Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie

Samenvatting

Brain myeloïde cellen karakterisatie volgende slag kan worden uitgevoerd door stereology de optische fractioneerinrichting methode of een flowcytometrische analyse van hersenen leukocyten suspensies. Beide zijn nuttige technieken om een ​​nauwkeurige fenotypische onderscheiding van de belangrijkste myeloïde cel subsets in de ischemische hersenen voeren.

Samenvatting

Microglia activatie en extravasatie van hematogene macrofagen en neutrofielen, wordt aangenomen dat het een belangrijke rol in spelen hersenletsel na een beroerte. Deze myeloïde cel subpopulaties kunnen verschillende fenotypes en functies weer te geven en worden onderscheiden en worden gekenmerkt om hun regelgeving en de bijdrage tot weefselschade te bestuderen. Dit protocol biedt twee verschillende methoden voor de hersenen immuun cel karakterisering: een nauwkeurige stereological aanpak en een flowcytometrische analyse. De stereological benadering is gebaseerd op de optische fractioneerinrichting methode, waarbij het totale aantal cellen berekent in een gebied van belang (infarct hersenen) geschat door systematisch steekproefsgewijs. De tweede kwalificatie aanpak is een eenvoudige manier om hersenen leukocyten suspensies isoleren en te karakteriseren door flowcytometrie, waardoor de karakterisering van microglia, geïnfiltreerd monocyten en neutrofielen van het ischemische weefsel. Daarnaast ook dIJZE een cerebrale ischemie model in muizen die uitsluitend van invloed op de hersenen cortex, het genereren van zeer reproduceerbare infarcten met een lage sterfte, en de procedure voor de histologische bewerking hersenen om infarctvolume karakteriseren door de Cavalieri methode.

Inleiding

Morfologische, fenotypische en genexpressie veranderingen van microglia, en extravasatie en activering van hematogene macrofagen en neutrofielen worden verondersteld een belangrijke rol spelen bij de pathofysiologische cascade na hersenletsel ^1-4. Dit protocol geeft twee benaderingen schatting het aantal verschillende myeloïde cel subsets van de ischemische hersenen en hun fenotypische karakterisatie voeren. Daarnaast beschrijft ook een experimenteel model van cerebrale ischemie in muizen, die bestaat uit de tijdelijke of permanente ligatie van beide distale midden cerebrale slagader (MCA) en de gemeenschappelijke halsslagader (CCA), inclusief hoe het infarct evalueren Door de nauwkeurige Cavalieri methode waarbij een stereological software.

De eerste benadering myeloïde cel subsets karakteriseren van de ischemische hersenen een stereological basis van de optische fractioneerinrichting benadering ^5. Dit is de meestveelgebruikte stereological sonde in life sciences en biedt een hoge mate van precisie met lage coëfficiënten van fouten ^5-7. Dit is de beste keuze voor mobiele kwantificering wanneer het weefsel wordt gesneden in secties, zoals het voorkomt de bias op mobiele schatting omwille van de versnippering van het weefsel in secties. Deze methode is een zeer krachtige manier om cijfers, dynamiek en fenotypische veranderingen geïnfiltreerd neutrofiel subpopulaties van het ischemische weefsel ⁸ karakteriseren.

De tweede karakterisering benadering is gebaseerd op een gemodificeerd protocol van Campanella en medewerkers ^9, die op een eenvoudige manier hersenen leukocyten suspensies isoleren en te karakteriseren door flowcytometrie bepaald. In tegenstelling tot conventionele immunohistochemische technieken, flowcytometrie karakterisering maakt onderscheid tussen microglia (CD45 ^lo CD11b ⁺⁾ en geïnfiltreerd myeloïde cellen (CD45 ^hi CD11b ⁺⁾ op basis van hun diffErent expressie van CD45 ^9-13. Bovendien, pro-inflammatoire monocyten (CD45 ^hi CD11b ⁺ Ly-6G ^- Ly-6C ^hi), neutrofielen (CD45 ^hi CD11b ⁺ Ly-6G ⁺⁾ en andere leukocyten subsets van het ischemische weefsel te onderscheiden. Deze aanpak zorgt voor een betrouwbare en snelle test om neuroinflammation beoordelen in experimentele modellen van de hersenen ischemie. Echter, Weefselbewerkingswerkwijze de activeringstoestand en nummers van de verschillende celpopulaties in het ischemische weefsel die een semi-kwantitatieve karakterisering beïnvloeden.

Protocol

OPMERKING: Alle experimentele protocollen gehandeld op grond van de richtlijnen van de Animal Welfare Comité van de Universidad Complutense (volgende EU-richtlijnen 86/609 / EEG en 2003/65 / CE).

1. cerebrale ischemie Model

OPMERKING: De cerebrale ischemie model in deze paper gaat om permanente of voorbijgaande occlusie van beide CCA (halsslagader) en MCA (midden cerebrale slagader) door ligatie met een nylon hechtdraad.

