Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Summary

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Abstract

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen, die de bewoner spierstamcellen zijn. Deze kunnen worden geïsoleerd uit menselijke spier biopten middels enzymatische digestie en hun myogene eigenschappen bestudeerd in kweek. Kwantitatief de twee hechtende celtypen verkregen enzymatische digestie zijn: (i) de satelliet cellen (genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), oorspronkelijk geïdentificeerd als CD56 ⁺ en later als CD56 ⁺ / desmine ⁺ cellen en (ii) spier- afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 ^- en TE-7 ^+. Fibroblasten vermenigvuldigen zeer efficiënt in de cultuur en in gemengde celpopulaties deze cellen myogene cellen aan de cultuur domineren kan overlopen. De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide typen cellen in kweek te onderzoeken. Hier descr weIbe een sorteersysteem gebaseerd op de zachte enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door magnetische celsortering (MACS) dat een hoge zuiverheid (> 95% myogene cellen) en goede opbrengst (~ geeft beide 2,8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ cellen / g weefsel na 7 dagen in vitro) voor experimenten in de cultuur. Deze benadering is gebaseerd op het incuberen van het gemengde spier afgeleide celpopulatie met magnetische microbolletjes beads geconjugeerd met een antilichaam tegen CD56 en vervolgens passeren cellen hoewel een magnetisch veld. CD56 ⁺ cellen gebonden aan microbolletjes worden bewaard door het veld, terwijl CD56 ^- cellen passeren ongehinderd door de kolom. Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kunnen worden uitgeplaat en gekweekt. Na een bepaalde ingreep, celmorfologie en de expressie en lokalisatie van eiwitten inclusief nucleaire transcriptiefactoren kan worden gekwantificeerd middels immunofluorescentie labeling met specifieke antilichamen en een afbeelding pEHANDELING en analyse pakket.

Introduction

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen ^1, de myogene stamcellen ^2,3. In vivo deze cellen bestaan ​​in een reversibel rusttoestand gelegen tussen de sarcolemma en basale lamina van elke myofibre, maar geactiveerd worden om te woekeren, zekering en differentiëren spierweefsel beschadigd, gerepareerd en geregenereerd ^3. Satelliet-cellen kunnen worden geïsoleerd uit jonge en oudere humane spierbiopsie monsters middels enzymatische digestie ⁴ en de myogene eigenschappen kunnen vervolgens worden onderzocht in primaire kweek ^5. De efficiëntie van dit isolatieproces met betrekking tot zowel opbrengst en zuiverheid van de celpopulatie afhankelijk van de gebruikte methoden en kunnen verschillen van monster tot monster. De twee belangrijkste aanhanger celtypen verkregen van enzymatische afbraak zijn de satelliet cellen (nu genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), aanvankelijk geïdentificeerd als CD56 ⁺ / desmine cellen, en mu-SCLE afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 ^- en TE7 ⁺ cellen ^5. Fibroblasten hebben een snelle proliferatieve tarief en geen onomkeerbare groeistop en terminale differentiatie op cel-cel contact achtige myogene cellen niet ondergaan; dus in gemengde populatie, kan fibroblasten myogene cellen overspoeld met de cultuur domineren.

Fibroblasten vaak gezien als een irritatie voor spier biologen, maar er is nu een groeiende interesse in fibroblasten als cellen waard studie op zich, vooral omdat zij aangetoond dat een coöperatieve rol myogene cellen tijdens spier herstel ⁶ . De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide celtypen in kweek te onderzoeken. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een methode waarbij cellen kan worden gesorteerd voor verdere studie en / of geteld engeanalyseerd. FACS is aangetoond betrouwbaar verrijken menselijke myogene cellen, maar de opbrengst aan cellen voor verdere kweek is vooralsnog niet hoog ⁷ geweest. Gezien de beperkte replicatie potentieel van somatische cellen, zoals satelliet-cel-afgeleide myogene cellen en de zeer slechte proliferatie en differentiatie in verband met veroudering ^4, zijn meer zachte aanpak vereist. Single spiervezels culturen bieden een andere, minder agressief, betekent het verkrijgen van muizen satelliet-cellen nog in hun sublaminal niche en na hun activering in cultuur ^8,9 inwoner. Dit is echter vaak niet mogelijk uit menselijke spierbiopsie materiaal (omdat vezels nauwelijks zijn te verkrijgen pees pees) waardoor deze techniek niet toegankelijk voor veel onderzoekslaboratoria geïnteresseerd om menselijke spier afgeleide cellen zijn. Bovendien is de enkele vezel techniek maar korte tijd celaantallen.

