Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Samenvatting

Na exocytose wordt het gefuseerde plasmamembraan teruggewonnen via een proces dat bekend staat als endocytose. Dit mechanisme vormt nieuwe synaptische blaasjes voor de volgende ronde van afgifte. Individuele endocytische gebeurtenissen worden vastgelegd en geanalyseerd door middel van cel-gebonden capacitieve opnames in muisbijnierchromaffinecellen.

Samenvatting

Neuronale transmissie is een integraal onderdeel van cellulaire communicatie in de hersenen. Depolarisatie van het presynaptische membraan leidt tot fusie van blaasjes, bekend als exocytose, die synaptische transmissie mediëren. Het vervolgens ophalen van synaptische blaasjes is noodzakelijk om nieuwe, met neurotransmitter gevulde blaasjes te genereren in een proces dat bekend staat als endocytose. Tijdens exocytose zal het fuseren van blaasmembranen resulteren in een toename van het oppervlak en de daaropvolgende endocytose resulteert in een afname van het oppervlak. Hier toont ons lab een basisintroductie van cel-gehechte capaciteitsopnames van enkele endocytische gebeurtenissen in de muizen bijnier chromaffine cel. Dit type elektrische opname is nuttig voor hoge resolutie opnames van exocytose en endocytose op het niveau van een enkele blaasjes. Hoewel deze techniek zowel blaasjes exocytose als endocytose kan detecteren, ligt de focus van ons lab op blaasjes endocytose. Bovendien stelt deze techniek ons in staat om de kinetiek van enkele endocytische gebeurtenissen te analyseren. Hier worden de methoden voor de dissectie van muisbijnierweefsel, chromaffine celcultuur, basis cel-gehechte technieken en daaropvolgende voorbeelden van individuele sporen die een enkele endocytische gebeurtenis meten, beschreven.

Inleiding

Synaptische transmissie gemedieerd door exocytose van neurotransmitter bevattende synaptische blaasjes en deze vesicles moeten lokale endocytische recycling in het zenuwuiteinde ondergaan neuronale communicatie op lange termijn. Gezien de essentiële rol van synaptische transmissie in de hersenen, het begrijpen van de moleculaire machinerie die vormt het synaptische vesikel cyclus is een essentiële basis op weg naar een beter begrip van de cellulaire communicatie als geheel. Onder cel modelsystemen, heeft de adrenale chromaffine cel aantal van de meest definitieve inzichten in de moleculaire machinerie onderliggende synaptische vesikel recycling. Exocytose, de laatste stap in neurotransmitter afgifte, is enorm bestudeerd en door gebruikmaking van de adrenale chromaffine cel ^1,2 onderzocht. In feite zijn de meeste van de moleculaire spelers die de vorming, targeting, docking, en fusie van secretoire korrels orkestreren geïdentificeerd als gevolg van toepassing van diverse technieken chromaffinecellen ^1. Bovendien, door de mogelijkheid om voor eenmalig vesicle resolutie van het eiwit machine betrokken exocytose, de chromaffine cel nog altijd een model op de vragen van de vesikel fusie ³ pakken.

Cel verbonden capaciteitsmetingen werden eerst gebruikt bij het ​​oplossen van enkele vesikel fusie gedurende exocytose ^3. Exocytosis vesicles van slechts ~ 60 nm in diameter is aangetoond worden gedetecteerd door celmembraan toegang metingen met de patch clamp techniek in de cel bijgevoegde configuratie ^4-7. Toegang wordt gedefinieerd als een maat voor hoe gemakkelijk een circuit of apparaat zal een stroom vloeien; is de inverse van impedantie. Aldus toelating metingen geven inzicht in de membraancapaciteit. Dit wordt bewerkstelligd door de opname van de vesiculaire membraan in de plasmamembraan; deze integratie blijkt dat er veranderingen in het oppervlakGebied ^8. Elke fusing blaasje zorgt voor een stapsgewijze verhoging van de membraan capaciteit ^9,10. Daarnaast biedt deze toegang meting geeft het membraan geleidbaarheid en het fusie porie geleiding tijdens een exocytotische event ^3. Omdat deze techniek een uniek instrument op het identificeren van enkel-blaasje kinetiek tijdens exocytose heeft verstrekt, heeft ons lab onlangs toegepast dit concept tot endocytose van enkele blaasjes ^11,12 detecteren.

Onze specifieke belang clathrine gemedieerde endocytose (CME), die is beschouwd als een fundamenteel housekeeping component in vele cellen ¹³ en als een belangrijke route voor synaptische blaasjes endocytose in neuronale terminals ^14,15. CME is bekend biologisch belangrijk te zijn, echter, zijn de kinetiek nog niet goed begrepen door technische beperkingen bij het toezicht enkelvoud endocytisch evenementen. Gezien de overeenkomsten in exocytische mechanismen tussen chromaffin cellen en neuronen ^1, is het plausible dat de kernsplijting mechanismen in chromaffinecellen waarschijnlijk kan gelden voor synaptische blaasjes endocytose in neuronen. De cel bijgevoegde capaciteitsmetingen zijn gebruikt volgen individuele endocytische gebeurtenissen en de splitsing kinetiek, die de meeste methoden niet kunnen opgelost analyseren. In onze cel bevestigd opnames wordt een sinus bij 20 kHz weergegeven over het houden van potentieel, en de output stroom wordt gescheiden in membraan geleiding in het ene kanaal en membraan capaciteit in het andere kanaal van een twee-fase lock-in versterker ^{16- 18.} Van de veranderingen in het membraan geleiding en capaciteit, kan men de kinetiek van de splitsing poriën, die waarschijnlijk overeenkomt met het buisvormige membraan hals dat de internaliserende blaasje verbinding met de plasmamembraan vóór vesikel pinch-off berekenen. Collectief, deze techniek geeft ons de gelegenheid om de regulerende mechanismen van blaasje kernsplijting onderzoeken tijdens CME.

Protocol

OPMERKING: De hele procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health, zoals goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Illinois in Chicago.

1 Solutions en cultuur Media Voorbereidingen

1. Houd alle oplossingen bij -20 ° C gedurende maximaal zes maanden. Houd het kweekmedium bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
2. Bereiding van 100 ml van de cultuur media door het mengen van 1 ml van pen-strep-oplossing en 1 ml van ITSX (insuline-transferrine-Selenium-Suppletie) om met DMEM 100 ml.
3. Bereid enzymoplossing door het mengen van 250 ml DMEM, 2,5 ml 100 mM _CaCl2 en 2,5 ml van 50 mM EDTA.
4. Bereid inactivering oplossing door het mengen van 225 ml DMEM, 25 ml FBS, 625 mg albumine en 625 mg trypsine inhibitor.
5. Bereid een Locke's oplossing van 154 mM NaCl, 5,6 mM KCI, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5.6 mM glucose. Breng de pH op 7,3 met NaOH.
6. Bereid een poly-d-lysine (PDL) oplossing van 50 mg / ml. Gebruik een eindconcentratie van 1 mg / ml te bekleden dekglaasjes.
7. Bereid een extracellulaire oplossing van 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, en 10 mM glucose. Breng de pH op 7,3 met NaOH met een osmolariteit van ~ 310 nmol / kg.
8. Bereid een pipet oplossing van 50 mM NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2 en 10 mM HEPES. Breng de pH op 7,3 met NaOH met een osmolariteit van ~ 290 nmol / kg.

2 bijnier Isolatie

1. Autoclaaf een paar grote en kleine dissectie schaar en twee paar pincetten. Draag handschoenen tijdens het hele proces en plaats de dissectie dienblad op een ijsemmer.
2. Gebruik muizen genomen op dag 0-3. Euthanaseren dieren met een onder druk CO ₂ tank, gevolgd door onthoofding.
3. Gebruik maken van de kleinere set van schaar om naar aanleiding van de wervelkolom van cervi bezuinigen de achterkant van de pup cal tot regio caudaal. Zorg ervoor dat u oppervlakkig snijden onder de huid en niet prikken in de lichaamsholte.
4. Vervolgens schil huid weg van de wervelkolom, zodat musculatuur wordt blootgesteld aan een duidelijk beeld van de wervelkolom hebben. Vanaf hier, maak een transectional cut bij het cervicale ruggenmerg en vervolgens twee parallelle sneden langs de zijden van de wervelkolom.
5. Met een pincet het vasthouden van de belangrijkste lichaam van het dier, gebruik de andere tang om de wervelkolom te grijpen en te pellen terug wervelkolom tot nieren worden blootgesteld.
6. Momenteel visualiseren bijnieren bovenop de nieren. Vervolgens voorzichtig plaats de twee klieren van elk dier in een conische buis gevuld met Locke's oplossing.
   OPMERKING: Soms zijn de klieren zal vasthouden aan de tang. In dat geval gebruikt voorzichtig een tang om te helpen bij de verwijdering van de klieren van de tang en in de Locke's oplossing. De klieren in deze toestand gehouden tot 2 uur.

e "> 3. Tissue Spijsvertering

1. Ondertussen bel de enzymoplossing met 5% _CO2 + 95% _O2 gedurende 15 min vóór gebruik. Zorg ervoor dat het evenwicht gebracht oplossing verandert van een heldere roze kleur in roze / oranje kleur.
2. Voeg de papaïne op recent borrelde enzymoplossing bij een uiteindelijke concentratie van 20-25 eenheden / ml. Incubeer elk paar klieren van elk dier voor 40-60 min bij 37 ° C in de enzymoplossing met papaïne.
3. Voeg 75% inactivering oplossing aan elke buis en incubeer bij 37 ° C gedurende nog 10 minuten. Deze incubatie inactiveert de enzymactiviteit van papaïne.
4. Na de 10 minuten incubatie met de inactivatie oplossing, voorzichtig overdracht van de klieren in een nieuw label buis en spoel daarna de klieren 3x met cultuur media.

