Ongecompliceerd Assay voor de kwantificering van Sociale Avoidance in Drosophila melanogaster

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de vermijding van gestreste individuen te kwantificeren. Dit paradigma is krachtig maar gebruiksvriendelijk en kan worden gebruikt om de invloed van genen en omgeving op een soort sociale interactie bij Drosophila melanogaster te beoordelen.

Samenvatting

Drosophila melanogaster is een opkomend model om verschillende aspecten van sociale interacties te bestuderen. Vliegen vermijden bijvoorbeeld gebieden die eerder werden bezet door gestreste soortgenoten vanwege een geur die vrijkomt tijdens stress, bekend als de Drosophila stressgeur (dSO). Door het gebruik van het T-labyrint apparaat, kan men de vermijding van de dSO door responder vliegen kwantificeren in een zeer betaalbare en robuuste test. De voorwaarden die nodig zijn om een sterke prestatie te verkrijgen, worden hier gepresenteerd. Een stressvolle ervaring is noodzakelijk voor de vliegen om dSO uit te stoten, evenals voldoende zendvliegen om een robuuste vermijdreactie op de aanwezigheid van dSO te veroorzaken. Genetische achtergrond, maar niet hun groepsgrootte, beïnvloedde sterk de vermijding van de dSO door de responder vliegen. Canton-S en Elwood vertonen een hogere prestatie in het vermijden van de dSO dan Oregon en Samarkand stammen. Deze gedragstest zal identificatie van mechanismen onderliggend aan dit sociale gedrag mogelijk maken, en de beoordeling van de invloed van genen en omgevingscondities op zowel emissie als vermijding van de dSO. Een dergelijke test kan worden opgenomen in batterijen van eenvoudige diagnostische tests die worden gebruikt om sociale tekortkomingen van mutanten of omgevingscondities van belang te identificeren.

Inleiding

Het doel van deze methode is om gemakkelijk te kwantificeren een nieuw aspect van eenvoudige sociaal gedrag in Drosophila melanogaster, onafhankelijk van verkering en agressie.

Sociale interacties zijn cruciaal voor de goede ontwikkeling en gezondheid van individuen binnen een samenleving, evenals de functionaliteit van een sociale groep als geheel. De hoge complexiteit van deze interacties noodzakelijk grote aantallen individuen en een systeem waarmee vereenvoudiging van het gedrag als de genetische en neurale grondslagen van sociaal gedrag zijn nog slecht begrepen. Drosophila melanogaster is een krachtige genetisch model dat kan worden gebruikt om de genetische identificatie en neurale grondslagen van sociale interacties. Inderdaad, D. melanogaster heeft een repertoire van complex sociaal gedrag en een aantal directe metingen van socialisatie zijn al gedaan ^1-7. De meeste van deze pogingen zijn gericht op relatief complex sociaal gedrag, zoals agressive interacties ^3,6, diverse aspecten van de hofmakerij ^3,8-12, en hoe sociale ervaring beïnvloedt andere gedragingen zoals leren, of circadiane ritme ^13-17. Bovendien zijn veel van deze assays afhankelijk analyseren van complexe interactiepatronen groepen van vliegen, met videotracking en software om de resulterende overvloed data te analyseren. Dergelijke analyses zijn van onschatbare waarde, en leiden tot belangrijke nieuwe inzichten, zoals de dynamiek van de fly-fly interacties in groep ^7. Een beperking is echter de ontoegankelijkheid van deze testen aan de gemeenschap in het algemeen, en de beperkte kennis van de mechanismen die ten grondslag liggen aan erkenning van anderen. Met andere woorden, is de basis van de emissie van een signaal van een individu en de erkenning ervan door een ander nog steeds slecht begrepen ^18.

Het D.: In tegenstelling, vliegen ook een eenvoudige gedrag, sociale vermijding, waar individuen te stappen van een signaal uitgezonden door benadrukte vliegen vertonen Melanogaster Stress Odorant of DSO ^19. In een high-throughput assay kan dit gedrag worden gekwantificeerd als het vermijden van een spanning signaal uitgezonden door andere vliegen of sociale vermijden ^19. Vliegen is in een T-doolhof apparaat geplaatst en de keuze om een ​​flesje dat DSO voorkomen. Met dit assay, CO ₂ bleek een component van de DSO en een deel van de neurale circuits noodzakelijk is om aan CO ₂ werd ontleed ¹⁹ zijn.