1. Pre-operatieve preparaten
   1. Steriliseren alle chirurgische instrumenten in een autoclaaf of met een glas kraal sterilisator. Desinfecteer het chirurgische gebied met 70% ethanol ook.
   2. Verdoven muis met de juiste verdoving. Bereiken inductie door isofluraan 2,5% en onderhouden door isofluraan 1,5% in een mengsel van 80% lucht / 20% zuurstof met een verdamper. Pas kunstmatige tranen om de muizen ogen tot droog te voorkomen tijdens het onder narcose.
   3. Plaats de muis op een verwarmingselement dat gekoppeld is aan een vergoedingdback apparaat met een temperatuursonde geplaatst in het rectum en de ingestelde temperatuur in fysiologische hoeveelheden (36,5 ± 0,5 ° C) gedurende de chirurgische procedure.
2. Carotis communis occlusie door ligatie
   1. Plaats de muis op de rug gelegd en immobiliseren met tape. Ontsmet de huid met 70% ethanol of povidon-jodide en knip het haar van de bovenste ventrale deel.
   2. Onder een chirurgische microscoop, maak 1 cm middellijn incisie rond het ventrale oppervlak van de hals.
   3. Uit elkaar trekken alle zachte weefsels (klierweefsel inclusief sub-bovenkaak, sublinguale en speekselklieren) en identificeren van de linker carotis communis (CCA), die lateraal is gelokaliseerd aan de luchtpijp. Trek de spieren en links CCA bloot. Zorgvuldig ontleden van nervus vagus.
   4. Eenmaal ontleed, af te sluiten links CCA door een ligatuur met behulp van een 6/0 nylon hechtdraad. Afbinden met een permanente knoop of een Slipknot (tot reperfusie worden uitgevoerd als een voorbijgaande cerebrale ischemie model gewenst is).
   5. Plaats het klierweefsel in de oorspronkelijke positie en sluit de incisie op de hals huid met een 6/0 nylon hechtdraad.
      OPMERKING: Sham dieren worden onderworpen aan dezelfde operatie als MCAO dieren, maar de CCA is niet afgesloten.
3. Distale midden cerebrale slagader occlusie door ligatie
   1. Plaats de muis op zijn rechterkant en immobiliseren met tape. Ontsmet het hoofd huid met 70% ethanol of povidon-jodide en knip het haar van de muis hoofd (verwijder haren na het snijden).
   2. Onder een chirurgische microscoop, maak huidincisie tussen het oog en het oor. Beweeg de huid weg en houd hem met tape.
   3. Maak een horizontale incisie op de temporale spier van rechts naar links. Maak dan een tweede verticale incisie aan de rechterkant van de temporale spier (wees voorzichtig om tijdelijke cut ader te vermijden). Uit elkaar trekken van de temporale spier uit de schedel en houd het met een hechting aan een schone schedel oppervlak te behouden.
   4. Reinig de schedel oppervlakmet koude steriele zoutoplossing om de exacte positie van de linker midden cerebrale slagader (MCA) via schedel transparantie detecteren. Voer een ronde craniotomie (1 mm in diameter) met een roestvrij stalen braam in de frontale kwab tussen de jukbeenboog en de squamosal bot. Verwijder zorgvuldig de schedel en het MCA bloot.
   5. Breng een kleine hoeveelheid koude steriele zoutoplossing op het oppervlak van de hersenen en verwijder de hersenvliezen (dura mater en arachnoïd) met behulp van een tang.
   6. Voer ligatie van de linker MCA in de distale stam net voor de splitsing tussen de voorste en achterste MCA takken. Occlude links MCA door een ligatuur met behulp van een 9/0 nylon hechtdraad. Afbinden met een permanente knoop of een Slipknot (tot reperfusie worden uitgevoerd als een voorbijgaande cerebrale ischemie model gewenst is). De periode tussen de CCA en MCA occlusie is ongeveer 10-20 minuten, afhankelijk van de ervaring van de operator.
   7. Plaats de temporale spier in zijn oorspronkelijke positie en sluit de incision op de huid hals met een 6/0 nylon hechtdraad.
   8. Zet de muis om de kooi te herstellen van de anesthesie (meestal 5-10 min) en injecteer de muis met buprenorfine intraperitoneale (IP) (0,3 mg / kg).
      1. Toezien op de muis voor meerdere uur tot enig ongemak te sporen (de muis niet onbeheerd achter, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging te behouden). Aangezien post-operatieve gewicht verloren algemeen wordt waargenomen, plaatst gepureerd voedsel in een petrischaal te eten te vergemakkelijken.
   9. Als het dier volledig is hersteld, terug te keren naar het gezelschap van andere dieren.
   10. Als een tijdelijke MCAO model de verdoven de muis opnieuw en verwijder het slipknot van de CCA en de MCA reperfusie mogelijk (gewoonlijk tussen 0,5-2 h (figuur 1)).
       OPMERKING: Sham dieren worden onderworpen aan dezelfde operatie als MCAO dieren, maar het MCA is niet afgesloten.

2. perfusie en sectioning van Brain Tissue

1. 24 of 48 uur na MCAO, offeren de muis met een letale dosis anestheticum (bijvoorbeeld natrium pentobarbital, IP 86 mg / kg of een overdosis met isofluraan).
2. Perfuseren de muis met fosfaatbuffer 0,1 M gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatbuffer (pH 7,4).
3. Verwijder de hersenen als volgt:
   1. Onthoofden het dier boven het ruggenmerg.
   2. Maak een posterior-anterior incisie op de huid van de kop om de schedel bloot te leggen. Maak twee zijdelingse sneden op de kruising van de zijwanden en de basis van de schedel en verwijder het stukje bot.
   3. Maak een snede door de schedel langs de pijlnaad.
   4. Verwijder de schedel ligt over elk halfrond met een tang om de hersenen bloot. Gebruik een spatel om de hersenen te scheiden van de schedel en breng deze in 4% PFA oplossing.
4. Post-fix voor 3 uur in 4% PFA oplossing bij 4 ºC.
5. Verwijder PFA oplossing en incubate de hersenen voor 48 uur in 30% sucrose-oplossing naar de hersenen cryoprotect.
6. Verwijder sucrose-oplossing en de hersenen snel in koud isopentaan (-40 ºC) te bevriezen. Store bevroren hersenen bij -80 ºC.
7. Verkrijgen coronale hersenen secties (30 micrometer) met een bevriezing microtoom. Verzamel tien seriële sets in een cryopreservative oplossing. Elke seriële set bestaat uit ongeveer 14-16 coronale plakjes met een interlamel afstand van 300 micrometer, die op adequate wijze proeven van de hersenen van muizen tussen 1,94 en -2,46 posterior naar bregma.

