De traanklier (LG) is een vertakking orgaan dat de waterige componenten van tranen nodig produceert voor het behoud van de visie en de gezondheid van het oog. Hier beschrijven we muizen LG dissectie en ex vivo cultuur technieken te ontcijferen signaalwegen betrokken bij LG ontwikkeling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het manipuleren van de muizen traanklier
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De traanklier (LG) scheidt waterige tranen noodzakelijk voor het behoud van de structuur en functie van het hoornvlies, een transparante weefsel essentieel zicht. In de menselijke bevindt één LG in de baan boven het laterale uiteinde van elk oog leveren tranen aan het oogoppervlak via 3-5 kanalen. De muis heeft drie paar grote oculaire klieren, de meest bestudeerde waarvan de exorbital traanklier (LG) gelegen voorste en ventraal van het oor. Vergelijkbaar met andere glandulaire organen, LG ontstaat door het proces van epitheliale vertakking morfogenese waarin één epitheliale knop binnen een verkorte mesenchym ondergaat meerdere rondes van knop en kanaal vorming een ingewikkeld netwerk van onderling verbonden secretoire acini en kanalen vormen. Dit ingewikkelde proces is goed gedocumenteerd in vele andere epitheliale organen zoals de pancreas en speekselklieren. Echter, heeft de LG veel minder bestudeerde geweest en de mechanismen die de morfogenese slecht onderstond. We vermoeden dat deze ondervertegenwoordiging als modelsysteem is een gevolg van de moeilijkheden die gepaard gaan met het vinden, ontleden en het kweken van de LG. Zo beschrijven we hier dissectie technieken voor het oogsten embryonale en postnatale LG en werkwijzen voor het ex vivo kweken van het weefsel.
Inleiding
De traanklier (LG) is verantwoordelijk voor waterige traan secretie van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en de gezondheid, het onderhoud en de bescherming van de cellen van het oogoppervlak. LG disfunctie leidt tot een van de meest voorkomende en invaliderende oogaandoeningen: waterige deficiënte droge ogen ziekte, die wordt gekenmerkt door oculaire, lichtgevoeligheid en verminderd zicht 1. In de mens woont de LG in de baan boven de laterale einde van het oog, waar 3-5 afvoergangen aanbetaling tranen op het oogoppervlak. De muis heeft drie paar grote oculaire klieren, de meest bestudeerde waarvan de traanklier (LG) gelegen voorste en ventraal van het oor (exorbital) met scheuren die naar het oog via één kanaal excretie. Net als bij andere glandulaire organen, de LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese waarin een enkel epitheliale knop binnen een verkorte mesenchym ondergaat meerdere rondes van bud en duct formatie voorm een ingewikkeld netwerk van onderling verbonden secretoire acini en leidingen (figuur 1) 2. Tijdens de ontwikkeling epitheel wordt gevasculariseerd en zwaar geïnnerveerd door parasympathische zenuwen van de pterygopalatine ganglion en in mindere mate van sympathische zenuwen van de superieure cervicale ganglion 3. Interacties tussen deze celtypen namelijk neuronale, epitheliale, endotheliale en mesenchymale cellen zijn essentieel voor de werking en het onderhoud van de volwassen weefsel. De onderliggende moleculaire mechanismen coördinatie LG ontwikkeling en regeneratie en hoe soort inter-cel leidt deze processen blijft onduidelijk.
De komst van embryonale ex vivo cultuur technieken heeft het mogelijk gemaakt de identificatie van de ontwikkeling en regeneratie van trajecten in meerdere vertakkingen organen 4. Kweken ex vivo geeft de onderzoeker de mogelijkheid om het orgaan te manipuleren (menische, genetische of chemische) onder gedefinieerde condities alsmede orgaanontwikkeling en cel-cel interacties te karakteriseren in real time. De exorbital LG van de muis is zeer vatbaar voor deze techniek en recente studies hebben gedefinieerd signaleringssystemen dat zijn ontwikkeling 2,5 reguleren. Ondanks de noodzaak van moleculaire signalen onderbouwing LG ontwikkeling en regeneratie begrijpen is nog steeds weinig bestudeerd waarschijnlijk door de technische problemen bij het isoleren van het orgaan. In dit artikel beschrijven we hoe te isoleren en uit te voeren ex vivo cultuur van de embryonale muizen LG om ontwikkelingsprogramma's te definiëren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke werk werd uitgevoerd onder strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Californië, San Francisco.
