Meten Lokaal Anafylaxie in Muizen

Samenvatting

Allergische reacties, gekenmerkt door de activering van mestcellen en basofielen, worden door de verknoping van IgE en het vrijkomen van pro-inflammatoire mediatoren. Een kwantitatieve beoordeling van allergische reacties kunnen worden bereikt door Evans Blue kleurstof veranderingen in vasculaire permeabiliteit na provocatie met allergeen controleren.

Samenvatting

Allergische reacties het gevolg zijn van de activatie van mestcellen en basofielen en de daaropvolgende afgifte van vasoactieve en pro-inflammatoire mediatoren. Blootstelling aan een allergeen in een gesensibiliseerd individu kan leiden tot klinische symptomen die variëren van lichte roodheid tot levensbedreigende anafylaxie. In het laboratorium zijn verschillende diermodellen ontwikkeld om de mechanismen die allergische reacties begrijpen. Hierin beschrijven we een gedetailleerde methode voor het meten van veranderingen in vasculaire permeabiliteit gelokaliseerde allergische reacties te kwantificeren. De plaatselijke anafylaxie test werd voor het eerst gemeld in de jaren 1920, en is een aangepaste versie van de techniek gepubliceerd door Kojima et al. in 2007 ^1. Bij deze assay muizen gesensibiliseerd met OVA uitgedaagd in de linker oor met voertuig en in het rechter oor met OVA. Dit wordt gevolgd door een intraveneuze injectie van Evans Blue kleurstof. Tien minuten na het injecteren van Evans Blue, wordt het dier gedood en de kleurstof die in extravasatiede oren wordt een nacht geëxtraheerd in formamide. De absorptie van de geëxtraheerde kleurstof wordt vervolgens gekwantificeerd met een spectrofotometer. Deze werkwijze methode stelselmatig een visuele en kwantificeerbare manifestatie van een lokale allergische reactie.

Inleiding

Type I overgevoeligheid wordt gemedieerd door antigeen geïnduceerde verknoping van IgE op het oppervlak van mestcellen en basofielen. Dit resulteert in cellulaire degranulatie en afgifte van vasoactieve en proinflammatoire mediatoren zoals histamine, tryptase en bloedplaatjes activerende factor ^2. Na de afgifte van voorgevormde mediatoren tijdens degranulatie, mestcellen synthetiseren kort prostaglandinen en leukotriënen, die verder toenemen vasculaire permeabiliteit ^3. De eerste klinische respons treedt snel wordt aangeduid als een "onmiddellijke reactie". In de huid, een wheal-en-flare reactie gemakkelijk zichtbaar binnen minuten na provocatie met antigeen. Afhankelijk van de dosis van de challenge, is het mogelijk om een ​​"late fase respons" een paar uur later observeren. Late fase zwelling is het gevolg van lokaal oedeem en rekrutering van leukocyten in de weefsels ^2. Histamine, algemeen beschouwd als de belangrijkste mediator die aan zijnonmiddellijke allergische reacties, werkt in op histamine receptor 1 (HR1) uitgedrukt op schepen en histamine receptor 2 (HR2) uitgedrukt op de gladde spieren. Het gecombineerde effect verhoogt de bloedstroom en vasculaire permeabiliteit op de plaats van ontsteking ^4.

Een verscheidenheid van dierlijke modellen van allergie ontwikkeld om de bij allergische ontsteking mechanismen, met inbegrip van modellen van allergische astma, systemische anafylaxie en lokale anafylaxie bestuderen. Intraveneuze kleurstof administratie is gebruikt om gelokaliseerde allergische reacties in diermodellen meten bijna een eeuw, met publicaties waarin deze techniek dateert uit de jaren 1920 ^5. Konijnen en cavia's waren de eerste diermodellen gebruikt om onmiddellijke overgevoeligheidsreacties te testen, en de meest gevoelige reacties waren over het algemeen gevonden in het oor ^5,6. De bepaling werd later gevalideerd voor gebruik bij ratten en muizen ^{7 8.}

Historisch,verschillende experimentele methoden zijn gebruikt, waaronder injectie van antigen voorafgaand aan de injectie van kleurstof, injectie van kleurstof vóór injectie van antigeen en gelijktijdige injectie van kleurstof en antigeen. Intraveneuze toediening kleurstof als middel voor het meten van allergische reacties is een veelzijdig assay als het kan worden gebruikt voor het meten van actieve, passieve en reverse passieve reacties ^5,9. Tal van kleurstoffen zijn gebruikt om allergische reacties, waaronder trypaanblauw, pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Blue 536 en India Ink ^5,6,9 beoordelen. Een oplossing van 0,5% Evans Blue momenteel standaard kleurstof voor het meten van allergische reacties in de huid.

