De traanklier (LG) is een vertakking orgaan dat de waterige componenten van tranen nodig produceert voor het behoud van de visie en de gezondheid van het oog. Hier beschrijven we muizen LG dissectie en ex vivo cultuur technieken te ontcijferen signaalwegen betrokken bij LG ontwikkeling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het manipuleren van de muizen traanklier
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De traanklier (LG) scheidt waterige tranen noodzakelijk voor het behoud van de structuur en functie van het hoornvlies, een transparante weefsel essentieel zicht. In de menselijke bevindt één LG in de baan boven het laterale uiteinde van elk oog leveren tranen aan het oogoppervlak via 3-5 kanalen. De muis heeft drie paar grote oculaire klieren, de meest bestudeerde waarvan de exorbital traanklier (LG) gelegen voorste en ventraal van het oor. Vergelijkbaar met andere glandulaire organen, LG ontstaat door het proces van epitheliale vertakking morfogenese waarin één epitheliale knop binnen een verkorte mesenchym ondergaat meerdere rondes van knop en kanaal vorming een ingewikkeld netwerk van onderling verbonden secretoire acini en kanalen vormen. Dit ingewikkelde proces is goed gedocumenteerd in vele andere epitheliale organen zoals de pancreas en speekselklieren. Echter, heeft de LG veel minder bestudeerde geweest en de mechanismen die de morfogenese slecht onderstond. We vermoeden dat deze ondervertegenwoordiging als modelsysteem is een gevolg van de moeilijkheden die gepaard gaan met het vinden, ontleden en het kweken van de LG. Zo beschrijven we hier dissectie technieken voor het oogsten embryonale en postnatale LG en werkwijzen voor het ex vivo kweken van het weefsel.
Inleiding
De traanklier (LG) is verantwoordelijk voor waterige traan secretie van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en de gezondheid, het onderhoud en de bescherming van de cellen van het oogoppervlak. LG disfunctie leidt tot een van de meest voorkomende en invaliderende oogaandoeningen: waterige deficiënte droge ogen ziekte, die wordt gekenmerkt door oculaire, lichtgevoeligheid en verminderd zicht 1. In de mens woont de LG in de baan boven de laterale einde van het oog, waar 3-5 afvoergangen aanbetaling tranen op het oogoppervlak. De muis heeft drie paar grote oculaire klieren, de meest bestudeerde waarvan de traanklier (LG) gelegen voorste en ventraal van ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke werk werd uitgevoerd onder strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Californië, San Francisco.
1. muis embryonale traanklieren (LG): Oogsten en Microdissection
- Volgende procedures door de Institutional Dieren voor Wetenschappelijk Onderzoek ethische commissie goedgekeurd, euthanaseren getimed zwanger CD-1 (of transgene) vrouwen met de stijgende CO 2 inademing, gevolgd door bevestiging doo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese. Helderveld beelden van embryonale LGs ontleed bij e14, e15, e16, e17, en P2 illustreren dit evenement.
Figuur 1. De LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese. Helderveld beelden van embryonale LGs vers ontleed bij e14, e15, e16.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De veelzijdigheid aan cultuur en manipuleren van de LG ex vivo biedt aanzienlijke voordelen voor het bestuderen van de ontwikkeling ervan. Dit omvat de snelheid waarmee de onderzoeker kan hypothesen en de veelheid van storingen die kunnen worden uitgevoerd om te beoordelen hoe epitheliale, neuronale, endotheliale cellen en mesencyhmal samenwerken om het orgaan te vormen testen. Er zijn echter een aantal restricties bij gebruik van dit model. Eerst op grond van de isolatie de klier is niet langer verbonden met d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag verstrekt door de UCSF Resource Allocation Program financiering erkennen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 zonder HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumine-oplossing uit bovien serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% oplossing | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Verdund tot 4% in 1x PBS |
| Fosfaatbuffer oplossing 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Fosfaatbuffer oplossing 1x | Bereid uit 10x stock | ||
| holo-Transferrine bovien | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stockoplossing in water. Bevries eenmalige gebruiksaliquots bij -20 °C. Voeg toe aan DMEM/F12 media tot een eindconcentratie van 50 μg/ml. |
| L-ascorbinezuur (Vitamine C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stockoplossing in water. Bevries eenmalige gebruiksaliquots bij -20 °C. Voeg toe aan DMEM/F12 media tot een eindconcentratie van 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm weefselkweekschalen behandeld | 130182 | Thermo Scientific | Niet behandelde weefselkweekschalen kunnen ook worden gebruikt. |
| Stereo Microscoop met onderverlichting | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Elke stereo dissectiemicroscoop kan worden gebruikt die een basis met doorgelaten licht heeft. |
| Onderverlichtingsbasis voor Stereo Microscoop | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm weefselkweekschalen behandeld | 353001 | Corning | Niet behandelde weefselkweekschalen kunnen ook worden gebruikt. |
| 50 mm ongecoate glazen bodemschalen | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Fluorescentiemicroscoop breedveld | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Elke fluorescentiemicroscoop (rechtopstaand, omgekeerd of stereo dissectiemicroscoop) kan worden gebruikt om GFP-expressie bij lage vergroting te bewaken met een aangesloten digitale camera. |
| Confocale Microscoop | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocale microscopie is noodzakelijk om gedetailleerde celstructuren te zien. Elke confocale microscoop kan worden gebruikt. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11,2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fijne uiteinden zijn vereist voor het verwijderen van mesenchym uit epitheel. Tungsten naalden kunnen ook worden gebruikt. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideaal voor het oogsten van klieren uit embryo's. |
| Herbruikbare plastic chirurgische meshandvatten, stijl nr. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Roestvrijstalen steriele chirurgische mesjes, nr. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Totaal RNA Isolatie Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Cultuur Matrix Laminine I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock verdund 1:1 met DMEM/F12 |
| Getijdde zwangere Crl:CD1(ICR) muizen | Charles River Labs | Embryo's worden geoogst op dag 14 (met de dag van het ontdekken van de plug als dag 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0,1 μm poriegrootte, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Getijdde zwangere Pax6-Cre, GFP muizen | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optionele muizen om te leren hoe de LG te lokaliseren. |
Referenties
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