3. Nissl kleuring en infarctvolume Schatting

1. Nissl kleuring van cresylviolet
   1. Mount hersenen secties in een superfrost microscoop dia. Voor bepaling infarctvolume de Cavalieri werkwijze Nissl-gekleurde coupes gebruikt een 20/1 slice-steekproeffractie (1/2 delen van één van de tien serie sets in stap 2.7 verzameld, ongeveer, in totaal 7-8 secties met een interlamel afstand van 600 μ; M worden gebruikt). Wees voorzichtig om de juiste anterior-posterior oriëntatie te behouden (infarctgebied wordt geplaatst in de rechter kant).
   2. Presteren conventionele Nissl kleuring als volgt:
      1. Sta-slide gemonteerd secties te drogen gedurende enkele uren.
      2. Rehydrateren-slide gemonteerde profielen en vlekken met 0,1% cresylviolet oplossing gedurende 5 min.
      3. Dehydrateer met een gegradeerde reeks van EtOH (70%, 90% en 100%, 5 min per verandering). Reinig de-slide gemonteerde profielen met xyleen, voeg distrene-80 weekmaker xyleen (DPX) montage media en dek af met een glazen dekglaasje.
2. Met behulp van stereological software om de infarctvolume door de Cavalieri methode in te schatten Nissl gebeitst seriecoupes
   1. Gebruik in tabel 1 parameters infarct volume kwantificeren Cavalieri werkwijze ¹⁴ en een stereology systeem, dat bestaat uit een microscoop uitgerust met een camera, een computer XYZ gemotoriseerde fase en stereological software (The mainaanwijzingen hieronder zijn gerelateerd aan pc's, maar de richtingen kunnen verschillen voor andere besturingssystemen).
   2. Schakel de PC, microscoop, podium controller en camera in de juiste volgorde. Start de stereological software.
   3. Verplaats de 10X objectief op zijn plaats en selecteer de 10X uit het doel drop down menu.
   4. Verplaats u in de eerste-Nissl gekleurd sectie en vind een goed referentiepunt. Klik op de muis om het referentiepunt vast te stellen (om te bewegen rond het nodig is om actief de vreugde vrije knop).
   5. Schat de "gemonteerd snijdikte" (de werkelijke sectie dikte rekening houdend met de krimp). Toets "Focus positie Meter" en bereken de dikte van de bodem naar de top van de sectie.
   6. Maak een contour instrument voor de contralesional en ipsilesional gebieden en het infarct gebied.
      1. Klik op het menu "Display" en selecteer "Display Settings". Dit opent thij Schermresolutie.
      2. Selecteer het tabblad "Contouren" en klik op de knop "add Contour type".
      3. Maak een contour voor elke regio te kwantificeren en maken ze zichtbaar in de contour down menu. Klik op OK.
   7. Maak een Marker tool voor de contralesional en ipsilesional hemisferen en het infarct gebied.
      1. Klik op het menu "Display" en selecteer "Display Settings" om het dialoogvenster Weergave-instellingen te openen.
      2. Selecteer het tabblad "Markers" en verander de markers te noemen door te dubbelklikken op de beschikbare markers. Maak ze zichtbaar in het Marker Bar. Klik op OK.
   8. Activeer de sectie manager.
      1. Klik op het menu "Extra / Serial Section Manager". Voeg een nieuwe sectie met de "nieuwe sectie" knop. Deze knop opent het "Serial Sectie dialoogvenster Setup".
      2. Stel de "Blokkeer Advance" als 30 micrometer. Stel de"Gemonteerd snijdikte" met de in stap 3.2.5 geschatte waarde.
      3. Stel de "Evaluatie Interval" als 20. Gebruik een 1/20 slice steekproeffractie.
      4. Stel "het starten van sectie nummer" als 1. Stel de "Z-as waarde voor de top van de eerste sectie" als 0. Klik op OK.
   9. Teken een contour aan de contralaterale hemisfeer schetsen.
      1. Selecteer de Contralesional halfrond gereedschap (eerder gemaakt in de stap 3.2.6) van de contour down menu.
      2. Teken een contour aan de contralaterale hemisfeer schetsen.
      3. Om te eindigen het traceren van de contralesional halfrond, rechts klikken op de muis en selecteer "close contour".
   10. Schat de contralesional halfrond contour door Cavalieri.
       1. Klik op het menu "Probes" en selecteer Cavalieri Estimator. Stel "Rasterafstand" als 100 micrometer. Stel "Grid Rotation" als 0. Stel het "Block Advance "als 30 micrometer. Klik op OK.
       2. Selecteer "De contralesional halfrond" knop van de Markers Bar. Klik rechts binnenkant van de Contralesional halfrond contour.
       3. Selecteer "Paint Cavalieri Markers Mode". Klik met de rechtermuisknop in het contralesional halfrond contour opnieuw en selecteer "Paint Markers in Contour".
       4. Deactiveren Cavalieri Estimator door te klikken op sondes en Cavalieri Estimator en deactiveren de contralesional knop markering van de marker bar.
   11. Herhaal dezelfde procedure voor de ipsilesional halfrond en het infarct gebied (stappen 3.2.7 en 3.2.8). Sla de gegevens na de schatting van de oppervlakte van elke sectie.
   12. Bereken de contralaterale, ipsilesional en infarct gebieden in de rest van de Nissl-gekleurde coupe.
       1. Maak een nieuwe sectie als in stap 3.2.6. Laat het in de "Serial sectie Setup" dialoogvenster ingevoerde waarden niet wijzigen. Klik op OK.
       2. Herhaal stappen 3.2.7-3.2.8 in het nieuwe gedeelte.
   13. De resultaten van de kwantificering exporteren naar een spreadsheet bestand.
       1. Klik op "Probes" in de Stereo Investigator Menu. Selecteer "Display Probe Run List". Dit opent het "Vorige Stereologische Runs Dialog".
       2. Selecteer alle secties door te klikken op hen. Druk op de "Bekijk Resultaten" Button. Dit opent "de Cavalieri Estimator Resultaten" waarbij de geschatte oppervlakte en volume voor elke regio worden weergegeven.
       3. Om de resultaten naar een spreadsheet-bestand te exporteren, klikt u op de "Kopieer alle resultaten naar Klembord" en plakken naar een Excel-bestand met de belangrijkste resultaten verkregen uit elke regio (tabel 2).
   14. Express infarct volume ³ mm of% van de halve bol die infarct (% IH) volgens de formule ^15% IH = InfVol / ContrVol * 100, waar

ove_content "> InfVol (Geïnfarceerde Tissue Volume) = ΣInfArea _i,
ContrVol (Contralesional halfrond Volume) = ΣContrArea _i