Hier een sorteersysteem gebaseerd op het gen beschrijven weTLE enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door twee opeenvolgende ronden van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) dat zowel een hoge zuiverheid (> 95% myogene cellen) en opbrengst (~ geeft 2,8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ cellen / g weefsel) voor experimenten in de cultuur. CD56 wordt beschouwd als de gouden standaard oppervlak marker voor de identificatie van menselijke satelliet cellen in situ ¹⁰ en in vitro ¹¹ en de ideale oppervlaktemerker kandidaat voor kralen bevestiging. In deze benadering CD56 antilichamen geconjugeerd aan ijzeroxide en polysaccharide bevattende superparamagnetische gebonden aan cellen en door een hooggradiënte magnetische celscheidingskolom geplaatst in een sterk magnetisch veld ^12,13. De scheiding kolommen zijn gevuld met een matrix van ferromagnetische staalwol of ijzeren bolletjes die dienen om magnetische veldlijnen zich aan hun oppervlak die sterke magnetische veld gradiënten (~ 4tesla) ¹⁴. In deze kolommen zelfs licht magnetische cellen worden aangetrokken en geadsorbeerd aan het oppervlak ^14. Ongebonden (CD56 ^-) cellen passeren de kolom terwijl CD56 ⁺ cellen gelabeld met magnetische microbolletjes worden behouden tot verwijdering uit het magnetische veld ^12,15.

Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kan worden geplateerd op de gewenste dichtheid voor verdere experimenten. Naar aanleiding van een bepaalde interventie van de cellulaire bestanddelen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van immunocytochemie, afgebeeld met behulp van wide-field of confocale fluorescentie microscopie en kwantitatief geanalyseerd met behulp van een beeldanalyse aanpak die een snelle objectieve meting van alle gelabelde cellen in een bepaalde afbeelding maakt. In ons laboratorium hebben we deze dubbele immunomagnetische sortering benadering gevolgd door beeldanalyse ¹⁶ gebruikt om dat CD56 te tonen ^- de menselijke fibroblasten gemakkelijk transdifferentiëren tot adipocyten, terwijl myogenic cels satelliet oorsprong zijn zeer resistent tegen deze adipogene omzetting ^5.

Protocol

LET OP: Voor de studies in ons lab alle vakken gaven hun schriftelijke, geïnformeerde toestemming om deel te nemen en alle experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring Britse National Health Service ethische commissie (Londen Research Ethics Committee; referentie: 10 / H0718 / 10) en in overeenstemming met de Human Tissue Act en de Verklaring van Helsinki.

1. Eerste Voorbereiding Voorafgaand aan spierbiopsie (15 min)

1. Maak menselijk skelet spiergroei medium. Om een afgestudeerd steriele 50 ml conische buis toe 2,5 ml van het supplement mix, 10 ml foetaal kalf serum, antibiotica (penicilline / streptomycine) en glutamine om de juiste uiteindelijke concentraties (tabel 1), vul dan de buis tot 50 ml met skeletspieren basale medium.
2. Breng 15 ml van de skeletspier basaal medium in een steriele 20 ml conische buis en wegen. Zodra woog plaats deze buis op ijs. Gebruik dit om het menselijke spier monster ontvangen.
3. In een andere 20 ml buisje bereiden 10 ml een collagenase D Dispase II enzymoplossing tot een eindconcentratie van 2 mg / ml elk door oplossen stock monsters van deze enzymen in de skeletspier basaal medium. Filter-steriliseren deze oplossing door het door een 0,22 urn filter. Plaats deze steriele enzymmengsel in de incubator of waterbad bij 37 ° C gedurende 15 minuten opwarmen.
   LET OP: Dit mengsel van enzymen is iets zachter dan trypsine en beter onderhoudt cel levensvatbaarheid ^17.
4. Vernietiging van een petrischaal en een paar steriele scalpels.