De anafylactische reactie op de uitdaging is van voorbijgaande aard; maximale intensiteit wordt binnen 10 - 15 minuten kleurstof injectie en geen reactie is zichtbaar als kleurstof wordt toegediend meer dan 30 minuten na provocatie, ongeacht de gebruikte diersoorten ^9. Kwantificering van kleurstof extravasatie was oorspronkelijkly verkregen door het meten wheal formaat zoals aangegeven door de blauwe kleurstof ^7-9. Bovendien kan tellingen van degranulated mestcellen worden gekwantificeerd door excisie huidweefsel van de plaats van de reactie en kleuring met toluïdineblauw ^7. Mestceldegranulatie wordt vaak gebruikt als een marker voor cutane, IgE-gemedieerde allergische reacties, zoals mestcellen de belangrijkste lokale celpopulatie expressie hoge affiniteit IgE receptor FcsRI. Spectrofotometrische technieken voor het meten kleurstof extravasatie in het weefsel ontwikkeld voor passieve cutane anafylaxie (PCA) in de rat en de muis ^{11, 10} in de jaren 1990.

De volgende plaatselijke anafylaxie assay protocol werd aangepast van Kojima et al. ¹ en gebruik kippenei ovalbumine (OVA) als antigeen voor het opwekken van allergische reacties. Voor andere dan OVA antigenen worden gebruikt indien gewenst. De assay gebruikt vervolgens Evans Blue kleurstof veranderingen in vasculaire permeabilit volgeny dat door cellen IgE verknopen en histamine afgifte mast voorkomen.

Protocol

1 sensibiliseren Muizen

1. Bereid een OVA voorraadoplossing door verdunning OVA in 1x PBS tot een eindconcentratie van 20 mg / ml. Freeze neer porties in cryovials en bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
2. Breng een of meer porties van 20 mg / ml OVA stock kamertemperatuur. Verdun OVA in 1x PBS tot een eindconcentratie van 1 mg / ml in 5 ml polystyreen ronde bodem buis met een kap. Vortex kort te mengen.
3. Terwijl de polystyreen buis met de 1 mg / ml OVA op een vortex ingesteld op gemiddelde snelheid, voeg een gelijk volume van grondig gehomogeniseerd Imject Alum (40 mg / ml) druppelsgewijs toegevoegd terwijl zij de buis altijd een 1 vortex: 1 ratio aluin om immunogeen.
4. Plaats dop op de buis en tape buis te vortex. Zet vortex op de laagste stand en laat OVA tot adsorptie Aluin gedurende 30 minuten.
   1. Sta niet toe dat een groot deel van de tijd verstrijken tussen de voorbereiding van OVA / Aluin en sensibiliserende muizen. Als sensibilisatie kan niet direct na OVA / Aluin preparat afgerondion, opslag OVA / Alum bij kamertemperatuur. Vortex gedurende 1 min voor gebruik.
5. Laad een 1 ml insulinespuit met OVA / Aluin mengsel. Dop op de spuit met 27 gauge naald.
6. Injecteer 100 ui OVA / Aluin in het peritoneum van BALB / c muizen een dosis per muis of 50 ug OVA en 2 mg aluin.
7. Voor een negatieve controle, sensibiliseren andere groep muizen PBS. Bereid een 1: 1 mengsel van aluin en PBS op dezelfde wijze als hierboven vermeld, weglating OVA.
8. Sensibiliseren alle muizen (OVA en PBS controle) eenmaal per week gedurende 3 weken voor een totaal van 3 injecties. Na de laatste injectie, wacht dan tenminste 2 weken voor het uitvoeren van de plaatselijke anafylaxie assay.