4. Stereologische Kwantificering van geïnfiltreerd neutrofielen na cerebrale ischemie door de Optical Fractionator

1. Kleuring van de hersensecties:
   1. Voor het schatten van het totale aantal geïnfiltreerd neutrofielen na MCAO door de optische fractioneerinrichting ¹⁶ gebruikt een 10/01 plak steekproeffractie. Immunostain neutrofielen met behulp van conventionele immunofluorescentie technieken met rat anti-Ly6G antilichaam (1A8) en de juiste secundaire antilichaam op vrij zwevende gedeelten. Bovendien, een tegenkleuring met een nucleair maker zoals DAPI of TOPRO, hoewel het niet noodzakelijk neutrofielen identificatie kan vergemakkelijken het infarctgebied detecteren.
   2. Mount hersenen secties in een superfrost microscoop dia met het infarct gebied geplaatst in de rechterkant.
2. Quantificatie van geïnfiltreerd leukocyten in de ischemische hersenen van de optische fractioneerinrichting
   1. Gebruik parameters in tabel 3 geïnfiltreerde leukocyten in de ischemische hersenen gekwantificeerd door de optische fractioneerinrichting benadering een stereology systeem. Herhaal de stappen 3.2.1-3.2.5 uit paragraaf 3.
   2. Een contour instrument voor het infarctgebied zoals beschreven in stap 3.2.6 van het hoofdstuk 3.
   3. Een marker instrument neutrofielen zoals beschreven in stap 3.2.7 van het hoofdstuk 3.
   4. Activeer de sectie manager en maak een nieuwe sectie als in stap 3.2.8. In dit geval stelt u de "Evaluatie Interval" als 10 (een 1/10 slice steekproeffractie wordt gebruikt voor het schatten van neutrofielen nummer).
   5. Selecteer de "Geïnfarceerde Area" contour gereedschap (eerder gemaakt in de stap 4.2.1) van de contour down menu. Teken een contour om het infarct gebied te schetsen op 10X objectief. Verander de doelstelling om 100X te neutroph voerenil kwantificering (vergeet niet om de 100X kiezen uit de doelstelling drop down menu).
   6. Klik op het menu "Probes" en selecteer de "Optical Fractionator". Stel de "XY Plaatsing van het tellen van Frames" als 230 voor zowel de X- en Y-grid grootte. Stel "Grid Rotation" als 0. Stel de "Blokkeer Advance" als 30 micrometer. Klik op OK.
   7. Selecteer de "neutrofielen" knop van de Marker Bar. Mark gekleurd neutrofielen in het infarct gebied. Eenmaal afwerking, deactiveren de Optical Fractionator sonde door te klikken op "Probes" en "Optical Fractionator". Schakel de neutrofielen knop van de marker bar.
   8. Herhaal deze procedure voor elke sectie (4.2.4-4.2.9).
   9. De resultaten van de kwantificering exporteren naar een spreadsheet bestand.
      1. Klik op "Probes" in de Stereo Investigator Menu. Selecteer "Geef Probe Run List" aan de "Vorige Stereologische Runs" opendialoogvenster.
      2. Selecteer alle secties door te klikken op hen. Druk op de "Bekijk Resultaten" knop om te openen "de Optical Fractionator resultaten", waar het geschatte aantal neutrofielen wordt weergegeven.
      3. De resultaten naar een spreadsheet-bestand te exporteren door te klikken op de "Kopieer alle resultaten naar Klembord" en plakken naar een spreadsheet-bestand.

5. Hersenen Dissociatie en flowcytometrieanalyse

OPMERKING: Myeloïde subpopulatie karakterisering door flowcytometrie op verse hersenweefsel kan worden gebruikt als alternatief voor de voorgaande neutrofielen karakterisering uitgevoerd op vaste en immunostained hersencoupes.

1. Hersenen dissociatie en enkele celsuspensie voorbereiding
   1. Voeg 10 ml / dier van een RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) -Percoll oplossing bevattende 8 ml RPMI, 1 ml 30% Percoll en 1 ml van een 10x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing).
   2. Remove muizenhersenen MCAO zoals beschreven in stap 2.3.
   3. Onder een microscoop, ontleden kern en peri-infarct gebied van de ipsilaterale cortex van de hersenen ischemische muis (of een soortgelijk gebied voor sham en naïeve dieren) van de hersenen. Gewicht hersenweefsel en plaats deze in 5 ml ijskoude RPMI- Percoll (de gewichtsklasse kan voor normalisering tussen experimentele groepen worden uitgevoerd).
   4. Distantiëren het weefsel in een enkele celsuspensie met behulp van een Potter-Elvehjem-type weefsel slijpmachine met Teflon stampers.
   5. Transfer celsuspensies in een 50 ml ultracentrifuge buis en voeg 5 ml RPMI-Percoll oplossing voor de monsters.
   6. Centrifugeer de celsuspensies bij 7800 xg gedurende 30 min bij 25 ° C. Na centrifugeren garanderen een wit-gekleurde laag die overeenkomt met myeline wordt boven de oplossing.
   7. Verwijder de myelinelaag zorgvuldig en filteren de hele cel schorsingen, met inbegrip van de gepelleteerde cellen, door middel van 40-um nylon mesh strainer.
   8. Voeg 10 ml van RPMI op de zeef zodat alle cellen gefiltreerd en plaats de oplossing in een 50 ml buis. Voeg 30 ml RPMI en centrifugeer 50 ml celsuspensie bij 600 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
   9. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet leukocyten met 1 ml PBS. Voeg 4 ml lysisbuffer (150 mM _NH4Cl, 10 mM _NaHCO3 en 0,1 mM EDTA) en incubeer de cellen gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur om erytrocyten te lyseren van de celsuspensie. Centrifugeer de oplossing bij 600 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
2. Cell kleuring en flowcytometrie
   1. Bereid een etiket cocktail voor flowcytometrie, die 200 pl PBS-BSA (1%) 1: 100-Fc Block, 01:40 anti-CD45-PerCP rat, 01:40 anti-Ly6G-APC rat, 1:40 anti CD11b-FITC rat en 01:40 anti-Ly-6C-PE rat per monster.
   2. Resuspendeer de cellen in de etikettering cocktail en incubeer de monsters gedurende 45 min in ijs.
   3. Was de etikettering cocktailmet 1 ml koude PBS en centrifugeer de cellen bij 600 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met 100 ui FACS Flow en verwerven van de gehele celsuspensie door flowcytometrie.
   4. Gebruik een flowcytometrie analyse software te karakteriseren en kwantificeren celpopulaties.
      1. CD45 ^lo CD11b ^+:: Main leukocyten subsets overeenkomt met de etikettering cocktail bereide protocol kan als volgt worden gekarakteriseerd resident microglia cellen; CD45 ^hi CD11b ⁺ Ly-6G ^+: neutrofielen; CD45 ^hi CD11b ⁺ Ly-6G ^- Ly-6C ^hi: pro-inflammatoire monocyten.