2. spierbiopsie Procedure (45 min-1 uur)

1. Voorafgaand aan het werven van deelnemers, het verkrijgen van volledige ethische verklaring en procedurele goedkeuring (inclusief relevante vaccinaties voor onderzoekers) uit alle relevante bestuursorganen, commissies en zorgverleners (bijvoorbeeld, ethische, institutionele, bestuurlijke etc.).
2. Maak een steriel veld rondom het been (bijvoorbeeld met een steriele chirurgische lakens) eend grondig reinigen het gebied rond de biopsie met een antiseptisch antibacterieel middel (chloorhexidine).
3. Verdoven de voorgestelde biopsie site op het been van de vrijwilliger door lokale injectie van 2% lidocaïne in de onderhuidse regio boven de fascia van de vastus lateralis.
4. Wordt ~ 5 mm brede insnijding met een steriel chirurgisch mes door de huid en fascia en voer de Bergström naald biopsie procedure ¹⁸ met extra afzuiging.
5. Met behulp van een steriel pincet verwijder de spier van de naald lumen en onder te dompelen in basaal medium op ijs. Vervoer het weefsel naar het laboratorium voor verdere verwerking zo snel mogelijk maar levensvatbare myogene cellen kunnen worden verkregen na perioden van 24 uur of meer.
6. Debrief het onderwerp, reinigen en verzegelen de incisie site met meerdere steriele zelfklevende huid-sluiting strips en aseptisch jurk met een buitenste waterdichte bekleding.

3. Isoleren-Muscle afgeleid Precursor CeLLS (1 uur, 30 min)

1. Verwijder de buis met de spier monster en wegen (zorg ervoor dat de buis droog schoon met weefsel). Bereken het gewicht van de spier monster door het aftrekken van het gewicht van de buis met medium en monster uit de buis alleen bevattend medium.
2. Zwenk de oplossing een paar keer om de spier bloedmonster te wassen. Laat de spier sediment bij kamertemperatuur gedurende 30-60 sec.
   1. Verwijder nagenoeg het gehele volume van medium uit de buis, eerst via een elektronisch pipetteerhulp of aspirator maar laat ongeveer 2-3 ml in de buis.
   2. Inverteer de buis op een steriele petrischaal zodat de resterende vloeistof naar de spier proefexemplaar in de schotel dragen; gebruik maken van de steriele scalpel te extraheren eventuele resterende spier fragments.Rotate de schotel naar de resterende vloeistof te mobiliseren en te verwijderen met een pipette.Remove zichtbare stukken vet of bindweefsel.
3. Voor biopsies wegen 100-400 mg, voeg 3 ml warmenzym-oplossing en met steriele scalpels snijd de spier monster in heel kleine stukjes (<1-2 mm ^3).
4. Met behulp van een wijde boring 25 ml pipet opstellen van de spier fragmenten en enzymoplossing en transfer naar een steriele 10 ml conische buis. Was de petrischaal met een verdere 3-5 ml collagenase en dispase enzymoplossing en met een kleinere 10 ml pipet verzamelen resterende spier fragmenten en plaats in de buis. Het exacte volume is niet kritisch.
5. Plaats het flesje in een 37 ° C incubator (of waterbad) gedurende 60 min bij trituratie (10 ml pipet) elke 15 min.
6. Na 1 uur beëindigen enzymatische dissociatie door toevoeging van een overeenkomstige hoeveelheid vers voorverwarmd groeimedium en laat de celsuspensie door een 100 urn filter om eventuele grote myofibre vuil te verwijderen. Centrifugeer de gefilterde cel oplossing bij 657 xg gedurende 6 min bij kamertemperatuur (20-25 ° C).
7. Resuspendeer de cel pellet in 5-7 ml groeimedium en plaat in een onbeklede T-25weefselkweekfles. Breng de plaat aan de incubator bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 7 dagen. Verander het medium elke 48 uur. In dit stadium myogene cellen zijn zeer klein en rond en moeilijk te onderscheiden van niet-myogene cellen.
   1. Op de eerste mediumverversing, centrifugeer het supernatant alle niet hechtende cellen te pelletiseren. Re-schorten deze in vers medium en re-plaat.
8. Na 7 dagen kweken zorgen dat de meeste myogene (en fibroblast) cellen gehecht maar de cellen nog niet samenvloeiing bereikt. Zuiveren de myogene precursoren en MACS voeren volgens een protocol oorspronkelijk ontwikkeld door in de laboratoria van Gherardi en Chazaud ^19,20 en verder bewerkt door ons ^5.

