een commercieel sequencing centrum voor de bouw van verrijkte gepaarde-end mRNA bibliotheken en mRNA sequencing, volgende standaard protocollen.
2. Indien meer dan één rijstrook wordt gebruikt voor het sequentiëren van een enkel experiment, opgesplitst in twee afzonderlijke bibliotheken rijstroken voor sequencing te verantwoorden technische variatie tussen lanen tijdens sequencing.

9. lllumina lezen Cleaning

OPMERKING: Figuur 2 geeft een overzicht van de bioinformatica deel van dit protocol. Voor een volledige lijst van alle programma's en middelen gebruikt in de sectie bioinformatica van dit protocol, zie tabel 1. InDaarnaast Aanvullende Bestand 1 bevat command line voorbeelden voor elk van de volgende bioinformatica protocol stappen.

1. Gebruik ssaha2 ²⁹ (tabel 1) groepjes van 95% identiteit of hoger identificeren de NCBI UniVec Core database (tabel 1), A. albopictus rRNA sequentie (GenBank # L22060.1), en sequencing adapters (gedetailleerde command-line voorbeelden in Aanvullende File 1). Verwijder gelezen paren met lucifers Perl of soortgelijk scriptingtool, bijvoorbeeld door aanpassing van het ontvangen Perl-script (Supplemental bestanden 2).
2. Schoon resterende leest met de SolexaQA pakket ³⁰ (tabel 1; Aanvullende Bestand 1): trimmen regio's met een phred score equivalent van minder dan 20 met de standaardinstellingen van DynamicTrim.pl.
   1. Verwijder leest korter dan 25 bp met LengthSort.pl op zowel vooruit als achteruit tegelijk leest. Evalueer de kwaliteit van de gereinigde fastq bestanden met FastQC (Tabel 1 ) - in het bijzonder nagegaan dat de volgorde kwaliteit per-basis en de per-sequence kwaliteit scores zijn boven de 20.

10. Digitale Normalisatie

1. Voer een ronde van digitale normalisatie op het gereinigde leest met behulp van de khmer gereedschap ³¹ (tabel 1; Aanvullende File 1), in het bijzonder normalize-by-median.py (met behulp van k-mer grootte 20, een dekking cut-off van 20, en x = 1e10).
2. Als alternatief, als een machine met een hoge RAM beschikbaar is (honderden gigabytes), gebruik Trinity's normalize_by_kmer_coverage.pl script (tabel 1).

11. De Novo Transcriptome Vergadering

1. Verkrijg toegang tot een computer of computer-cluster met 256 Gb RAM en CPU 24, afhankelijk van de grootte van het samenstel.
2. Gebruik Trinity ³² (Tabel 1; Supplemental bestanden 1) aan de digitaal genormaliseerde leesverzameling in contigs monteren. Te verminderengeheugengebruik, gebruiken --min_kmer_cov 2.

12. Vergadering Evaluatie

1. Ren assemblathon_stats.pl uit de Assemblathon2 project ³³ op de Drie-eenheid aaneengesloten uitgang. Dit script voert eenvoudige berekeningen te evalueren assemblage kwaliteit relevant, zoals het aantal steigers, N50, assemblage samenstelling, en meer (tabel 1; Aanvullende File 1).

13. Annotatie van de Gemonteerd Transcriptome

1. Voeren BLASTX (tabel 1) van het geheel tegen een referentie-eiwit vast te stellen; voor muggen, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens en Aedes aegypti zijn geschikt gevonden. Specifiek, formatteer het referentie-eiwit fasta bestand voor ontploffing, gevolgd door blastx (Aanvullende File 1).

14. Kaart Leest aan de Vergadering Met behulp RSEM ³⁴ (tabel 1)

1. Een "transcript naar gen-map" file, waarbij deeerste kolom bevat de referentie-gen-id's, en de tweede kolom de aaneengesloten ID's. In een spreadsheet editor, wisselen de eerste en de tweede kolom van de BLASTX uitgang, en schrijf deze kolommen naar een .txt bestand. Gebruik de linebreak programma om regeleinden om te zetten in het resulterende .txt bestand naar Unix formaat.
2. Maak een verwijzing dataset van de transcriptome fasta bestand met de rsem-bereiden-referentie-script, mits in de RSEM pakket (Aanvullende File 1).
3. Afzonderlijk Bereken de expressie waarden voor elke bibliotheek met behulp van de rsem-berekenen-expressie opdracht, op voorwaarde dat in de RSEM pakket (Aanvullende File 1). Zoals leest, gebruik dan de gepaarde fastq bestanden als gevolg van de read-reiniging stap (stap 9.2).
   1. Als RNA uit een biologisch repliceren opgesplitst in twee rijstroken voor sequencing, zowel fastq bestanden in de expressie te brengen naar een enkel bestand te genereren.
4. Zet de expressieresultaten van elke bibliotheek een matrix gemakkelijk verwerkt door andere programs met de meegeleverde script rsem-genereren-data-matrix, die in de RSEM pakket (Aanvullende File 1).

15. differentiële expressie Analyse

1. Installeer R en Edger (tabel 1).
2. Gebruik read.delim de RSEM resultaten van stap 14.3 (Aanvullende File 1) laden. Indien nodig, rond de graven op het dichtstbijzijnde gehele getal.
   OPMERKING: De Edger gids beveelt het beperken van de dataset aan genen met hoog genoeg uitdrukking aan betekenis te detecteren.
3. Om de gegevens voor edger formatteren, het genereren van een DGEList object uit de geladen databestand (Aanvullende File 1). Dan, normaliseren van de gegevens met behulp van TMM normalisatie (Aanvullende File 1). Schat de gemeenschappelijke en tagwise dispersies van de gegevens (Aanvullende File 1).
4. Identificeren van differentieel tot expressie genen met een Benjamini-Hochberg gecorrigeerde p-waarde <0,05 (Aanvullende File 1). Plot de verdeling van log-voudige-verandering versus overvloed (Aanvullende File 1).

Results

Fluorometrie twee representatieve RNA monsters vertoonde twee banden bij ongeveer 2000 nt (Figuur 1A, B). Het insect 28S ribosomaal RNA uit twee polynucleotide ketens bijeengehouden door waterstofbindingen, die gemakkelijk worden verstoord door korte verhitting of middelen die waterstofbindingen ³⁵ verstoren. De resulterende twee componenten ongeveer even groot als de 18S ribosomale RNA. De tweede RNA-monster toonde een hoge mate van afbraak (Figuur 1B).

Discussion

Dit protocol biedt methoden om differentieel tot expressie genen wijten ontdekken geïnduceerde diapause in A. photoperiodically albopictus. Het protocol is van belang omdat het een unieke combinatie van mosquito opfok en bio-informatica technieken om alle experimentele aspecten van een moleculaire fysiologie programma toegankelijk is voor beginnende gebruikers te maken - in het bijzonder voor degenen die zich richt op de fotoperiodische diapause respons. Bestaande methoden, voor zover wij weten, niet z...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator - Model 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Controlled environment room	Thermax Scientific	N/A	Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb	Philips	392183	4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Filter Paper 20.5 cm	Fisher	09-803-6J
9.5 L Bucket	Plastican	Bway Products	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings	Albahealth	23650-040	product no. 081420
Organic Raisins	Newman's Own	UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown)	Fisher Scientific	03-007-52	The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels	Seventh Generation	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder	Corning Incorporated	7727-2	These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent	Sigma Aldrich	T9424	Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder	Hemotek	5W1	This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate	Pel-Freez Biologicals	33130-1	The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.