De sociale vermijding test hier gepresenteerde is vergelijkbaar conceptueel de eenvoudige gedrags assays ontwikkeld in Seymour Benzer het laboratorium dat generaties onderzoekers nodig om complexe gedragingen ²⁰ ontleden. Analyse van sociale vermijding kan worden uitgevoerd kosteneffectief behulp van de T-doolhof test, waardoor bredere studie van sociaal gedrag. Bijvoorbeeld met behulp van deze test we onlangs aangetoond dat verschillende genetische risico voor autisme contrasterende effecten in sociale behavior assays. Mutanten voor een kandidaat voor autisme - neurobeachin ^21,22 - heden tekortkomingen zowel in de sociale ruimte (elders ²³ beschreven) en sociale vermijding ^24. Abnormale dopaminerge signalering wordt voorgesteld een rol spelen bij de etiologie van autisme bij mensen ^25,26. In tegenstelling tot de resultaten verkregen met neurobeachin, vonden we dat sociale vermijden prestatie was niet beïnvloed door verhoogde of verlaagde niveaus van de Drosophila vesiculaire monoamine transporter (VMAT) in dopaminerge cellen, hoewel sociale ruimte rechtstreeks gecorreleerd met deze niveaus van VMAT ^27. De contrasterende resultaten verkregen met neurobeachin en VMAT onderstrepen de mogelijkheid tot identificatie van verschillende vormen van asociaal gedrag en daarmee de verschillende onderliggende neurale circuits moduleren van de respons op anderen.

Protocol

1. apparatuur en reagentia Gemaakt In-house (zie lijst van materiaal voor anderen)

1. Bereid een Drosophila koude anesthesietoestel om vlieg werk uit te voeren.
   1. Snijd een poreus polyethyleen blad aan een klein plastic doosje (12,7 cm lang, 10,2 cm breed), meestal de bovenklep van een doos pipetuiteinden (12,7 cm lang, 10,2 cm breed, 3,8 cm diep) te dekken.
   2. Vul de doos met crushed ijs, dek af met de poreuze polyethyleen blad.
2. Bereid een T-doolhof apparaat; de inrichting eerder beschreven in detail ^28-31 passen.
3. Bereid een vlieg aspirator zoals beschreven ^32.
4. Bereid een phototaxis reactie apparaat om vliegen te verplaatsen in en uit testen flesjes zonder stress:
   1. Gebruik tegenstroom inrichting, zoals beschreven door ^29,33.

OPMERKING: De T-doolhof kan ook worden gebruikt voor andere doeleinden, zoals beschreven door ^28.

5. Zorgen homogeneous lichtomstandigheden: uitvoeren van het experiment op een bankje bedekt met een witte bank cover, en aan de voorzijde van een witte boord.
   LET OP: Voor deze experimenten, de vlieg gebruikte stammen waren Drosophila melanogaster wild-type: Canton-S, Oregon en Samarkand vliegt van ons laboratorium voorraden ^34; Elwood vliegen werden verzameld in het najaar van 2011 in de buurt van Huntington Elwood, op Long Island, New York, USA.

2. Voorbereiden van de Vliegen voor het experiment

1-2 dagen voordat het experiment:

1. Handhaaf vliegen op standaard maïsmeel-agar-melasse-gist medium bij 25 ° C op een 12 uur licht / donker cyclus.
2. Verzamel de responder vliegen onder koud verdoving 1-2 dagen voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment
   1. Transfer de vliegen uit de flessen waarin ze zijn opgegroeid in 50 ml Falcon buizen, met behulp van een trechter.
   2. Plaats de valk buis met de vliegen onder ijs niveau, in eengeïsoleerde ijsemmer.
   3. Leg de koude anesthesietoestel met crushed ijs bij -4 ° C om te relaxen.
   4. Wacht 5 minuten voor de vliegen om een ​​chill coma te voeren.
   5. Transfer de vliegen op de poreuze polyethyleen blad van de koude anesthesie apparaat.
   6. Verzamel de responder vliegen op de koude anesthesie apparaat. Bij KT, onder een stereomicroscoop, scheiden 3-7 dagen oud Man uit vrouwelijke vliegen en deze vliegen te houden in groepen van 40.
3. Verzamel de emitter vliegen 1-2 dagen voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment.
   1. Verzamel Canton-S mixed-sex vliegt uit hun flessen, met behulp van een mond aspirator, het beheersen van hun nummer.
   2. Handhaaf deze vliegen in groep 60-100, zoals ze zullen zijn de emitters.
   3. Bereid zoveel monsters vervuilers gegevenspunten nodig.
4. Laat minstens een nacht van herstel na inning van de responders en vervuilers, om eventuele verstorende effect van de koude anesthesie te minimaliserenen mond aspirator collectie op gedrag.
5. Open de zak proef flesjes, zodat de muffe kunststof ruikende lucht in de zak te vervangen door verse lucht, ten minste 1 dag voor het experiment.