4. Immunomagnetische Bead sorteren van cellen op basis van CD56 expressie (1,5 uur)

1. Na 7 dagen Spoel de cel monolaag (die doorgaans zal 50-60% myogene cellen ⁵ bevatten) met drie beurzenkamertemperatuur fosfaatbufferoplossing (PBS) om eventuele resterende niet-hechtende cellen en afval van isolatie te verwijderen.
   1. Trypinize de cellen (0,04% trypsine in Ca2 ⁺ -vrij PBS met 0,73 mM EDTA) gedurende 3 minuten. Zodra cellen hebben losgemaakt, voeg 5-10 ml van de groei van skeletspieren medium om te voorkomen dat over-vergisting. Pellet de cellen door centrifugatie bij 657 xg gedurende 6 min bij kamertemperatuur (20-25 ° C) en resuspendeer in een geschikt volume van volledig medium voor tellen.
   2. Graaf een klein monster van de celsuspensie met de gewenste werkwijze (bijvoorbeeld met behulp van een hemocytometer of een automatische telinrichting) en bereken starten aantal cellen en levensvatbaarheid.
2. Plate enkele putjes in een plaat met 96 putjes (of groter vaartuig indien nodig) voor immunocytochemische of flowcytometrie gebaseerd karakterisering van de bevolking voor sorteren (fibroblasten en myogene cellen zijn de meest voorkomende celtypen aanwezig).
3. Aan de celsuspensie advertentied 15 ml steriele PBS cellen en medium verdund. Centrifugeer ze de cellen weer en resuspendeer in 170 ul van kamertemperatuur sortering buffer (1% BSA in een MACS spoeloplossing, gesteriliseerd via die door een 0,22 urn filter).
   1. Voeg 35 ul van goed gemengd magnetische microbolletjes geconjugeerd aan een CD56 primair antilichaam (kloon AF12-7H3, 130-050-401) in de cel oplossing pipet te mengen en laat incuberen gedurende 15 min bij 4 ° C onder zacht roeren bij het halverwege.
4. Na incubatie verdunnen de cel en bead oplossing met 10 ml MACS sortering buffer en centrifugeer bij 657 xg gedurende 6 min. Resuspendeer de cellen in 1 ml buffer sorteren.
5. Voeg het MAC-afscheider (magneet) aan de MACS houden stand. Wees voorzichtig bij het toevoegen van magneet om de stand te wijten aan de sterke magnetische veld. Sleuf in de kolom en passen de pre-scheidingsfilter. Pipetteer 1 ml sorteren buffer via de pre-scheidingsfilter en kolom voor smering.
6. Immediately Hierna meng de celsuspensie en druppelen de gehele 1 ml tot pre-scheidingsfilter en in de kolom.
7. Was de kolom driemaal met 1 ml (of 500 pl) van het sorteren buffer. Verzamel de niet vastgehouden cellen die in een steriele 50 ml conische buis met een kleine hoeveelheid groeimedium passeren de kolom sorteren. Deze cellen zijn de eerste soort CD56 ^- fractie en zal zeer worden verrijkt voor bindweefsel fibroblasten. Laat de kolom uitdrogen tussen wasbeurten.
8. Na wast het verwijderen van de pre-scheiding filter en voeg 2,5 ml MACS buffer om de kolom. Daarna onmiddellijk de kolom uit de magneet en het verzamelen van de eerste soort CD56 ⁺ fractie in een afzonderlijke 50 ml conische buis door het indrukken van de plunjer in de top van de kolom.
   OPMERKING: De zuiger zit stevig vast in de top van de kolom en kan heel lastig te bedienen; echter, moet dit worden gedaan, terwijl de kolom is nog steeds full buffer, zodat snelheid gewenst. Vermijd het indrukken van de zuiger te hard en snel.
9. Voordat plating de levensvatbaarheid van de cellen met behulp bepalen bijvoorbeeld de trypan blauw assay. Bepaal het percentage van levensvatbare cellen van 8 x 1 mm ² tellen velden (beide kamers van de hemocytometer).
   OPMERKING: De cellen kunnen enkele of dubbele gesorteerd naargelang de vereiste zuiverheid. Indien zorgvuldig gedaan deze cellen tolereren dubbele sorteren procedure zeer goed en de levensvatbaarheid is zeer hoog> 95%. Voor dubbele sorteren, het opzetten van een andere kolom, smeren met 1 ml het sorteren van de buffer en ga verder met stap 4.6.
   1. Als beeldvorming moet worden uitgevoerd, plaat cellen direct op dekglaasjes gelegen in 24 goed schotels ²¹ en bekleed met uw keuze van de ECM-molecule voor celaanhechting (bv collageen of laminine). Hier gebruikt 0.1-0.5 mg / ml collageen I (Tabel 3).