1. muis embryonale traanklieren (LG): Oogsten en Microdissection
- Volgende procedures door de Institutional Dieren voor Wetenschappelijk Onderzoek ethische commissie goedgekeurd, euthanaseren getimed zwanger CD-1 (of transgene) vrouwen met de stijgende CO 2 inademing, gevolgd door bevestiging door cervicale dislocatie te oogsten embryo's op de juiste embryonale dag. Wijzen de dag van vaginale plug ontdekking e0.
Opmerking: traanklieren (LGS) kunnen worden geoogst uit de e14 enkele knopstadium vanaf. Echter, E16 (5-10 knoppen) embryo's geven de meest consistente resultaten voor ex vivo cultuur. - Steriliseer de ventral zijkant van de muis met behulp van 70% ethanol. Knijp de huid en maken een incisie op de middenlijn met steriele chirurgische schaar; snijden door de huid en het buikvlies de buikholte bloot. Verwijder de 2 baarmoederhoorns door snijden langs de mesometrium bovenaan elke baarmoeder hoorn en plaats in koude PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) of DMEM F12 medium aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine.
- Met behulp van een tang (# 5), verwijder embryo's uit het vruchtwater zakken en plaats in een tweede steriele petrischaal met koude PBS. Wees voorzichtig om de ogen of het hoofd niet aanraken.
- Plaats embryo op een dissectie microscoop met een transillumination basis. 1.7 - Als het embryo is stappen 1.5 uit te voeren. Als embryo's> e17, deze stappen kan nuttig zijn, maar zijn niet essentieel, dus ga verder met stap 1.8.
- Scheidt de kop van de romp net onder de onderkaak (stap 1, figuur 2) usinga steriel scalpel (# 10 blade). Draai het hoofd zodat de onderkaak is nu op het ontleden plaat. Tang om de kop en een scalpel ongeveer ¼ van de dorsale zijde van de hersenen (stap 2, 1 st gesneden, figuur 2) verwijderen stabiliseren - dit is vooral belangrijk wanneer kraakbeen verstijft rond e15.
- Richt het hoofd zodat de scalpel kan doorboren de neus tussen de ogen. Voeg een snede door het midden van de kop, zodat de ogen nu afzonderlijke helften (stap 2, 2e gesneden, figuur 2).
- Met behulp van twee # 5 tang, neem de ene helft van de kop en verwijder de overtollige weefsel (zie stap 3, figuur 2). Zorg ervoor dat u het hoofd te oriënteren, zodat de LG (in de onderste achterste hoek van het oog) niet verloren gaat in deze verwijdering proces. Verwijder overtollig cerebrale, kraakbeen, en nasale weefsel rondom en onder het oog. Omdat de klier is nauwelijks zichtbaar op dit moment zorgen oog goed georiënteerd na overtollige weefsel verwijdering to voorkomen dat de locatie van de LG.
- Pak de huid tegen de achterste, onderste hoek van het oog met beide pincet voorzichtig. Verwijder de huid door het voorzichtig geopend te trekken met de tang om de LG bloot. Gebruik extra verlichting boven en onder het weefsel te visualiseren LG.