Resultaten

De cerebrale ischemie model hier genereert infarcten uitsluitend waargenomen in de cortex zonder dat de striatale weefsels aangezien de lenticulostriatal takken van de MCA dat het striatum irrigatie niet afgesloten (figuur 1). Door Nissl kleuring, kan het beschadigde gebied worden geïdentificeerd als een hypochrome corticaal gebied (Figuur 2). Dit model wordt gekarakteriseerd door zeer reproduceerbare infarct volumes bij 24 uur na MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) geraamd Cavalieri werkwijze Nissl-gekleurde coupes (figuur 2). Schatting van het infarct volume Cavalieri werkwijze een nauwkeurige benadering met een lage fout die wordt weerspiegeld in de coëfficiënt van fouten (CE) van Gundersen in de contralesional en ipsilesional hemisferen en in het infarctgebied (tabel 2). Beschadigde volume weefsel kan worden uitgedrukt in ^mm3, maar ook als% IH met de formule in de sectie 3.2.13. Bovendien, de schattingvan het totale volume van de ipsilesional en contralesional regio maakt de berekening van oedeem index het infarct volume corrigeren en een overschatting van het beschadigde weefsel (tabel 2) te vermijden.

Gezien de seriële snijden verwerking van het hersenweefsel, kan deze worden benut om een nauwkeurige schatting van het totale aantal cellen subpopulaties voeren, zoals geïnfiltreerd neutrofielen, in het ischemische gebied, de optische Fractionator benadering (figuur 3 en tabel 4) met Tabel 3 parameters. Dit protocol schat totaal aantal neutrofielen (Ly6G-positieve cellen) in het infarctgebied van 23.328 ± 3623 op 24 uur en 82.856 ± 8.143 48 uur bij muizen na pMCAO (Figuur 3D). In overeenstemming met eerdere studies, is infiltratie van neutrofielen rechtstreeks gecorreleerd met de grootte van het infarct (figuur 3E). Schatting van tHij aantal neutrofielen door de optische Fractionator werkwijze een nauwkeurige benadering een lage fout die wordt gereflecteerd door de CE van Gundersen (tabel 4).

De leukocyten isolatie en flowcytometrie karakterisering protocol maakt de isolatie van 47.922 ± 23.174 myeloïde cellen van de cortex van de ipsilesional halfrond van ischemische muizen. Deze bestaat 10-30% van het totale gebeurtenissen in de celsuspensie. De meeste gevangen gebeurtenissen met dit protocol met een lage parameter FSC, geassocieerd met cellulaire resten (figuur 4). CD11b kleuring blijkt dat CD11b ⁺ cellen een hogere FSC waarde (figuur 4), wat suggereert dat celresten niet is gelabeld met deze marker en, zoals eerder aangegeven, dat verder onderzocht door de FSC drempel 200 ⁹ kunnen worden uitgesloten. De variabele hoeveelheid celresten verkregen met deze methode suggereert dat verschillen bij monster procesing (timing, behoud weefsel, temperatuur van het monster, efficiënte myeline verwijdering, etc.) kunnen verklaren. Bovendien wordt het gebruik van cel zeven ook nodig om de aanwezigheid van cellulaire klemmen in de monsters te voorkomen; Deze stap moet worden gedaan voorafgaand aan de cel kleuring. De gating strategie in de figuur 5 die is gebaseerd op CD11b en CD45 expressie, kunnen we onderscheid tussen verblijvende en geïnfiltreerd myeloïde cellen in het ischemische weefsel. Deze CD11b ⁺ bevolking toeneemt in de ischemische hemisfeer in vergelijking met naïeve en de sham groep, waarbij deze cellen meestal geassocieerd met een lage expressie van CD45 aangeeft dat microglia wordt prolifererende na ischemie (Figuur 4, Figuur 5 en Tabel 5) . Dit verschil is waarschijnlijk te wijten aan infiltratie van de periferie, zoals blijkt uit het optreden van een CD11b ⁺ CD45 ^hi cellen subpopulatie in de ischemische hersenen (Figuur 4, Figuur 5 en Tabel 5), dat lage aantal in naïef en in schijnvertoning hersenen. De bijdrage van infiltraten aan de CD11b ⁺ celpopulatie in de hersenen ischemie is een zeer dynamisch proces ^4. In de MCAO model van ligatuur kan variëren van 30% tot 60% van de totale CD11b ⁺ cellen afhankelijk van de grootte van de laesie en het tijdstip waarop de karakterisering gedaan. Neutrofielen, gekenmerkt door Ly-6G ⁺ cellen, de meest talrijke geïnfiltreerde celpopulatie vinden op 24 uur na MCAO in de ischemische hersenen van muizen met dit model van cerebrale ischemie, zij omvatten de 70-80% van de CD11b ⁺ CD45 ^hi. De overige cellen zijn meestal een subpopulatie van CD11b ⁺ CD45 ^hi Ly-6G ^- Ly-6C ^hi pro-inflammatoire monocyten. In dit model, zal deze populatie in aantal te verhogen in de ischemische hersengebieden 24-48 uur na MCAO.