5. Het sorteren van Humeen-Muscle afgeleid Fibroblasts Onmiddellijk na isolatie.

1. Om fibroblast voorouders zuiveren onmiddellijk na isolatie, in dienst van het protocol zoals hierboven met de volgende wijzigingen:
   1. Onmiddellijk na isolatie resuspendeer cellen in compleet medium en filter eenmaal hoewel een 100 micrometer cel zeef en dan weer al een 40 pm zeef. Voeg 5 ml PBS en draaien op 657 xg gedurende 6 min.
   2. Resuspendeer de cellen in MACS buffer sorteren en incuberen in anti-humane fibroblast Microkralen gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Gebruik de kolom LS en de Midi-MACS afscheider (tabel 3) en installeer de 40 micrometer pre-scheidingsfilter.
   4. Voer één of twee soorten, afhankelijk van de vereiste zuiverheid, overdracht van de cellen zo snel mogelijk in serum bevattend medium, voert een telling en plaat uit op het gewenste dichtheid

6. Immunocytochemische kleuring (1 dag en 's nachts).

1. Reparerencellen in de wells door toevoeging van een gelijk volume 8% paraformaldehyde in ijskoude PBS gedurende 10 minuten onder zacht schudden. Na 10 min aspireren fixatief en was twee keer met PBS.
2. Om celoppervlak antigenen blok cellen immunostain ten minste 1 uur in 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS en vervolgens sonde de desbetreffende primaire antilichamen (Tabel 4).
   1. Voor intracellulaire antigenen, doorlaatbaar cellen na binding door toevoeging van 0,2% Triton X-100 in PBS met 1% BSA en _NaN3 (0,01%) gedurende 10 min, dan blokkeren en geïncubeerd met primaire antilichamen. Voer alle primaire antilichaam incubaties overnacht bij kamertemperatuur (of bij 4 ° C) onder zacht schudden op een schudplatform.
3. Verwijder ongebonden primaire antilichaam en was cellen drie keer met koude PBS. Incubeer gedurende 1 uur incubatie met soortspecifieke fluorescent gelabelde secundaire antilichamen (tabel 4) bij kamertemperatuur.
4. Na verwijdering vanongebonden secundaire antilichamen, spoel cellen drie uitwisselingen van PBS en vervolgens tegenkleuring met fluorescente DNA kleurstof Hoechst 33342 (1 ug / ml) gedurende 10 minuten op een schudplatform.
5. Voor de gelijktijdige weergave van zowel celoppervlak antigenen en intracellulaire antigenen, probe cellen eerst met primaire antilichamen tegen oppervlakteantigenen gevolgd door de geschikte secundaire antilichamen cel. Vervolgens re-fix de cellen in koude PFA, permeabilize, blok en incubeer met primaire antilichamen tegen cytoplasmatische of nucleaire antigenen gevolgd door hun geschikte secundaire antilichamen.
6. Na het kleuren verwijdert dekglaasjes van de putjes met gebogen pincet en spoel de achterkant van het dekglaasje met gedestilleerd water. Leg het dekglaasje cel naar beneden glijden op een daling van de anti-fade montage medium ²² set op een glazen microscoopglaasje.