Opmerking: De LG, onderscheiden door zijn uiterlijk als een knop op een kanaal in een donkere, gecondenseerde mesenchym, zichtbaar zijn op dit punt. - Beginnen zorgvuldig te ontleden de LG en bijbehorende mesenchym (zie diagram en afbeeldingen) uit de buurt van het omringende weefsel met behulp van een tang, zorg dat u de LG of daarmee samenhangende duct niet te grijpen. Zodra de klier vrij is van het omringende weefsel, verwijder voorzichtig de gehele klier door grijpen de epithelia rondom het oog bij de basis van de LG kanaal. Zorg ervoor dat de omringende mesenchym het epitheel, die kan worden waargenomen als een gecondenseerd mesenchym waarin het epitheel invaginates behouden.
OPMERKING: Sommige extra verwijdering van tissue (elke kleine botfragmenten, spieren en bindweefsel), kan het nodig zijn om te voorkomen dat de signalering / groeifactoren uit omliggende weefsel. - Voor cultuur, oogst 4-5 klieren en bijbehorende mesenchym per plaat (LGS zijn bedekt direct na dissectie); verzamelen minimaal 14 klieren per 100 pl RNA lysisbuffer voor RT-PCR 6.
2. Bereid Platen voor Ex vivo Cultuur
Deze procedure is gebaseerd op die gebruikt voor de ontwikkeling speekselklier 7,8.
- Voeg 200 ul DMEM F12 (gesupplementeerd met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) kweekmedium met 50 ug / ml ascorbinezuur en 50 ug / ml holo-transferrine een glazen bodem 50 mm diameter microwell schotel 7.
Opmerking: DMEM F12 werd gekozen als we eerder vond het morfogenese in de embryonale speekselklier te maximaliseren. - Float a 13 mm polycarbonate membraan filter met 0,1 urn poriën bovenop media.
- Optionele stap: Verdun 3-D laminine 1: 1 met DMEM / F12 tot een uiteindelijke concentratie van 3 mg / ml te maken (gebruik 200 ul pipet zachtjes mengen, centrifugeer gedurende 1 minuut als belletjes). Voeg 15 ul van de verdunde 3-D laminine te filteren.
Opmerking: Deze verdunning werd gevonden optimaal voor het handhaven van LG in de 3D toestand zonder dat epitheliale vertakking te zijn. Het is echter niet essentieel voor de kweek van LG. - Plaats 4-5 LG op filter of in laminin. Cultuur LGS ex vivo voor 24 - 48 uur (figuur 3) of fixeren met 4% PFA gedurende 20 min voor verdere analyse door qPCR of immunokleuring (figuur 4). Voor qPCR analyse van embryonale klierweefsel, verwijzen wij u naar Rebustini et al., 2011. Voor immunofluorescent analyse van embryonale klierweefsels verwijzen wij u naar de volgende citaten: Hoffman et al, (2002) en Steinberg e.t al., (2005).
3. Mouse Postnatale en Adult traanklieren (LG): Dissection
- Euthanaseren de postnatale muis volgens de normen geschikte dier ethische commissie. Voor postnatale pups dag 8 of jonger, euthanaseren door doorsnijden van het hoofd met een steriele schaar. Voor postnatale dag 8 of ouder, spuit bont met 70% ethanol.
- Om de LG lokaliseren, leg de muis zijkant onder een dissectie microscoop met verlichting van boven. Opmerking: De postnatale en volwassen LG worden begrensd door de halsslagader, de kauwspieren en de dermis (zie figuur 5).
- Met behulp van kleine dissectie schaar, maak kleine incisie in de epidermis zijdelings waar de LG moet worden geplaatst.
- Met behulp van een tang, trek open de epidermis in de richting van het oor naar de LG bloot.
- Gebruik een tang om voorzichtig los LG van het omringende weefsel.
- Zodra de LG is vrijgelaten uit het omringende weefsel, verwijder voorzichtig de LG door het kanaal,door grijpen wanneer het kanaal en de epithelia rond het oog aansluiten (figuur 1).
- Plaats LGS in RNA lysebuffer voor RT-PCR, of fix met 4% PFA gedurende 20 min voor immunostaining.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese. Helderveld beelden van embryonale LGs ontleed bij e14, e15, e16, e17, en P2 illustreren dit evenement.