4 Cel Dissociatie en Plating

1. Na het wassen, plaats de twee klieren in 200 ul van de cultuur media en dan zachtjes titreer de klieren enbeneden door de pipetpunt met een 200 ul pipet totdat er niet langer een groot stuk weefsel in de oplossing.
   OPMERKING: Bij titreren, handhaven klieren aan de onderkant van de buis met een neerwaartse kracht van 200 ul pipetpunt en grijpen het weefsel voorzichtig en langzaam. Wees er zeker van te langzame, continue bewegingen te gebruiken, nooit pipetteren snel of abrupt.
2. Voeg een extra 250 ul cultuur media om het totale volume van de cultuur media tot 450 ul brengen.
3. Plaat 60 gl van deze cel-bevattende oplossing op elk van zeven 12 mm PDL-pre-beklede dekglaasjes, die in een 60 x 15 mm kweekschaal geplaatst.
4. Eenmaal geplateerd, zet de schaal in de incubator die op 37 ° C gehouden en met een constante stroom / toevoer van 5% _CO2 gedurende 30 minuten om een omgeving voor cellevensvatbaarheid waarborgen. Na incubatie voorzichtig 5 ml voorverwarmde kweekmedium in de kweekschaal en keren de schaal terug in de incubator gedurende 24 uur voorafgaand aan cel-attached opnamen.
   OPMERKING: Gewoonlijk kunnen de cellen worden gebruikt voor elektrofysiologische opnames tot 4 dagen.

5 Cel Identificatie en Gigaohm Seal Vorming

1. Plaats de 12 mm dekglaasje in extracellulaire oplossing. Aangezien de gehele bijnieren voor celbereiding, meng de chromaffine cellen (typisch zeer helder met een bruine / beige kleur en een bijna perfecte cirkelvorm (figuur 1) in kweek met corticale cellen (kleiner en zwakker dan chromaffinecellen).
2. Trek de patch pipetten in vier stappen met behulp van een programmeerbare P-97 trekker. Dompel de pipet in een gesmolten was, die zal helpen om de capaciteit van het glas te verminderen en vervolgens het vuur polish de tip om "blow-away" deze was van de binnenkant van de pipet tip.
   OPMERKING: Wanneer gevuld met patch pipetoplossing, patch pipetten hebben meestal een weerstand van ~ 2 MQ.
3. Nader de patch pipet dichtbij de cel binnen enkele microns. Een-cel aangesloten configuratie bereiken kijken voor een kleine cel vervorming tijdens de nadering van de patch pipet dichter bij de cel. Solliciteer zachte zuigkracht tot een GQ afdichting wordt bereikt.

6-Cell Attached Capaciteit Recordings

1. Zodra een GQ afdichting wordt geopenbaard, maak-cel aangesloten opnamen door middel van een EPC-7 plus patch-clamp versterker en een tweefasen analoog invangversterker (zie bijgevoegde tabel apparatuur). Breng een sinus met een amplitude van 50 mV (rms) en de frequentie van 20 kHz van de lock-in versterker.
2. Stel het uitgangsfilter van de lock-in versterker 1 msec tijdconstante en 24 db. Stel de fase van de lock-in versterker zodanig dat voorbijgaande capaciteitsveranderingen door zachte zuigkracht pulsen alleen in de patch capaciteit (Im) trace zonder uitsteeksel in de patch geleiding (Re) trace weergegeven (figuur 2).
   OPMERKING: Zie de details voor de kalibratie van het systeem in reFerence 19.
3. Identificeer typische capaciteitsveranderingen door "omlaag" stappen (figuur 3).
   OPMERKING: Een stevige opname wordt gezien als een "trap" type gelijkenis met vele neerwaartse stappen, die aangeeft internaliserende enkele vesicles. De patching proces dient als een mechanische stimulatie sinds actie huidige doorgaans kan worden opgenomen van de meeste cellen.
4. Bestanden als afzonderlijke mappen inclusief datum: dd / mm / jaar en elke cel aangesloten opname als zijn eigen individuele nummering (xx) in dat bestand.

Resultaten

De cellevensvatbaarheid en de kwaliteit van gigaohm afdichting kritisch bij het bepalen van de kwaliteit van het cel aangesloten capaciteit opnamen. Daarom is het essentieel om een effectieve en efficiënte celkweek schaffen voor elektrofysiologische opnames, en typische levensvatbare cellen zijn geïllustreerd in figuur 1. Practice en tijd nuttig in het bereiken van een gigaohm zegel met hoge kwaliteit. Als men duidelijk kan zien celvervorming wanneer de patch pipet nadert de cel zoals beschreven in prot...

Discussie

-Cel bevestigd capacitieve metingen vereisen een aantal cruciale stappen om opnames met een hoge kwaliteit met succes te verkrijgen: 1) levensvatbare en gezonde cellen bereid uit bijnieren; 2) PDL coating van de dekglaasjes; 3) gigaohm afdichting formatie; 4) geluidsniveau van het systeem; en 5) fase correctie.

Voor dierlijke chirurgie, wijzigingen kan men mogelijk te maken is om de chirurgische benadering van de beste pak behendigheid te passen en om schade tijdens dissectie te voorkomen. D...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Beschermen tegen UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Alleen ontdooien op IJS!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Buitendiamter: 1,5 mm Binnendiameter: 1,10 mm Lengte: 10 cm