Figuur 1:. Chirurgische procedure voor de MCA ligatie (A) na het terugtrekken van de temporale spier, wordt een kleine craniotomie uitgevoerd in de muis schedel. MCA wordt geligeerd door een knoop of een slipknot met behulp van een 9/0 hechtdraad. (B) Vertegenwoordiger beelden van de corticale laesie gegenereerd door de MCAO model. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Kwantificering van infarctvolume door Cavalieri. (A) Vertegenwoordiger beelden van Nissl-gekleurde hersensecties 24 uur na permanente MCA ligatie. De hoge vergroting toont de hipocromatic gebied na Nissl vlekken dieidentificeert na MCAO het beschadigde gebied (kern). De peri-infarct (PI) regio wordt ook getoond. (B) Kwantificering van het infarct volume weergegeven als% Geïnfarceerde halfrond (% IH) met behulp van de Cavalieri methode in seriële Nissl-gekleurde coupes, 24 uur na MCAO (n = 50 muizen ).

Figuur 3: Stereologische kwantificering van neutrofielen in het infarctgebied 24 en 48 uur na ligatie met de optische Fractionator methode. (A) representatief beeld van geïnfiltreerde neutrofielen (Ly6G-positieve cellen) in het ischemische gebied op 24 uur na MCAO. Afbakening toont het infarctgebied. (B, C) ​​Voorbeelden van een optische dissector voor neutrofielen kwantificering door de optische fractioneerinrichting. (D) Kwantificering van totaal neutrofielen in het geïnfarceerde gebied 24 en 48 uur (n = 4 muizen). (E)Correlatie van het aantal neutrofielen met de grootte van het infarct op 24 en 48 uur na MCA ligatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4:. Representatieve dot-plot scatter analyse van hersenen leukocyten verkregen uit naïeve, sham en ischemische (24 uur na MCAO) hemisferen op basis van fysische parameters (SSC en FSC) Een populatie van gebeurtenissen die CD11b (rood) tot expressie werd geïdentificeerd in alle groepen. Deze populatie werd afgesloten en gekenmerkt volgens de expressie van CD45. Cellen die lage niveaus van CD45 (groen) waren aanwezig in de ischemische en niet-ischemische cortex en kwam overeen met microgliale cellen. Daarentegen cellen die hoge niveaus van CD45 (geel) alleen werdengevonden in de ischemische halfrond en in mindere mate in sham-groep. Nadere analyse van de CD11b ⁺ CD45 ^hi bevolking geeft aan dat neutrofielen (Ly-6G ⁺ cellen, blauw) en pro-inflammatoire monocyten (Ly-6C ^hi cellen, oranje) zijn de belangrijkste celsubpopulaties gevonden in de hersenen infiltreert 24 uur na een beroerte. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5:. Gating strategieën inwoner van geïnfiltreerd myeloïde cellen differentiëren in het ischemisch weefsel CD11b ⁺ cellen werden eerst gated volgens isotype fluorescentie-intensiteit (A). Een vertegenwoordiger dot plot van cel suspensies van de ischemische hersenen wordt weergegeven in de up-rechterbovenhoek van het paneel. InBovendien typische waarden voor het totaal aantal gebeurtenissen en het aantal CD11b ⁺ gebeurtenissen verkregen met deze techniek is getoond (aantal cellen / ischemische hersenen halfrond. (A) CD45 fluorescentie intensiteit analyse van het CD11b ⁺ cellen wordt getoond in panel B. Een vertegenwoordiger puntdiagram analyse van CD45 en CD11b uitdrukking van de gated CD11b ⁺ subpopulatie wordt weergegeven in de up-rechterbovenhoek van het scherm. Bovendien is de typische aantal CD45 ^lo CD45 ^hi cellen verworven per ischemische hersenhelft gebruik van deze techniek weergegeven (B).

Parameters die worden gebruikt voor Cavalieri methode
Sectie Dikte (t)	30 pm
Objectief	10X
Slice steekproeffractie (SSF)	1/ 20
Afstand tussen de secties	600 pm
Rasterafstand	100 pm

Tabel 1: Parameters voor stereological kwantificering van het infarct weefsel.

Resultaten	Contralesional	Ipsilesional	Infarct
Area (μm²)	151.460.000	155.060.000	22.600.000
Volume (μm³)	90876000000	93036000000	13560000000
Volume Gecorrigeerd voor Meer dan Projectie (μm³)	89957100000	92046300000	13416600000
Coëfficiënt van Error (Gundersen), m = 0	0,068	0,077	0,067
Coëfficiënt van Error (Gundersen), m = 1	0,015	0.017	0,015
Coëfficiënt van Error (Gundersen), alpha (q)	0,068	0,077	0,067
% Geïnfarceerde halfrond		14.90
Brain Oedeem (Ips Vol / Cont Vol)		1.02

Tabel 2: Representatieve voorbeelden van contralesional, ipsilesional en infarct volumes door de Cavalieri methode met behulp van de Stereo Investigator Software.

Parameters gebruikt voor de optische fractioneerder
Sectie Dikte (TSF)	30 pm
Objectief	100X
Slice steekproeffractie (SSF)	1/10
Counting Frame Hoogte	40 pm
Counting Frame Breedte	40 pm
Maat X raster	230 micrometer
Maat X raster	230 micrometer
Safe Guard	2 pm
Optische Disector Hoogte	14 micrometer

Tabel 3: Parameters gebruikt voor de stereological kwantificering van geïnfiltreerd neutrofielen na hersenen ischemie met de optische fractioneerinrichting sonde met behulp van de Stereo Investigator Software.

