Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Summary

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Abstract

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introduction

Synaptische transmissie gemedieerd door exocytose van neurotransmitter bevattende synaptische blaasjes en deze vesicles moeten lokale endocytische recycling in het zenuwuiteinde ondergaan neuronale communicatie op lange termijn. Gezien de essentiële rol van synaptische transmissie in de hersenen, het begrijpen van de moleculaire machinerie die vormt het synaptische vesikel cyclus is een essentiële basis op weg naar een beter begrip van de cellulaire communicatie als geheel. Onder cel modelsystemen, heeft de adrenale chromaffine cel aantal van de meest definitieve inzichten in de moleculaire machinerie onderliggende synaptische vesikel recycling. Exocytose, de laatste....

Protocol

OPMERKING: De hele procedure werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health, zoals goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Illinois in Chicago.

1 Solutions en cultuur Media Voorbereidingen

1. Houd alle oplossingen bij -20 ° C gedurende maximaal zes maanden. Houd het kweekmedium bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
2. Bereiding van 100 ml van de cultuur media door het mengen van 1 ml van pen-strep-oplossing en 1 ml van ITSX (insuline-transferrine-Selenium-Suppletie) om met DMEM 100 ml.
3. Bereid enzymoplossing door het mengen van 250 ml D....

Results

De cellevensvatbaarheid en de kwaliteit van gigaohm afdichting kritisch bij het bepalen van de kwaliteit van het cel aangesloten capaciteit opnamen. Daarom is het essentieel om een effectieve en efficiënte celkweek schaffen voor elektrofysiologische opnames, en typische levensvatbare cellen zijn geïllustreerd in figuur 1. Practice en tijd nuttig in het bereiken van een gigaohm zegel met hoge kwaliteit. Als men duidelijk kan zien celvervorming wanneer de patch pipet nadert de cel zoals beschreven in prot.......

Discussion

-Cel bevestigd capacitieve metingen vereisen een aantal cruciale stappen om opnames met een hoge kwaliteit met succes te verkrijgen: 1) levensvatbare en gezonde cellen bereid uit bijnieren; 2) PDL coating van de dekglaasjes; 3) gigaohm afdichting formatie; 4) geluidsniveau van het systeem; en 5) fase correctie.

Voor dierlijke chirurgie, wijzigingen kan men mogelijk te maken is om de chirurgische benadering van de beste pak behendigheid te passen en om schade tijdens dissectie te voorkomen. D.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm