Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen

Summary

We presenteren een methode om een fysiologisch elektrisch veld toe te passen op migrerende, geïmmortaliseerde prostaatcellen in een op maat gemaakte galvanotaxiekamer. Met behulp van deze methode, tonen we aan dat 2 lijnen van niet-tumorigene prostaatcellen verschillende graden van migratiedirectionaliteit in het veld vertonen.

Abstract

De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, zoals het leiding celmigratie in embryonale ontwikkeling, neuronale uitgroei en epitheliale wondgenezing. Het toepassen van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen in vitro induceert directionele celmigratie of galvanotaxis. De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren gemodificeerd met op maat gemaakte poly (vinylchloride) (PVC) Chambers, glas, platina elektroden en het gebruik van een gemotoriseerde podium waarop de cellen worden afgebeeld. De PVC-kamers en platina elektroden vertonen een lage cytotoxiciteit en zijn betaalbaar en herbruikbaar. Het glasoppervlak en het gemotoriseerde microscooptafel verbeteren beeldkwaliteit en laat mogelijke wijzigingen op het glasoppervlak en behandelingen aan de cellen. We filmden de galvanotaxis van twee niet-tumorigene, SV40 vereeuwigd prostaat cellijnen, PRN-1-1 en PNT2. Deze twee cellijnen vertonen gelijkaardige migratie snelheden en beide migreren naarde kathode, maar ze vertonen een verschillende mate van gerichtheid in galvanotaxis. De verkregen via dit protocol resultaten suggereren dat de PRN-1-1 en de PNT2 cellijnen verschillende intrinsieke eigenschappen die hun directionele trekkende reacties regeren kan hebben.

Introduction

Endogene elektrische velden worden gedetecteerd in verschillende weefsels, zoals huid ^{1, 32, 33} en hersenen ^2. De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, waaronder aansturen embryo ontwikkeling ^{3, 4,} geleiden de uitgroei van neuronale uitlopers ^{5, 6} en bevorderen epitheel en corneale wonden ^{1, 7.} In vitro toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen bootst de fysiologische elektrisch veld en induceert celmigratie directionele of galvanotaxis. Galvanotaxis is onderzocht in fibroblasten ^8, vissen keratinocyten ^9, menselijk epitheel en hoornvlies keratinocyten ^10-12, lymfocyten ¹³ neuroblasts ² en neuronale progenitorcellen ^14. Bij blootstelling aan het aangelegde veld, de meeste onderzochte cellen migreren directioneel naar de kathodische (-) pool. Maar verschillende kankercellen, waaronder zeer metastatischehumane borstkankercellen en de humane prostaatkanker cellijn PC-3M, naar de anodische (+) pool ^{15, 16.} verschillende mechanismen voorgesteld galvanotaxis bemiddelen of het vermogen van de cellen om het elektrisch veld detecteren, inclusief activatie verklaren van EGF receptoren ^12, de epitheliale natriumkanaal ¹⁷ PI3K en PTEN ¹⁸ en vrijgave van calciumionen ^{15, 19.} Het mechanisme is nog niet volledig begrepen en het is mogelijk dat meerdere signaalroutes betrokken bij galvanotaxis.

De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren nuttig is de gerichte migratie van hechtende, beweeglijke cellen te karakteriseren, op individuele celmigratie ^{10, 12, 17} of migratie van een vel van confluente cellen ^{18, 20.} Deze techniek is aangepast van toezicht Peng en Jaffe ^21, en ​​Nishimura et al. ¹⁰ met op maat gemaakte, heldere PVC kamers, met afneembare coverslips zorgen voor gemakkelijke cel ophalen na galvanotaxis voor secundaire analyse, zoals immuno-fluorescentie beeldvorming. Het glasoppervlak van de galvanotaxis kamers is optisch-compatibel, die het filmen bij een hoge vergrotingsfactor en met fluorescent-gelabelde cellen mogelijk maakt. Ook kan proefopzet met modificatie van het glasoppervlak, zoals het veranderen van de oppervlaktelaag of kosten. Afstandhouders van No. 1 dekglaasje worden in de kamers om de stroom over de cellen te minimaliseren; daarom jouleverwarming, dat evenredig is met het kwadraat van de stroom, zou de cellen oververhitten tijdens het experiment. De verbindende agar bruggen voorkomen direct contact van de elektroden met de cellen en verandering van het medium pH of de ionenconcentratie in galvanotaxis voorkomen.