2 Lokale Anafylaxie Assay

1. Breng OVA voorraad oplossing op kamertemperatuur. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, verdunnen 20 mg / ml OVA stock tot een eindconcentratie van 5 mg / ml met PBS (1: 4 verdund OVA in 1X PBS). Vortex kort te mengen.
2. Verdoven van muizen met behulp van RC ^{2 <}/ Sup> Knaagdieren anesthesie-systeem (of vergelijkbaar verdampte levering systeem). Vul het reservoir met isofluraan, en zet O ₂ luchtstroom. Plaats muizen in inductie kamer en pas isofluraan instelwiel om 5% tot verdoving te starten. Zodra muizen volledig verdoofd, aangegeven door gebrek aan mobiliteit, aan te passen isofluraan instelwiel om 3% tot diepe verdoving te behouden. Het doel van anesthesie bij deze procedure is het dier te immobiliseren. Het oor en staart ader injecties geen significante pijn of angst voor het dier veroorzaken.
   OPMERKING: Isofluraan kan negatieve effecten op het menselijk voortplantingssysteem hebben. Zorg ervoor dat u om te gebruiken in een goed geventileerde ruimte en bevestig een wegvangen bus naar de inductie kamer om afval gas te neutraliseren. Als u zwanger bent tijdens het gebruik van isofluraan, draag een koolstoffilter masker om blootstelling te minimaliseren.
3. Plaats 10 gl van 5 mg / ml OVA in een 3/10 cc insulinespuit afgedekt met een 31 G naald. Plaats een ander 3/10 cc insulinespuit met 10 pi1X PBS.
4. Met behulp van een dissectiemicroscoop Injecteer 10 ul van OVA in het rechter oor van een verdoofde muis uitdaging dosis van 50 ug OVA. Andere doses, zoals 20 ug, zijn ook aanvaardbaar.
   1. Om het oor te stabiliseren voor injectie, wikkel plakband (plakkerige zijde naar boven) rond een 15 ml conische buis. Zet de dorsale zijde van het rechter oor naar de tape. Steek de naald schuine kant naar boven tussen de twee bladeren van het oor. Injecteer langzaam OVA in het midden van het oor weefsel, zorg dat er geen bloedvaten geraakt.
5. Met dezelfde hierboven beschreven, injecteer 10 ul van PBS in het linkeroor als negatieve controle.
6. Wacht 3 minuten.
   1. Gedurende deze tijd, plaats de muis in een restrainer en houd de staart onder een warmtelamp of in een warm waterbad gedurende 1 min aan de bloedvaten.
7. Met behulp van een 1 ml insulinespuit afgedekt met een 27 G naald en injecteer langzaam 200 gl 0,5% Evans Blue kleurstof in de staart vEin van de muis. Snelle injectie kan de vatstructuur vernietigen voordat de gehele 200 ul toegediend. Als dit gebeurt, proberen de resterende hoeveelheid kleurstof injecteren in de ader aan de andere kant van de staart.
8. Wacht 10 minuten.
9. Euthanaseren de muis en verwijder beide oren met behulp van pincet en chirurgische schaar.
   1. Pak de randen van het oor met een tang, ervoor te zorgen dat geen druk wordt uitgeoefend op de injectieplaats in het midden van het oor. Verwijder zoveel oorweefsel mogelijk door zagen dichtbij, maar niet door, de nok van kraakbeen aanwezig bij de basis van het oor. Kleine hoeveelheden bont aanwezig op de uitgesneden oor; dit heeft geen invloed op de test.
10. Aliquot 700 ul van formamide in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Bereid een tube per oor (twee tubes per muis).
    OPMERKING: Formamide is teratogeen, mutageen, en irriterend. Draag handschoenen, oogbescherming en gelaatsbescherming. Zwangere vrouwen moeten voorzichtig zijn bij het hanteren van eens formamide kan foetotoxisch zijn.
11. Oren toe te voegen aan formamide, cap de buizen, en incubeer overnacht in een droge hitte bad ingesteld op 63 ° C. Oren kunnen nog enigszins blauw na incubatie; maar de meerderheid van de kleurstof wordt geëxtraheerd in de formamide.
12. Voeg 300 ul van elk monster in duplo, een 96 putjes plaat. Vermijd overbrengen fur indien aanwezig in het monster. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de putten, omdat ze de absorptie-aflezing zal beïnvloeden.
13. Voeg 300 pl formamide, in tweevoud, de 96 putjes plaat. Deze putjes wordt gebruikt als blanco's.
14. Gebruik een spectrofotometer om absorptie te meten bij 620 nm. Aftrekken formamide putten uit elk monster lezen.
    OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in het kader van protocollen door de geüniformeerde diensten Universiteit Institutional Animal Care en gebruik Comite.

Resultaten

Dieren die de test met succes hebben ondergaan zal de huid en ogen die blauw lijken te hebben. PBS gesensibiliseerde dieren mag niet reageren op PBS of OVA uitdaging, dus beide oren moet wit (Figuur 1A) blijven. In OVA gesensibiliseerde dieren, het oor ontvangen van de PBS challenge (links) moeten ofwel volledig wit of blauw licht op een gelokaliseerde wijze op de plaats van injectie. Het oor ontvangst van de OVA uitdaging (rechts) moet geleidelijk donkerder blauw geworden tijdens de 10 min na kleurstof...

Discussie

Talrijke merkers van allergische aandoeningen worden gebruikt om de sterkte van allergische responsen na provocatie met allergeen, waaronder veranderingen in niveaus van circulerende histamine, Th2 cytokine productie en celrecrutering in bronchoalveolaire vloeistof in de omgeving van luchtweg challenge beoordelen. Terwijl bewaken veranderingen in deze parameters is van belang voor het bestuderen allergische reacties, hebben biologische markers niet altijd correleert met klinische allergische aandoeningen. De plaatselijk...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BALB/c Muizen	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumine	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Meng grondig voor gebruik
Evans Blauwe Kleurstof	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrofotometrisch kwaliteit
Isofluraan, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insuline spuiten	BD	329654
3/10 cc Insuline spuit met 31 G naald	Terumo	NDC 100861
27 G Naalden	BD	305109
Pincet	F.S.T.	11000-12
Chirurgische schaar	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyreen buisjes met ronde bodem	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifugebuisjes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conische buisjes	BD Falcon	352097
Vlakbodem 96-wells plaat	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Knaagdier Anesthesie Systeem	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 met 3 inch platform