Figuur 1. De LG ontwikkelt door het proces van epitheliale vertakking morfogenese. Helderveld beelden van embryonale LGs vers ontleed bij e14, e15, e16...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De veelzijdigheid aan cultuur en manipuleren van de LG ex vivo biedt aanzienlijke voordelen voor het bestuderen van de ontwikkeling ervan. Dit omvat de snelheid waarmee de onderzoeker kan hypothesen en de veelheid van storingen die kunnen worden uitgevoerd om te beoordelen hoe epitheliale, neuronale, endotheliale cellen en mesencyhmal samenwerken om het orgaan te vormen testen. Er zijn echter een aantal restricties bij gebruik van dit model. Eerst op grond van de isolatie de klier is niet langer verbonden met d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag verstrekt door de UCSF Resource Allocation Program financiering erkennen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 zonder HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumine-oplossing uit bovien serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% oplossing | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Verdund tot 4% in 1x PBS |
| Fosfaatbuffer oplossing 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Fosfaatbuffer oplossing 1x | Bereid uit 10x stock | ||
| holo-Transferrine bovien | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stockoplossing in water. Bevries eenmalige gebruiksaliquots bij -20 °C. Voeg toe aan DMEM/F12 media tot een eindconcentratie van 50 μg/ml. |
| L-ascorbinezuur (Vitamine C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stockoplossing in water. Bevries eenmalige gebruiksaliquots bij -20 °C. Voeg toe aan DMEM/F12 media tot een eindconcentratie van 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm weefselkweekschalen behandeld | 130182 | Thermo Scientific | Niet behandelde weefselkweekschalen kunnen ook worden gebruikt. |
| Stereo Microscoop met onderverlichting | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Elke stereo dissectiemicroscoop kan worden gebruikt die een basis met doorgelaten licht heeft. |
| Onderverlichtingsbasis voor Stereo Microscoop | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm weefselkweekschalen behandeld | 353001 | Corning | Niet behandelde weefselkweekschalen kunnen ook worden gebruikt. |
| 50 mm ongecoate glazen bodemschalen | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Fluorescentiemicroscoop breedveld | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Elke fluorescentiemicroscoop (rechtopstaand, omgekeerd of stereo dissectiemicroscoop) kan worden gebruikt om GFP-expressie bij lage vergroting te bewaken met een aangesloten digitale camera. |
| Confocale Microscoop | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocale microscopie is noodzakelijk om gedetailleerde celstructuren te zien. Elke confocale microscoop kan worden gebruikt. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11,2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fijne uiteinden zijn vereist voor het verwijderen van mesenchym uit epitheel. Tungsten naalden kunnen ook worden gebruikt. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideaal voor het oogsten van klieren uit embryo's. |
| Herbruikbare plastic chirurgische meshandvatten, stijl nr. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Roestvrijstalen steriele chirurgische mesjes, nr. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Totaal RNA Isolatie Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Cultuur Matrix Laminine I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock verdund 1:1 met DMEM/F12 |
| Getijdde zwangere Crl:CD1(ICR) muizen | Charles River Labs | Embryo's worden geoogst op dag 14 (met de dag van het ontdekken van de plug als dag 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0,1 μm poriegrootte, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Getijdde zwangere Pax6-Cre, GFP muizen | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optionele muizen om te leren hoe de LG te lokaliseren. |
Referenties
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development. Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).
- Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).
- Nigam, S. K. Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs. Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).
- Qu, X., et al. Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development. Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).
- Rebustini, I. T., et al. MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis. Developmental cell. 17, 482-493 (2009).
- Hoffman, M. P., et al. Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms. Development. 129, 24-5778 (2002).
- Steinberg, Z., et al. FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis. Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).
- Magenheim, J., et al. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).
- Jaskoll, T., et al. FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis. BMC developmental biology. 5, 11(2005).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494(2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
