Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues

Summary

DNA en eiwitten sequentie-specifiek gemerkt met affiniteit of fluorescente reporter groepen met DNA of eiwit methyltransferases en synthetische analogen cofactor. Afhankelijk van de cofactor specificiteit van de enzymen, aziridine of dubbel geactiveerde cofactor analogen worden gebruikt voor één of twee stappen labeling.

Abstract

S -Adenosyl-L-methionine (AdoMet of SAM) -afhankelijke methyltransferase (MTase) katalyseren de overdracht van de geactiveerde methylgroep van AdoMet specifieke posities in DNA, RNA, eiwitten en kleine biomoleculen. Deze natuurlijke methylering reactie kan worden uitgebreid naar diverse alkyleringsreacties met synthetische analoga cofactor. Vervanging van het reactieve sulfonium centrum van AdoMet een aziridinering leidt tot cofactoren die kunnen worden gekoppeld met DNA van verschillende DNA MTases. Deze aziridine cofactoren kunnen worden uitgerust met reportergroepen op verschillende posities van de adenine eenheid en voor S equence specifieke M ethyltransferase- I nduced L abel ing van DNA (lachend DNA). Als voorbeeld geven we een protocol voor biotinylering van pBR322 plasmide DNA bij de 5'-ATCG A T-3 'sequentie van het DNA MTase M.BseCI en aziridine cofactor 6BAz ineen stap. Verlenging van de geactiveerde methylgroep met onverzadigde alkylgroepen resultaten in andere klasse van AdoMet analogen die gebruikt worden voor m-ethyltransferase gerichte T ransfer van A ctivated G de andere groepen (mTAG). Aangezien de uitgebreide zijketens worden geactiveerd door het sulfonium- midden en de onverzadigde binding, worden deze cofactoren genoemd dubbel geactiveerde AdoMet analogen. Deze analogen niet slechts als cofactoren voor DNA MTases, zoals aziridine cofactoren, maar ook voor RNA, eiwitten en kleine moleculen MTases. Ze worden doorgaans gebruikt voor enzymatische modificatie van MTase substraten met unieke functionele groepen die zijn gemerkt met reportergroepen in een tweede chemische stap. Dit wordt geïllustreerd in een protocol voor fluorescentie etikettering van histon H3 eiwit. Een kleine propargylgroep wordt overgebracht van de cofactor analoge SeAdoYn aan het eiwit door de histon H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 gevolgd door klik etikettering van dealkynylated histon H3 met TAMRA azide. MTase-gemedieerde labeling met cofactor analogen is een enabling technology voor veel spannende toepassingen, waaronder de identificatie en functionele studie van MTase ondergrond, alsmede DNA genotypering en methylatie-detectie.

Introduction

Specifieke kenmerken van nucleïnezuren ^1,2 en eiwitten ^3,4 is van groot belang voor de functionele karakteriseringen, medische diagnose en (nano) biotechnologie. Hier presenteren we een enzymatische labeling methode die biopolymeren die is gebaseerd op S -adenosyl-l-methionine (AdoMet of SAM) -afhankelijke methyltransferase (MTases). Deze klasse van enzymen (EC 2.1.1.) Richt afzonderlijke nucleofiele posities (stikstof, zuurstof, zwavel en koolstofatomen) binnen bepaalde residuen van nucleïnezuren en eiwitten en natuurlijk brengt de geactiveerde methylgroep van de cofactor AdoMet (figuur 1A) ^5. Bovendien kunn....

Protocol

1. Algemene instructies

1. WINKEL aziridine cofactor 6BAz (in DMSO) en proteïne MTase Set7 / 9 bij -80 ° C en alle andere reagentia zoals dubbele-geactiveerde cofactor SeAdoYn en DNA MTase M.BseCI (in 50% glycerol) bij -20 ° C.
2. Bepaal de concentratie van 6BAz en SeAdoYn via UV / Vis spectroscopie met behulp van de extinctiecoëfficiënten ε _269nm (6BAz) = 16.000 cm ^-1 M ^-1 en ε _{260 nm} (SeAdoYn) = 15.400 cm ^-1 M ^-1 in gedeïoniseerd water. Bepaal de concentratie van MTases door de Bradford assay of, indien de extinctiecoëfficiënt is beschikbaar via directe absorptie bij ....

Results

One-step Labeling van DNA via Aziridine Cofactoren

Dit voorbeeld reactie wordt uitgevoerd met het DNA MTase M.BseCI, waarbij de tweede adenine residu wijzigt in het dubbelstrengs 5'-ATCG A T-3 'sequentie en heeft een herkenningsplaats op het pBR322-plasmide (figuur 4A). Om plasmide labeling testen, is pBR322 uitgedaagd met het restrictie endonuclease (Rease) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI zeven plaatsen op pBR322, waarvan één in de M.B.......

Discussion

One-step etikettering van DNA met DNA MTases en aziridine- cofactoren (Glimlachend DNA) is een robuuste methode, maar sommige aspecten moeten worden overwogen bij de planning van het experiment.

Aziridine cofactor: De 6BAz concentratie DNA labeling met M.BseCI was 60 uM. Wanneer andere DNA MTases de cofactor concentratie worden geoptimaliseerd, bijvoorbeeld concentraties van slechts 20 pM werden toegepast bij de DNA MTase M.TaqI ^19. Lage 6BAz concentraties hebben.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6BAz			Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012.
β-Mercaptoethanol	Serva	28625
Acetic acid	Fisher Scientific	10304980
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Serva	10688
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100
Ammonium persulfate (APS)	Serva	13375
Bis-Tris	Gerbu	1304
Boric acid	Gerbu	1115
Bromophenol blue Na salt	Serva	15375
Copper(II) sulfate	Aldrich	C1297
Chloroform	Fisher Scientific	10020090
Coomassie Brilliant Blue	Serva	17525
EDTA disodium salt	Gerbu	1034
Ethanol	Merck	100983
GelRed (10,000x in water)	Biotium	41003
Glycerol (99.5%)	Gerbu	2006
FastRuler Low Range DNA Ladder	Thermo Scientific	SM1103
Histone H3			Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
M.BseCI			Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
Methanol	Fisher Scientific	10675112
Magnesiumchloride  hexahydrate	J.T. Baker	4003
MOPS	Gerbu	1081
Sodium chloride	Gerbu	1112
pH strip (Neutralit)	Merck	1,095,330,001
pBR322	Thermo Scientific	SD0041
R.TaqI (10 u/µl)	Thermo Scientific	ER0671
SeAdoYn			Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9			Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
Streptavidin	Gerbu	3058
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma Life Science	A7631
SDS Granular	Gerbu	1833
di-Sodium hydrogenphosphate	Merck	106,586
TAMRA azide			Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI buffer (10x)	Thermo Scientific	B28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Acros Organics	42058
Tris-HCl	Gerbu	1028
Tris-X (TRIS-base)	Gerbu	1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)	Sigma-Aldrich	762342