Twee niet-tumorigene humane prostaat cellijnen onderzocht op hun galvanotaxis reactie in deze studie. De PRN-1-1 ²² en PNT2 ²³ zijn beide SV40-geïmmortaliseerde, growth factor-afhankelijke cellijnen die de epitheliale merkers cytokeratine 5, 8, 18 en 19 met weinig of geen expressie van het prostaat-specifiek antigeen (PSA). Beide cellijnen houden de veelhoekige morfologie van normale epitheelcellen, maar chromosomale abnormaliteit werd waargenomen bij karyotypering ^{22, 24.} Hoewel PRN-1-1 en PNT2 hebben dezelfde gedrag bij de meeste experimenten, ze vertonen verschillen in de vorming van acinaire structuur en galvanotaxis. Bij een 3-D matrix Matrigel, de PRN-1-1 cellen vormen holle acinaire structuren lumen lijken de normale prostaat weefsel ^25. De PNT2 cellen vormen vaste bolletjes zonder lumen of gepolariseerde epitheel ^26. De PRN-1-1 cellen ook een hogere galvanotactic respons dan de PNT2 in de huidige studie tonen. De correlatie tussen de vorming van acinar structuur en galvanotaxis in PRNS-1-1 suggereert dat de galvanotactic signalen een rol kunnen spelen bij het organiseren van de prostate klier bewegingen weefsel in reactie op endogene elektrische velden, en verschaft verder kenmerken onderscheid tussen deze 2 cellijnen.

Protocol

1. Het kweken Prostaat Cellen

1. Cultuur de PRN-1-1 en PNT2 prostaatcellen op 100 mm kweekschalen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica Antimycoticum bij 37 ° C met 5% _CO2. Vernieuw de kweekmedium elke dag tot de cellen te bereiken 80% samenvloeiing van de galvanotaxis experimenten.

2. Montage galvanotaxis Chambers

1. Assembleren bodem Chambers
   1. Veeg een plastic galvanotaxis kamer met 2-propanol. Breng de zeewaardig siliconen afdichting rond de cirkelvormige openingen aan de onderzijde van een kamer met een injectiespuit en bevestig een groot dekglaasje (figuur 1). Gebruik de achterkant van een katoenen applicator naar beneden te duwen het dekglaasje en veeg de overtollige lijm met wattenstaafjes. De cirkelvormige openingen maken het medium en elektrische stroom over de cellen tussen de twee binnenste medium reservoirs.
   2. Snijd een kleine dekglaasje tot 6 mm x 2 maken5 mm spacers met een diamanten punt marker.
   3. Flip de kamer. Breng 2 lijnen van silicium lijm met een spuit en / of een metalen spatel tot een 10 mm x 25 mm kanaals oppervlakte celhechting tussen 2 cirkelvormige openingen aan de onderzijde glas creëren. Lijm 2 stukjes glas afstandhouder tussen de 2 ronde openingen. Gebruik de achterkant van de katoen applicators naar beneden te duwen de afstandhouders en veeg de overtollige lijm met wattenstaafjes en / of tandenstokers.
   4. Droog de kamer gedurende 24 uur totdat het silicium lijm is uitgehard. Week de kamer in gedestilleerd water 's nachts aan het azijnzuur residu van de lijm te verwijderen. Droog de kamer voor onmiddellijk gebruik, of bewaar de kamer voor later gebruik in een schone container.
      
      Figuur 1: Vergadering van de bodem galvanotaxis kamer. A) Een groot dekglaasje wordt naar de bodem van een schone kamer. B bijgevoegd) Two stukjes glas afstandhouders gelijmd tussen de 2 cirkelvormige openingen 10 mm x 25 mm kanaal cellen hechten creëren.
2. Zaaien cellen op de galvanotaxis kamers
   1. Bereid de eisen aantal galvanotaxis kamers nodig zijn voor het experiment. Elke cellijn of behandeling vereist een enkele galvanotaxis kamer. Veeg de galvanotaxis kamers met 2-propanol. Was de kamers met steriele PBS 3 keer en controleer de vloeistofstroom tussen de 2 ronde openingen in de kamers.
   2. Sluit de kamers in steriele celcultuurschalen en laten equilibreren bij 37 ° C gedurende 15 min. Maak de prostaatcellen uit hun kweekschaal met 5 ml 0,25% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 min. Neutraliseer de trypsine-EDTA met 5 ml 10% FBS in PBS.
   3. Breng de cellen tot 15 ml en centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 200 xg, 37 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium.
   4. Neem 20 μl celoplossing te laden op een telkamer en bereken het aantal cellen. Pas de cel concentratie tot 8 x 10 ⁴ cellen / ml kweekmedium.
   5. Neem de galvanotaxis kamers uit de 37 ° C incubator. Zaad 350 pi van de celsuspensie op elke kamer.
   6. Incubeer de cellen in de kamers overnacht in de kweekschaal met natte Kimwipe of in een vochtige kamer in de incubator bij 37 ° C met 5% _CO2.

Figuur 2:. Zaaien cellen de kamer De onderste kamer wordt gedroogd en gereinigd A) prostaat cellen getrypsiniseerd, geteld en overgebracht naar de kamer en overnacht geïncubeerd B) Een top dekglaasje wordt bevestigd aan de kamer verzegelen voor filmen...