Schatting van neutrofielen door de Optical Fractionator
Aantal Sampling sites	430
Vorm Factor	6.24
Totaal markers Geteld	166
Geschatte Neutrofielen door Optical Fractionator	117,608.03
Coëfficiënt van Error (Gundersen), m = 0	0.22
Coëfficiënt van Error (Gundersen), m = 1	0.09

Tabel 4: Representatief voorbeeld van de geschatte geïnfiltreerd neutrofielen na hersenen ischemie met de Optical Fractionator sonde met behulp van de Stereo Investigator Software.

	CD11b +	Neutrofielen	Monocyten	Microglia
Naïef	25.863 ± 4,575.8	473 ± 75,8	525 ± 191,4	19,012 ± 1523
Sham 24 hr	24.563 ± 5263	873 ± 192,5	1124 ± 391,5	23.734 ± 2910
pMCAO 24 hr	47.922 ± 23.174	4.874 ± 748,7	4826 ± 1.345	35.395 ± 10.833

Tabel 5: Representatieve resultaten van de geschatte myeloïde cellen na hersenen ischemie met de Flow cytometrie aanpak.

Discussie

De cerebrale ischemie model hier geïntroduceerd geeft zeer reproduceerbare infarct volumes bepaald 24-48 uur en 7 dagen na MCA ligatie door verschillende benaderingen ^8,15,17. Dit MCAO model heeft een lage sterftecijfer (minder dan 1%) in vergelijking met anderen, het minimaliseren van het aantal dieren dat in studies. Een cruciale stap om deze lage sterfte te verkrijgen is om de juiste aseptische omstandigheden te handhaven voor infecties die overleven, kunnen gevolgen na een beroerte inductie te voorkomen. Dit MCAO model kan niet alleen worden gebruikt als permanent MCAO model, die als klinisch relevant model voor translationeel onderzoek ^18, maar ook als tijdelijke voorbeeld door voorbijgaande ligatie van het CCA en MCA met een schuifknoop en achterste reperfusie op het gewenste tijdstip ^19. Deze werkwijze is met succes gebruikt bij muizen en ratten ^17,20. Al deze gegevens blijkt dat MCAO door ligatie is een hoog veelzijdige model van cerebrale ischemie met meerdere toepassingen. Een critical stap van deze techniek is dat het invasieve chirurgie onder een stereomicroscoop vereist; de craniotomie moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om niet aan het jukbeen bot en beschadigen als het MCA. Echter, het gebruik van sham dieren (die is onderworpen aan de chirurgische procedure maar CCA en MCA ligatie niet uitgevoerd) een nuttig hulpmiddel voor chirurgie-afhankelijke effecten discrimineren. De omvang van hersenletsel na deze techniek kunnen worden met verschillende methoden. Onze protocol van hersenen snijden, Nissl kleuring en daaropvolgende schatting van het volume Cavalieri maakt een nauwkeurige kwantificering van het beschadigde gebied en minimaliseert het aantal muizen gebruikt in dit type studies aangezien seriële hersencoupes kan ook worden gebruikt voor verschillende immunohistochemische analyse. Voor een betere prestatie van deze methode, is het essentieel om de juiste parameters in de stereology software te kiezen (tabel 1) die nodig zijn voor het schatten the volume van de verschillende regio's van de formule: V = 1 / ssf * a _f * t * _i zp (Ssf het segment steekproeffractie, t de gemiddelde dikte van de secties, een _f het gebied van de rasterafstand en zp het aantal punten raken van de structuur).

Het distale MCAO door ligatie kan nuttig zijn om het geïnfiltreerde leukocyten en immuuncellen subpopulaties ^8,13 die aan het ontstekingsproces na hersenletsel ^1-4 karakteriseren. Hier stellen we twee verschillende methodes voor de hersenen immuun cel karakterisering, een precieze stereological aanpak en een flowcytometrische analyse voor een betere karakterisering van meerdere leukocyten subpopulaties.

Gebruikmakend seriële hersenen snijden, kan de kwantificering van het totaal aantal neutrofielen worden bereikt door de optische fractioneerinrichting werkwijze ¹⁶ die het totale aantal cellen schattingen van het aantal cellen bemonsterde witha Systematische aselect verzameld (SRS) set van onpartijdige virtuele tellen ruimtes die de gehele regio van belang, in ons geval het infarct gebied, met uniforme afstand tussen onpartijdige virtuele tellen ruimtes in richtingen X, Y en Z. Deze methode biedt een nauwkeurig instrument om schatten totale aantal neutrofielen in de ischemische hersenen op verschillende tijdstippen na ligatie. Hoewel niet getoond in deze studie, kan dit protocol worden gebruikt voor de schatting van de verschillende subpopulaties neutrofielen na ischemie ²¹ en een nauwkeurige kwantificering van elke andere celpopulatie die in de ischemische hersenen zoals andere geïnfiltreerde leukocyten (monocyten / macrofagen) en ook voor het schatten overlevende neuronen of voor neurogenese kwantificering na een beroerte. De belangrijkste stap voor een nauwkeurige schatting van het gewenste gebied is de selectie van de geschikte parameters, zoals die aangegeven zijn in tabel 3 voor neutrofielen kwantificering in het ischemische gebied.Deze parameters worden gebruikt voor de stereology software om de totale positieve cel aantal (N) te berekenen met de volgende formule N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / TSF (ΣQ- is het totale aantal cellen geteld met de fractioneerinrichting, SSF is het gedeelte steekproeffractie, asf is het steekproeffractie gebied, en TSF is de steekproeffractie dikte) ^5. Hoewel deze methode is langzamer dan andere kwantificatietechnieken (bijvoorbeeld analyse van neutrofielen markers door mg weefsel, densitometrie van representatieve beelden of het aantal neutrofielen per veld), heeft het voordeel een neutrale en een vaste techniek die een nauwkeurig bepaald te zijn kwantificering van celaantallen.