2 uur voordat het experiment:

6. Zorg ervoor dat de temperatuur in de ruimte waar het experiment wordt uitgevoerd ongeveer 23-25 ​​° C, met nog licht en vochtigheid boven 30%.
7. Breng de responders en emitters fruitvliegen in vers voedsel flesjes om ervoor te zorgen dat deze vliegen niet worden uitgehongerd.
8. Laat de fruitvliegjes aanpassen aan de omgeving gedurende 2 uur, op de bank waarmee het experiment wordt uitgevoerd.

3. Het uitvoeren van de Sociale Avoidance Experiment

1. Voer elke experiment op hetzelfde tijdstip van de dag, in een range van 3-4 uur in de middag tussen Zeitgeber tijd ZT5 en ZT9.
2. Plaats de T-doolhof op het beukende pad, en draai de schroef clip zo tHij lift stabiel.
3. Breng de responder vliegen in een frisse toets flacon. Snap dit flesje dat de responder vliegen op het bovenste gedeelte van de T-doolhof.
4. Schuin de T-doolhof apparaten en tik op de beukende mat zodat de fruitvliegjes vallen in de lift.
5. Beweeg het bovenste deel van de lift naar beneden zodat de vliegen zijn tussen de bovenste en onderste deel van de T-doolhof, maar let op de lift boven het keuzepunt houden - te voorkomen dat vliegen ontsnappen.
6. Verkrijgen flesjes met DSO (zie hoofdstuk 5 tot DSO-vrije flesjes die eerder door vliegen werden bezet te genereren).
   1. Terwijl de responder vliegen worden aan te passen aan deze nieuwe omgeving, plaatst de zender vliegen in een test flacon.
   2. Leg een stuk katoen aan de flacon te sluiten zodat de fruitvliegen niet ontsnappen.
   3. Mechanisch ageren deze flacon op een mini-vortex als volgt: vortex gedurende 15 seconden, verwijder de flacon uit de vortex gedurende 5 sec. Herhaal dit 3 keer voor een totaal van 55 sec.
   4. Remove de emitter vliegt uit de verse flesje - door de overdracht in een keukenmachine flacon - en snel plaats deze DSO gevuld flesje in een van de twee kanten van de T-doolhof apparaat.
   5. Wissel de zijkant van plaatsing voor de DSO gevuld flesje in elke nieuwe run.
7. Plaats een nieuwe proef flesje aan de andere kant van het T-doolhof.
8. Breng de lift helemaal naar beneden, zodat de fruitvliegjes kan kiezen tussen de verse-test flacon en de test flacon met DSO, en start de timer.
9. Laat de vliegen kiezen tussen de verse flacon en de DSO flacon, gedurende 1 min, tenzij anders vermeld.
10. Na 1 min, beweegt u de lift naar de vliegen in de frisse flacon, DSO flesje, en die vast te zitten in de lift te scheiden.
11. Tel het aantal vliegen per flesje, en de lift.
12. Herhaal dit voor elk genotype / conditie.

