Methodenartikel

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

DOI:

10.3791/51995

⸱

14 september 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het begrijpen van de conformatie van virale oppervlakte-antigenen is noodzakelijk om antilichaamneutralisatie te evalueren en het ontwerp van effectieve vaccin-immunogenen te begeleiden. Hier beschrijven we een cel-gebaseerde ELISA-test die de studie van de herkenning van trimeer HIV-1 Env, tot expressie gebracht aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, door specifieke anti-Env antilichamen mogelijk maakt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-1 envelop glycoproteïnen (Env) mediëren virale binnenkomst in doelcellen en zijn essentieel voor de infectiecyclus. Het begrijpen hoe deze glycoproteïnen in staat zijn om het fusieproces aan te drijven door hun conformationele veranderingen, zou kunnen leiden tot het ontwerp van betere, effectievere immunogenen voor vaccinstrategieën. Hier beschrijven we een celgebaseerde ELISA-test die het mogelijk maakt om de herkenning van trimere HIV-1 Env door monoklonale antilichamen te bestuderen. Na expressie van HIV-1 trimere Env aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, worden conformatiespecifieke anti-Env antilichamen geïncubeerd met de cellen. Een paardradischen peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam en een eenvoudige chemiluminescentiereactie worden vervolgens gebruikt om gebonden antilichamen te detecteren. Dit systeem is zeer flexibel en kan Env-conformationele veranderingen detecteren die worden geïnduceerd door oplosbaar CD4 of cellulaire eiwitten. Het vereist een minimale hoeveelheid materiaal en geen hooggespecialiseerd materiaal of knowhow. Dus kan deze techniek worden toegepast voor gemiddeld tot hoog doorvoerscreening van antigenen en antilichamen, zoals nieuw geïsoleerde antilichamen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) invoer, gemedieerd door de trimere virale envelop glycoproteïnen (Env) is de eerste stap van de infectieuze cyclus. Als enige zichtbare virale antigeen gepresenteerd op het oppervlak van virions, de Env trimeer wekt neutraliserende antilichamen en nonneutralizing. Als zodanig vertegenwoordigt een interessante kandidaat voor vaccin immunogeen design. Echter, vaccinatie studies met env in oplosbare of recombinante vormen uitgelokt reacties met slechts minimale effectiviteit tegen de meeste primaire HIV-1-isolaten 1-3. Toch gedeeltelijke werkzaamheid waargenomen in de RV144 vaccinproef 4 hernieuwde interesse in HIV-1 env als een immunogeen kandidaat. Dit werd bevestigd door een recente studie beschrijft dat vaccin opgewekte anti-Env antilichamen voldoende om een zekere mate van bescherming tegen SIV en HIV genereren uitdagingen 5.

Na gesynthetiseerd in het endoplasmatisch reticulum, de Env glycoprotein precursor, gp160, ondergaat verschillende post-translationele modificaties die kritisch zijn voor zijn vermogen om het virale fusieproces brandstof. De Env voorloper moet goed en associate vouwen in trimers alvorens te worden gesplitst in de extra-cytoplasmatische gp120 en gp41 transmembraan subeenheden 6-10, met niet-covalente interacties handhaven van de gp120-gp41 liaison. De geïnfecteerde cel machine is ook verantwoordelijk voor zwaar glycosylerende Env, die ongeveer 50% van zijn totale massa 11,12. De resulterende complexe structuur laat Env te conformatie flexibele 13,14, terwijl het verstrekken van een metastabiliteit waarvan wordt gedacht om Env aan te passen en te verbergen bepaalde zeer immunogeen epitopen die anders zouden worden blootgesteld 15-19, met de nadruk op het belang om beter te begrijpen van de verschillende conformaties bemonsterd door de inheemse Env trimeer.

Tot op heden zijn diverse technieken ontwikkeld en met succes gebruikt om Env conformationele ch studerenanges. Echter, ze verschillen in hun beperkingen, worden vaak beperkt tot specifieke contexten Env. Bijvoorbeeld, oppervlakte plasmon resonantie of immunoprecipitatie assays gebruikt conformatie specifieke monoklonale antilichamen (mAbs), beroepen op monomere oplosbare of gesolubiliseerde Env moleculen die bekend zijn immunogenetically verschillend van hun trimere vormen 20,21 zijn. Recente studies suggereren ook dat de splitsing van invloed Env conformaties waardoor de blootstelling van epitopen vooral herkend door nonneutralizing antilichamen 14,22,23.

Hier beschrijven we in detail een werkwijze die zorgt voor gemakkelijk bepalen van de conformatie van-cellulair tot expressie Env trimeren 18,24-26. Na transiënte transfectie van Env in een menselijke hechtende cellijn de binding van Env-specifieke antilichamen gedetecteerd met behulp van een eenvoudige chemiluminescentie reactie. Deze techniek kan ook worden gebruikt om de conformationele voorkeur karakteriseren van conformatie-afhankedent antilichamen. Aldus deze test verschaft een robuuste en zeer flexibele detectiemethode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Dag 1 - Cell Culture

  1. Plate 2 x 10 4 humane osteosarcoom (HOS) cellen per putje in een ondoorzichtige, 96-well celcultuur plaat geschikt voor luminescentie lezen. Gebruik Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 100 U / ml penicilline-streptomycine. Incubeer tot de volgende dag bij 37 ° C, 5% CO2.