De hersenen leukocyten isolatie aanpak maakt een gelijktijdige identificatie en kwantificering van verschillende subtypen van immuuncellen zonder vertekening het systeem in vivo kleuring of genetische manipulaties. Latere celsortering van de gekarakteriseerde myeloïde populations of hun immunomagnetische scheiding kan worden gebruikt voor meerdere stroomafwaartse toepassingen, zoals verdere studies op gen- of eiwitexpressie. De nauwkeurige karakterisering van neutrofielen, monocyten en microglia verkregen met deze methode een hoge specificiteit met betrekking tot bestaande werkwijzen zoals immunohistochemische studies, een voordeel waardoor het specifieke opdrachten aan de verschillende myeloïde cellen die hersenen aangeboren immuunrespons mediëren. Bovendien kan het verder worden uitgebreid naar andere hersendelen populaties te karakteriseren met het geschikte label, zoals het bloed macrofagen (CD11b ⁺ CD45 ^hi CD68 ⁺⁾ en kan worden toegepast voor de studie van andere CNS aandoeningen of letsels. Daarom verschaft deze techniek een essentieel instrument om de heterogeniteit van de ontstekingsreactie in de hersenen verkennen. Een belangrijke beperking van deze techniek zich op de bereiding van de leukocyten suspensies verse hersenweefsel, die wegactivering toestand van de cellen of hun antigeen wijziging. Hoewel deze techniek maakt een meer gedetailleerde kwalitatieve karakterisering vergelijking immunohistochemische studies biedt een minder nauwkeurige kwantificering basis van celisolatie. Desondanks wordt het rendement van onze celisolatie protocol is vergelijkbaar met andere gepubliceerde methoden ⁹ en efficiënt worden gebruikt om verschillen in het aantal hersenen immuuncellen tussen controle en MCAO groepen of zelfs tussen MCAO groepen aan verschillende behandelingen ⁸ detecteren.

Kritische stappen van dit protocol zijn de weefsel dissectie, het weefsel verstoring procedure, en de myeline verwijderen. Ten aanzien van het weefsel collectie, kan een normalisering stap worden opgenomen (door weging van het weefsel verzameld) om de variabiliteit te voorkomen als gevolg van verschillende dissectie optredens. Bovendien kan normalisatie verschillende MCAO groepen ook optreden door infarct volume (tevoren door magnetische Resonance). Een andere manier om dit probleem op te lossen is om de gehele ipsilaterale hemisfeer van zowel ischemische en controlegroepen gebruikt, of zelfs de contralaterale hemisfeer van de ischemische muizen als controle om het aantal gebruikte dieren te minimaliseren. Deze aanpak vermijdt verschillen tussen elke sectie, heeft een nadeel; een verdunningsfactor wordt toegevoegd door het verhogen van het totale aantal cellen, maar niet het aantal myeloïde cellen die uitsluitend in de kern en peri-infarct gebied van de ipsilaterale cortex. Wat weefselverstoring dit protocol illustreert de stappen van de mechanische verbreking van hersencellen, vermijden enzymatische behandelingen en oppervlakteantigeen wijziging ^9,22, een essentiële kwestie voor verdere kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de inflammatoire cel subpopulaties voorkomen. In aanvulling op de voorbereiding van de celsuspensie van belang, myeline verwijdering uit de hersenen monsters is een sterk aanbevolen stap om interferentie met downst voorkomenriem toepassingen, zoals immunomagnetische scheiden van cellen of flowcytometrie ^23,24. Dit kan worden bewerkstelligd op verschillende manieren, zoals sucrose of Percoll gradiënten, of anti-myeline kralen. Hier, en op basis van eerdere studies die verschillende methoden voor de hersenen celsuspensie isolatie, mechanische verbreking in combinatie vergelijken met Percoll gebruik myeline verwijderen wordt gebruikt om cellen opbrengst verbeteren en de levensvatbaarheid ^25.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Photonic Led F1	WPI	571329-8	Equipment
Temp Controller	Panlab	HB 101/2	Equipment
Volvere GX	NSK	Ne22L	Equipment
Microscope	WPI	PZMIII-BS	Equipment
Stainless Steel Burrs	FST	19007-14	Surgical material
Forceps Dumont #5/45	FST	11251-35	Surgical material
Forceps Dumont #5SF	FST	11252-30	Surgical material
Suture 6/0	LorcaMarin	55108	Surgical material
Suture 9/0	LorcaMarin	61966	Surgical material
Nikon Eclipse	Nikon	TE300	Equipment
Isoflurane	Esteve	571329-8	Chemical
Sodium Pentobarbital	Vetoquinol	570681	Chemical
Freezing microtome	Leica Microsystems GmbH	SM2000R	Equipment
Superfrost slides	Thermo Scientific	2014-07	Lab material
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042	Chemical
Microscope	Nikon	Nikon Eclipse TE300	Equipment
XYZ motorized computer stage and controller	Ludl electronics Products		Equipment
Stereo Investigator System	Microbrightfield	Version 7.003 software	Software
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle	Thomas Scientific	0913X70	Lab Material
Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube	Nalgene	3119-0050	Lab material
Percoll	Sigma	p1644-100	Chemical
RPMI 1640	Lonza	BE12-702F	Chemical
Beckman Ultracentrifugue	Beckman Coulter		Equipment
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti	Beckman Coulter		Equipment
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron	BD	BD 352340	Lab Material
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3733-500G	Reagment
FcR Blocking Reagent, mouse	Miltenyi	130-092-575	Antibody
CD11b-FITC, human and mouse	Miltenyi	130-098-085	Antibody
CD45-PE, mouse	Miltenyi	130-102-596	Antibody
Anti-Ly-6G-APC, mouse	Miltenyi	130-102-936	Antibody
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C	Biolegend	128012	Antibody
BD FACS Flow	BD	342003	Reagment
BD FACSCalibur; 4-color	BD	342975	Equipment
BD Cell Quest Pro Software	BD		Software
FlowJo software	Treestar inc.		Software