4. Het analyseren van de Sociale Avoidance Gegevens

1. Tel het aantal fruitvliegjes in elk flesje voor elk genotYpe en overdracht van de gegevens naar een spreadsheet.
2. Met een spreadsheetprogramma Bereken het-index (PI) voor elk genotype door het aftrekken van het aantal vliegen in de DSO flacon uit het aantal vliegen in de DSO-vrij flesje, en vervolgens te delen door het totale aantal vliegen.
3. Vergelijk de PI's ": door middel van statistische analyse software voor de analyse van de resultaten.
   1. Idealiter bereiden 2-3 interne herhalingen van elk experiment en 3 onafhankelijke herhalingen uitgevoerd op verschillende dagen met verschillende flessen of overschrijdt ^30.
   2. Gebruik Gaussische verdeling statistische tests, zoals de gegevens volgt een normale verdeling.
   3. Bij het ​​testen van een effect (dwz dichtheid - figuur 2), gebruik een eenzijdige ANOVA met post-test voor meervoudige vergelijking (kolom per kolom), of een t-test elk resultaat te vergelijken met een controle.
   4. Als groep experimenten worden uitgevoerd, testen beide voorwaarden en geslachten (lege flacons, benadrukte eend un-benadrukte vliegen; en gender-effect - figuur 1), met behulp van een twee-weg ANOVA.

5. Genereer Flesjes Eerder Bezet door onbeklemtoonde Flies - Voer plaats van 3,5-3,6

1. Gebruik phototaxis flesjes bezet door vliegen die niet zijn onderstreept bereiden, als controle.
2. Breng het vliegen in een test flesje, en klik deze in de tegenstroom apparaten, met verse lege flesjes in de tegenovergestelde plaats.
3. Leg het apparaat horizontaal met de distale flacon direct voor een 15 W TL koel-wit licht, en dek af met een zwarte doek.
4. Laat de vliegen zachtjes bewegen in de frisse flacon. Dit kan enkele minuten duren. Zodra meeste vliegen lopen naar het licht in de distale flacon, start de timer gedurende 1 min.
5. Verwijder voorzichtig het zwarte doek, schakelt de plaats van het licht, herstellen met het zwarte doek, en laat de vliegen op de proef flacon vertrekken.
6. Op dat moment, initiate het keuze-experiment als in 3,2-3,5. Overslaan 3.6 en 3.7.
7. Verplaats de schuif van de inrichting, de vliegen die de test flacon uit de andere zijde verlaten scheiden.
8. Gebruik het verlaten proef flacon in de T-doolhof direct voor de keuze experiment, zoals in 3.7.

Resultaten

De sociale vermijding test is een robuustere kwantificeren het vermogen van Drosophila melanogaster met een stress-signaal herkennen (DSO) uitgezonden door andere vliegen en dus beoordelen één aspect van de sociale interacties. De test wordt uitgevoerd met een inrichting gewoonlijk in verschillende gedrag assays bekend als een T-doolhof, waarbij de vliegen presenteren met een keuze tussen twee mogelijkheden - links of rechts ^19,28-31. In dit geval wordt de efficiëntie waarmee de vliegen voorkomen DSO...

Discussie

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor de sociale vermijding test. Canton-S zal alleen voorkomen dat een flacon waarin vliegt eerder mechanisch geweest benadrukt, en dat seks en het aantal responders heeft geen invloed op dat sociale vermijding prestaties. Echter, de genetische achtergrond van de respondenten heeft een grote invloed.

De volgende zijn een aantal cruciale stappen voor het uitvoeren van dit experiment met succes: 1) altijd de vliegen te dragen 2 uur voor het ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stereo Zoom Microscope	Nikon	SMZ-645	Elk ander standaard bereik voor vliegverwerking zou werken
Kleine verf kwasten			voor het duwen van vliegen
Poreuze polyethyleen, 12" x 12" plaat	Flystuff - Genesee	46-100	http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100 Poreuze kunststof plaat voor de koude anesthesie box
Mini-alarm timer/stopwatch
Sharpie pennen
Zelfklevend plakband
Mini vortex	Fisher	14-955-151	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail Voor mechanische agitatie van de vliegen - elke vortex zou werken.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Falcon testbuis; ronde bodem; wegwerp; geen sluiting, 14 ml; 17 x 100 mm	Fisher	14-959-8	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0 Deze klikken op hun plaats in de zelfgemaakte T-labyrint en tegenstroming apparaat (zie tekst)
Wattenschijfjes			om de flesjes te sluiten na het experiment.
Drievoudig bord en witte tafelkleed			om een witte achtergrond en een homogene licht te bieden.
Wit tafelkleed
Slaapmuts			elke muismat werkt.
Grote zwarte doek			om het tegenstroming apparaat te bedekken in fototaxis respons.
Koel-witte licht	Home Depot	1000516563	http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423 elk soortgelijk lineair licht met fluorescente licht koel-wit op 13-15 W zou werken