7. Oil Red O kleuring in combinatie met Immunofluorescente kleuring van cellen (2 uur)

1. Onthullenhet vetgehalte van cellen in 24 putjes bedekt door kleuren met Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol) ^5,23. Maak eerst een voorraadoplossing van 0,5% (w / v) Oil Red O door het oplossen van 500 mg Oil Red O in 60 ml 99% triethyl-fosfaat en 40 ml gedestilleerd water. Houd deze oplossing bij kamertemperatuur in het donker tot gebruik.
2. Op de dag van gebruik, maken een 36% (w / v) triethyl- fosfaat werkoplossing gemaakt met 12 ml Oil Red O voorraadoplossing en 8 ml gedestilleerd water. Filter deze oplossing door filtreerpapier nummer 42 om alle gekristalliseerde Oil Red O (die de beeldkwaliteit verslechtert) te verwijderen.
3. Verwarm zachtjes deze werkoplossing in een waterbad gedurende 1 uur waarna de oplossing wordt gecentrifugeerd bij 1200 xg gedurende 6 min. Verwijder de bovenstaande vloeistof en filteren weer door filtreerpapier (nummer 42) en transfer naar een verse 20 ml buis.
4. Na cellen zijn vastgesteld, gepermeabiliseerd en immunostained, verwijder de PBS en voeg 500 ul van Oil Red O / Triethyl-phosfosfaat oplossing aan de putjes gedurende 60 min. Triton-X bij een concentratie hier voor celmembraan permeabilisatie geen invloed cellulaire lipidegehalte ^23.
   OPMERKING: Oil Red O wordt geëxciteerd door golflengte tussen 540 en 580 nm en dus de Texas-rood filter kan worden gebruikt Oil Red O emissie detecteren fluorescentiemicroscopie ^23. Merk op dat de fluorescentie-emissie van Oil Red O af en toe kan lekken in de verre rode kanaal als cellen zeer sterk gekleurd zijn (dat wil zeggen, zeer hoog vetgehalte).
5. Na incubatie, verwijderen overtollige olie Rood O en spoel de cellen vijf keer met 500 ul van PBS. Monteer de dekglaasjes als voor immunostaining zoals beschreven in hoofdstuk 6. Detect Oil Red O kleurstof door zowel helderveld / fasecontrastmicroscopie of door epifluorescentiemicroscopie behulp van de Texas Red filter (verschuiven gratis, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. Het verkrijgen Micrografen van fluorescentie microscopie voor Latere Analysis

OPMERKING: Zorg ervoor dat de dia's om kwantitatief te vergelijken zijn gekleurd met dezelfde oplossingen, gefotografeerd in identieke omstandigheden (bijvoorbeeld, belichting, camera en acquisitie instellingen etc.) en veroverde in dezelfde microscopie sessie. Alle post-acquisitie opmaak moet ook identiek zijn en in strikte overeenstemming met de voorgestelde richtlijnen voor digitale beelden ^24.

1. Voor het verwerven (groothoek microscopie), zet de microscoop en fluorescentie lichtbron en vertrekken naar de aanbevolen hoeveelheid tijd om de fluorescentie lichtbron op te warmen en te stabiliseren.
2. Stel de donkere stroom voor de camera door het blokkeren van het licht pad naar de camera; verwerven van een beeld op maximale resolutie en gebruik deze om later verkregen beelden te corrigeren.
3. Verlichten immunofluorescent sondes door epifluorescente door vloeibare lichtgeleiders (flexibele buis van fluoroplastic gevuld met fënylmethyl siliconenolie) een geleverdend signalen gevisualiseerd door rood (filter instellen 45 HQ Texas roodverschuiving gratis, groen (filter instellen 44 FITC speciale shift gratis) en blauw (filter instellen 49 DAPI shift gratis) band pass filters op een omgekeerde epi-fluorescentie microscoop (10X, 20X, 40X, plannen apochromatische doelstellingen met 0.25, 0.75, 0.95 numerieke respectievelijk openingen).
4. Om te voorkomen pixel verzadiging vinden de optimale belichting binnen het lineaire bereik van de detector voor elke fluorescerende marker met behulp van de 'overbelichting' functie van het beeld acquisitie software. Maak een notitie van de gestandaardiseerde belichting voor elke fluorescent label.
5. Leg afzonderlijke kanalen en opslaan grijstinten of pseudocolored tiff (Tagged Image File Format) beelden bestanden in de hoogste bit diepte (bij voorkeur 16 bit - 65.536 grijswaarden) die door de opname-apparaat (bijvoorbeeld gekoelde CCD (geladen coupled device) gemonteerd op de microscoop) . Stel de beeldresolutie naar 1388 x 1040 of hoger. Zorg ervoor dat u een schaal bar of voorwerp van bekende di omvattenqua afmetingen in de afbeelding.
6. Waar mogelijk bestanden in 16 bit Tagged Image File Format (TIFF) en niet opslaan in JPEG-formaat om verlies van informatie ²⁵ te voorkomen.
7. Als die er zijn bezorgdheid over de gelijkmatigheid van de verlichting (software gebundeld met een microscoop kan de automatische correctie voor dit hebt) neem een ​​'flat-field' beeld van dekglaasje zonder cellen, maar gekleurd en gemonteerd op dezelfde manier als experimentele dia's; Dit kan worden gebruikt om te corrigeren voor de verlichting gebreken na verwerving beeldanalyse software.
8. Voor het verwerven (confocale microscopie), optimaliseren detector winst en laservermogen voor elke beeldvorming experiment (verzadiging te vermijden). In het algemeen de fluorescentie gemeten is evenredig met de laser vermogen. Stel pinhole grootte "1 luchtig beste signaal-ruisverhouding te bereiken (verbeterde resolutie kan 0.5 luchtige voor zeer sterke signalen worden bereikt). Neem optische secties op verschillende niveaus langs de z-as door de mieribody-gelabelde cellen en opslaan van een 16 bit maximale projectie voor elk kanaal voor beeldanalyse.

