DNA en eiwitten sequentie-specifiek gemerkt met affiniteit of fluorescente reporter groepen met DNA of eiwit methyltransferases en synthetische analogen cofactor. Afhankelijk van de cofactor specificiteit van de enzymen, aziridine of dubbel geactiveerde cofactor analogen worden gebruikt voor één of twee stappen labeling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Sequentie-specifieke Labeling van nucleïnezuren en eiwitten met methyltransferases en Cofactor Analogues
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
S -Adenosyl-L-methionine (AdoMet of SAM) -afhankelijke methyltransferase (MTase) katalyseren de overdracht van de geactiveerde methylgroep van AdoMet specifieke posities in DNA, RNA, eiwitten en kleine biomoleculen. Deze natuurlijke methylering reactie kan worden uitgebreid naar diverse alkyleringsreacties met synthetische analoga cofactor. Vervanging van het reactieve sulfonium centrum van AdoMet een aziridinering leidt tot cofactoren die kunnen worden gekoppeld met DNA van verschillende DNA MTases. Deze aziridine cofactoren kunnen worden uitgerust met reportergroepen op verschillende posities van de adenine eenheid en voor S equence specifieke M ethyltransferase- I nduced L abel ing van DNA (lachend DNA). Als voorbeeld geven we een protocol voor biotinylering van pBR322 plasmide DNA bij de 5'-ATCG A T-3 'sequentie van het DNA MTase M.BseCI en aziridine cofactor 6BAz ineen stap. Verlenging van de geactiveerde methylgroep met onverzadigde alkylgroepen resultaten in andere klasse van AdoMet analogen die gebruikt worden voor m-ethyltransferase gerichte T ransfer van A ctivated G de andere groepen (mTAG). Aangezien de uitgebreide zijketens worden geactiveerd door het sulfonium- midden en de onverzadigde binding, worden deze cofactoren genoemd dubbel geactiveerde AdoMet analogen. Deze analogen niet slechts als cofactoren voor DNA MTases, zoals aziridine cofactoren, maar ook voor RNA, eiwitten en kleine moleculen MTases. Ze worden doorgaans gebruikt voor enzymatische modificatie van MTase substraten met unieke functionele groepen die zijn gemerkt met reportergroepen in een tweede chemische stap. Dit wordt geïllustreerd in een protocol voor fluorescentie etikettering van histon H3 eiwit. Een kleine propargylgroep wordt overgebracht van de cofactor analoge SeAdoYn aan het eiwit door de histon H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 gevolgd door klik etikettering van dealkynylated histon H3 met TAMRA azide. MTase-gemedieerde labeling met cofactor analogen is een enabling technology voor veel spannende toepassingen, waaronder de identificatie en functionele studie van MTase ondergrond, alsmede DNA genotypering en methylatie-detectie.
Inleiding
Specifieke kenmerken van nucleïnezuren 1,2 en eiwitten 3,4 is van groot belang voor de functionele karakteriseringen, medische diagnose en (nano) biotechnologie. Hier presenteren we een enzymatische labeling methode die biopolymeren die is gebaseerd op S -adenosyl-l-methionine (AdoMet of SAM) -afhankelijke methyltransferase (MTases). Deze klasse van enzymen (EC 2.1.1.) Richt afzonderlijke nucleofiele posities (stikstof, zuurstof, zwavel en koolstofatomen) binnen bepaalde residuen van nucleïnezuren en eiwitten en natuurlijk brengt de geactiveerde methylgroep van de cofactor AdoMet (figuur 1A) 5. Bovendien kunn....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Algemene instructies
- WINKEL aziridine cofactor 6BAz (in DMSO) en proteïne MTase Set7 / 9 bij -80 ° C en alle andere reagentia zoals dubbele-geactiveerde cofactor SeAdoYn en DNA MTase M.BseCI (in 50% glycerol) bij -20 ° C.
- Bepaal de concentratie van 6BAz en SeAdoYn via UV / Vis spectroscopie met behulp van de extinctiecoëfficiënten ε 269nm (6BAz) = 16.000 cm -1 M -1 en ε 260 nm (SeAdoYn) = 15.400 cm -1 M -1 in gedeïoniseerd water. Bepaal de concentratie van MTases door de Bradford assay of, indien de extinctiecoëfficiënt is beschikbaar via directe absorptie bij ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
One-step Labeling van DNA via Aziridine Cofactoren
Dit voorbeeld reactie wordt uitgevoerd met het DNA MTase M.BseCI, waarbij de tweede adenine residu wijzigt in het dubbelstrengs 5'-ATCG A T-3 'sequentie en heeft een herkenningsplaats op het pBR322-plasmide (figuur 4A). Om plasmide labeling testen, is pBR322 uitgedaagd met het restrictie endonuclease (Rease) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI zeven plaatsen op pBR322, waarvan één in de M.B.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
One-step etikettering van DNA met DNA MTases en aziridine- cofactoren (Glimlachend DNA) is een robuuste methode, maar sommige aspecten moeten worden overwogen bij de planning van het experiment.
Aziridine cofactor: De 6BAz concentratie DNA labeling met M.BseCI was 60 uM. Wanneer andere DNA MTases de cofactor concentratie worden geoptimaliseerd, bijvoorbeeld concentraties van slechts 20 pM werden toegepast bij de DNA MTase M.TaqI 19. Lage 6BAz concentraties hebben.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs maken de volgende concurrerende financiële belangen bekend: E.W. is uitvinder van gerelateerde patenten.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Kerstin Glensk voor het voorbereiden van de MTases M.BseCI en Set7/9 en erkennen met dank de financiering door de Excellence Initiative van de Duitse federale en deelstaatregeringen en RWTH Aachen University. De auteurs zijn blij om 6BAz en SeAdoYn of andere cofactor-analogen te verstrekken voor samenwerkingsonderzoek.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 6BAz | Gesynthetiseerd volgens Weinhold et al., Patentnummer US 8.129.106, gepubliceerd op 6 maart 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Azijnzuur | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acryamide/Bis-oplossing, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammoniumpersulfaat (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boorzuur | Gerbu | 1115 | |
| Broomfenolblauw Na-zout | Serva | 15375 | |
| Koper(II)sulfaat | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Briljant Blauw | Serva | 17525 | |
| EDTA dinatriumzout | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10.000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99,5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressieplasmide verkregen van Dr. Philipp Voigt en Prof. Danny Reinberg; expressie en isolatie volgens T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressieplasmide verkregen van Dr. Michael Kokkinidis; expressie en isolatie volgens Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydraat | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Natriumchloride | Gerbu | 1112 | |
| pH-strip (Neutralit) | Merck | 1.095.330.001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/μl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Gesynthetiseerd volgens Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressieplasmide verkregen van Prof. Danny Reinberg, expressie en isolatie volgens D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidine | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Natrium L-ascorbinezuur | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granulair | Gerbu | 1833 | |
| di-Natriumwaterstoffosfaat | Merck | 106.586 | |
| TAMRA azide | Gesynthetiseerd volgens referentie 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI-buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethyleendiamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
Referenties
- Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