2 Dag 2 - Polyethylenimine (PEI) Transfection

  1. Bereid transfectie mix volgens daaropvolgende stappen. Pas reagentia en hoeveelheden DNA volgens het aantal putten die worden getransfecteerd met hetzelfde Env.
  2. Buis A: Voeg 10 ng Tat-encoding plasmide (zoals ptat-III-27) en 150 ng env-encoding plasmide tot 5 pl DMEM aangevuld met 25 mM HEPES.
  3. De Tat coderende plasmide alleen vereist wanneer Tat-afhankelijke env coderende plasmiden zoals pSVIII.
  4. Tube B: Voeg 450 ng PEI (van een 1ug / ul oplossing) tot 5 pl DMEM.
  5. Inhoud van buis B Naar buis A. Meng goed door vortexen gedurende 10 seconden en incubeer transfectiemengsel 10 min bij kamertemperatuur (22 ° C).
  6. Voeg 10 ul van de transfectie mix per putje van de 96-well plaat. Incubeer 48 uur bij 37 ° C, 5% CO2.

3 Dag 4 - ELISA

  1. Voer alle experimenten bij kamertemperatuur mogelijk endocytose van Env / antilichamen complexen te minimaliseren.
  2. Bereid 250 ml wasbuffer per plaat gebruikt op hetzelfde moment. Wasbuffer is 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) pH 7,5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl), aangevuld met 1 mM MgCl2 en 1,8 mM CaCl2.
  3. Bereid 125 ml Blocking Buffer per plaat door toevoeging van 1% magere melkpoeder en 5 mM Tris pH 8,0 tot wasbuffer.
  4. Verwijder celkweek media en transfectie mix (supernatant) van 96-well plaat.
  5. Voeg 100 μ, L Blocking Buffer per putje en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder de supernatant en voeg 50 ul antilichaam (of serum) per putje, verdund tot de juiste concentratie in Blocking Buffer. Typisch, gebruiken een concentratie van 1 ug / ml. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur.
  7. Was 3x met 100 ul Blocking Buffer en herhaal wasproces 3x met 100 ul Washing Buffer.
  8. Verwijder supernatant, voeg 100 pl Blocking Buffer en incubeer 5 min bij RT.
  9. Verwijder supernatant en voeg 50 ul van secundair antilichaam, verdund 1/3000 in Blocking Buffer. Variëren optimale verdunning Antilichaam volgens fabrikant verschillen. Incubeer 40 min bij kamertemperatuur.
  10. Was 3x met 100 ul Blocking Buffer en herhaal wasproces 3x met 100 ul Washing Buffer.

4 Data Acquisition

  1. Verwijder supernatant uit de plaat en voeg 30 ul 1x versterkte chemiluminescentie (ECL) substraat per putje.
  2. Verwerven chemiluminescence signaal voor 1 sec / well op een geschikte plaat-lezer volgens de instructies van de fabrikant. Leestijd kunnen verschillen afhankelijk van de hardware verschillen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de hierboven beschreven algemene procedure, we passen het protocol om de impact van oplosbaar CD4 (sCD4) en coexpressed cellulaire CD4 op de blootstelling van CD4i epitopen assay aan beide (wt) wild-type of gemuteerd Env, zoals eerder beschreven 18,24, 25,28. Figuur 1 schematisch de algemene procedure en de blootstelling van CD4i epitopen na behandeling met sCD4 of door co-expressie van cellulaire CD4 18. In figuur 2 hebben we gebruikt sCD4 om Env vo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze test is geoptimaliseerd om de interactie van specifieke mAbs gedetecteerd met HIV-1 trimere Env tot expressie op het celoppervlak. Nadat het protocol is vastgesteld, kan het gebruikt worden op de middellange tot hoge doorvoersnelheden met lage totale materiaalkosten en kleine hoeveelheden van antilichamen. Aangezien deze test is-gebaseerde transfectie, kan gemakkelijk worden gebruikt voor co-expressie van cellulaire eiwitten zoals CD4 om hun effecten op Env conformatiebepaling.

De trans...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr James Robinson voor zijn gulle gift van de A32, 17b, 48d, en C11 mAbs. PGT 121 werd verkregen door het NIH AIDS reagens Program, Afdeling van aids, NIAID, NIH (Cat # 12343). Dit werk werd ondersteund door een Canada Foundation for Innovation Leader Programma # 29866, door een CIHR operationele # 257792, door een FRQS Oprichting van Young Scientist verlenen # 24639 voor AF en door een CRCHUM continuüm subsidie, alsmede door een CIHR katalysator subsidie ​​# 126630 naar AF en MR. AF is de ontvanger van een FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 fellowship # 24639. MV werd ondersteund door een CIHR Doctoral Research Award # 291485.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HOS cellenATCCCRL-1543
Witte ondoorzichtige weefselkweekplaat, 96-well, Platte bodemBD353296
Polyethyleenimien, lineair, 25.000 MWPolysciences23966Bereidt in 1 mg/ml oplossing
Dulbecco's Gemodificeerd Eagles Medium (DMEM)Invitrogen11995
Geit Anti-menselijke IgG, Peroxidase GeconjugeerdPierce31413
Enhanced Chemiluminescence SubstraatPerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941, Plate ReaderBerthold Technologies

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HIV 1 envelopeglycoprote nenconformationele veranderingenmonoklonale antilichamenchemiluminescentiedetectieoplosbaar CD4getransfecteerde cellenmierikswortelperoxidaseepitopenblootstellinghigh throughputscreening

Gerelateerde artikelen