3. Eenssembling de top kamers
   1. Monteer de bovenste kamer voorafgaand aan het filmen. De microscoop is alleen geschikt voor de beeldvorming van een enkele galvanotaxis kamer in een keer. Warming-up 10 ml kweekmedium bij 37 ° C voor elke galvanotaxis kamer. Transfer een galvanotaxis kamer van de incubators tot een temperatuur van 37 ° C opwarming plaat.
   2. Spoel de cellen met kweekmedium om de losse cellen te verwijderen. Verlaat 400 ul van medium in de kamer. Gebruik een spuit te hoog vacuüm vet aan op de top van beide glazen spacers.
   3. Voeg een kleine dekglaasje aan de kamer af te dichten. Druk licht het dekglaasje met de achterkant van een katoenen applicator. Veeg het overtollige medium met wattenstaafjes.
   4. Droog het glasoppervlak en de toepassing van hoge vacuüm vet om de kloof tussen het dekglaasje en de kamer af te dichten. Gebruik een metalen spatel om het vet te verspreiden. Voeg 4 ml van het kweekmedium aan de binnenste reservoirs en controleer de vloeistofstroom tussen de reservoirs.
4. Maak agarbruggen
   1. Snijd een paar van 2 cm lang PVC-buis (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall), spiegelen en plaats ze in een bekerglas van 100 ml.
   2. Meet 200 mg Bacto-Agar en voeg deze in een kolf van 50 ml met 10 ml kweekmedium tot 2% agar gel maken. Magnetron gedurende 30 sec. Laad de agar-gel om de plastic buis met een transfer pipet. Laat de agar bruggen bij kamertemperatuur gedurende 10 min aan de agar stollen.
   3. Voeg 2 ml kweekmedium naar de buitenste reservoirs van de galvanotaxis kamer. Plaats de agar bruggen naar de binnenste en buitenste medium reservoirs die het stroom.

Figuur 3:. Het filmen van de cellen op de kamer Een diagram met de eindassemblage van de galvanotaxis kamer te tonen. De kamer is volledig afgesloten met een hoog vacuüm vet. Medium wordt toegevoegd to vul de reservoirs, en twee agar bruggen worden in de kamer geplaatst. Dan galvanotaxis kamer wordt overgedragen aan de microscoop podium en de elektroden zijn bevestigd aan het elektrisch veld. Zijaanzicht van de samengestelde galvanotaxis kamer wordt getoond tonen dat de elektrische stroom over de cellen door de agar bruggen en de ruimte tussen het afdekglas.

3. Time-lapse Imaging

1. Schakel de klimaatkamer bij 37 ° C met 5% _CO2 in de circulerende lucht 2 uur voorafgaand aan beeldvorming.
2. Schakel de microscoop en de inleiding van de beeld-verwerven van software. Kalibreren van de microscoop podium en selecteer de 10X objectief.
3. Breng de galvanotaxis kamers om de microscoop podium, zet de kamer met tape en focus op de cellen. Plaats de galvanotaxis elektroden met de buitenste reservoirs met kathode aan de rechterkant. Bevestig de draad en de elektroden met tape.
4. Schakel de stroom box een elektrisch veld naar de kamer. Meet de uitgangsspanning met de voltmeter over de kamer tot 2,5 volt voor de 25 mm lange kamer (100 mV / mm) te bereiken. Handhaaf de veldsterkte tijdens het experiment door aanpassing van de uitgangsstroom.
5. Selecteer 10 punten in de hele kamer te filmen in de software om tien time-lapse filmpjes te genereren. Het opzetten van de overname omstandigheden op 10-min intervallen gedurende 2 uur.
6. Beginnen filmen en pas de uitgangsstroom als dat nodig is.
7. Aan het einde van het experiment, verwijdert de ruimte van het toneel en zet de cellen met 95% alcohol. Open te breken de kamer met een scheermesje te reinigen en opnieuw te gebruiken.

4. Kwantificering van galvanotaxis

1. Draai de time-lapse filmpjes en heroriënteren van de kathode naar de top van de beelden. De films te exporteren naar de cel tracking software.
2. Handmatig volgen de (x, y) positie van 10-20 cellen bij elk tijdpunt van elke film (Figuur 4 A, B).De migratie afstanden en de hoeken ten opzichte van de noord-zuid richting, dezelfde oriëntatie van het elektrisch veld, zal worden berekend in de cel tracking software (Figuur 4C).
   OPMERKING: De gemiddelde migratie snelheid wordt omgezet van de totale migratie afstand en de totale filmen tijd. De richtingsgevoeligheid wordt omgezet van de hoeken tot de cosinus waarde. Als migreren met willekeurige directionaliteit, zal de gemiddelde netto cosinus nagenoeg nul. Als de cellen migreren recht naar de kathode, de cosinus waarde +1. Als de cellen migreren recht naar de anode, zal de cosinuswaarde -1 zijn.

Figuur 4: Cell volgen om gerichtheid meten A) Overlay van de tracking lijnen met mobiele beelden.. De (x, y) posities van de cellen manually bijgehouden in de time-lapse filmpjes. . Wanneer de cellen migreren willekeurig, de gemiddelde cosinus dichtbij nul B) Indien de cellen migreren naar de kathode of de anode, de waarde van de gemiddelde cosinus vlakbij + (kathode) of -. (Anode) 1,0 C ) De gerichtheid wordt door de cosinus waarde, die wordt omgezet van de migratie hoeken (θ). De cosinus (θ) gelijk aan de verhouding van de afstand a (de migratieafstand) om afstand b (de afstand verwachting de richting van het elektrisch veld).

3. Sla de metingen. De gegevens te importeren naar een database-applicatie om de gecombineerde resultaten te berekenen.
4. De gecombineerde gegevens van de gemiddelde migratie snelheid en gemiddelde cosinuswaarde exporteren naar een spreadsheet voor de grafieken (Figuur 5) plotten.

Results

Twee lijnen van prostaatcellen (PRN-1-1 en PNT2) werden onderzocht met deze methode. Cellen in beide lijnen migreren vergelijkbare snelheden van 1,0 +/- 0,3 micron / min in de loop van 2 uur (Figuur 5A). Echter, de gerichtheid op het elektrische veld is 0,7 +/- 0,3 voor de PRN-1-1 lijn, en 0,2 +/- 0,8 voor de PNT2 lijn (Figuur 5B). De resultaten tonen een significant verschil in de galvanotaxis van deze twee cellijnen (p <0,01, 100 cellen werden gevolgd), wat suggereert dat ze versch...

Discussion

De analyse van galvanotaxis reactie van een cel is een belangrijke functionele indicator voor vele cellulaire trekkende of groeiprocessen ^{27, 28.} Hier gebruiken we een op maat gemaakte kamer met glazen oppervlak tot twee prostaat cellijnen te filmen. Deze cellijnen toonden verschillende graden van galvanotaxis en we speculeren dat de intracellulaire lokalisatie of de activering van de galvanotaxis bemiddelende eiwitten gedurende het proces van het genereren van de onsterfelijke cellijnen, waardoor het waargen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellen
pRNS-1-1 prostaatcellen			Lee, et al. (1994)
PNT2 prostaatcellen	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium en oplossingen
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	opwarmen tot 37 °C voor gebruik
Fetal Bovine Serum - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, opwarmen tot 37 °C voor gebruik
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	voeg 5 ml toe aan 500 ml medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-	-	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 en 1.5 mM KH2PO4 in 1.000 ml H2O, pH tot 7.4 en autoclaved, opwarmen tot 37 °C voor gebruik
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	opwarmen tot 37 °C voor gebruik, behandel cellen gedurende 3-5 min op 37 °C
Galvanotaxie apparaat
Galvanotaxie kamers	Precision Plastics Inc, CA		Op maat gemaakte (1/4" x 2" x 3.5"), niet-giftige, doorzichtige PVC kamers. Neem contact op met de auteurs voor de ontwerpspecificaties.
Galvanotaxie elektroden	UCD electric shop		platina gewikkelde elektroden met flexibele snoeren
Galvanotaxie voedingsbox	Substrate Engineering, CA		op maat gemaakte DC-voedingsuitgang met voltmeter
Microscoop Dekglas, Groot, 45 x 50 mm, Nr. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscoop Dekglas, klein, 25 x 25 mm, Nr. 1	ThermoScientific	3307
Diamantpuntmarker	ThermoScientific	750
Marine grade siliconen afdichtmiddel, helder	3M	051135-08019
Hoge vacuümvet	Dow Corning	2021846-0807
6 ml spuit	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Spuit, 1.5 ml	Nichiryo	SG-M
Wattenstaafjes	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC slangen	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Muur
Bacto-Agar	Difco	0140-01	maak 2% agaroplossing
Veiligheidsmes	Personna	74-0001
Apparatuur en Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	bediend met een A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer telkamers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	laad 20 μl celoplossingen om te tellen
Cultuurtemperatuur opwarmplaat	Bel-Art Scienceware	370150000	om de galvanotaxie kamers op 37 °C te houden
Eclipse TE-2000 microscoop met gemotoriseerde tafel en omgevingskamer	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objectief	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Gekoelde CCD camera, monochroom, 12-bits
Perslucht met 5% CO2	Airgas		speciale bestelling
Volocity 6.3	PerkinElmer		Software voor het verzamelen van beelden
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software en aangepast om migratiehoeken te meten
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 voor Mac	Microsoft