9. Het uitvoeren van metingen van fluorescent gelabelde nucleaire transcriptiefactoren Met behulp van beeldverwerking en analyse Software (5 min per gezichtsveld).

1. Toegang individuele tiff beeldbestanden en overlay bijbehorende kanalen door te klikken en één afbeelding te verslepen naar een andere. Elk kanaal zal dan verschijnen als een aparte laag in het deelvenster Lagen.
2. Selecteer Lichter uit het menu filter om lagen onder gelijktijdig worden gevisualiseerd mogelijk te maken. Als alternatief, pas de dekking van de bovenste lagen tot 50%.
   OPMERKING: TIFF-afbeeldingen kunnen worden opgeslagen met de 'lossless' Lempel-Ziv-Welch (LZW) datacompressie om de bestandsgrootte te verlagen zonder verlies van informatie.
3. In de analyse venster (Analyse> Select Data Points> Custom) selecteert u Analyse en kies de metingen vereist (bv Integrated dichtheid, bedoel dichthy, circulariteit, histogram etc.). Gooi alle onnodige metingen door het vinkje het vakje naast hen. Als gebied metingen nodig zijn in micrometer klik op Analyse> Set Measurement Scale. De heerser tool zal automatisch verschijnen - traceren van de lengte van de schaal bar en geef haar een bekende lengte in micrometers. De software zal dan omzetten gebied metingen in vierkante micron.
   Opmerking: Als het histogram analyse geselecteerd, bij de meting opgenomen een extra map weergegeven (de locatie kan worden gekozen) met 8 bits histogrammen voor elk selectiegebied in de microfoto als de som van alle individuele selecties (dit verschijnt altijd als Histogram-1 als meerdere selecties zijn gemaakt). Deze analyse kan worden uitgevoerd door de software in 16 bit formaat, maar is zeer nuttig voor het onderzoeken van de verdeling van pixelintensiteiten gedurende een object van belang.
4. Voor de analyse van de fluorescentie-intensiteit nucleaire eerste bouw van een vertegenwoordiger 'Color Range Selection Mask' (CRSM) voor Hoechst of DAPI lood DNA om nucleaire gebied te definiëren. Zodra het gewenste kanaal beelden op elkaar, moet alleen de Hoechst kanaal laag in het oog worden gelaten door te zorgen voor het 'oogje' grenst aan het in het tabblad lagen is geselecteerd en vervolgens laag is gemarkeerd (wordt blauw), terwijl alle andere lagen moeten zijn gedeselecteerd. Zorg ervoor dat de vermenging dropdown is terug op 'Normaal' in het tabblad lagen.
5. Open het dialoogvenster Color Range (Select> Color Range) en zet de selectie optie dropdown om "Bemonsterd kleuren '. Met de selectie voorvertoning ingesteld op 'quick mask' (rode achtergrond) selecteer alle blauwe kleurtinten binnen de kernen door de Shift-toets ('+' teken verschijnt) en te klikken binnen de kernen met behulp van de pipet die verschijnt.
   1. Als ongewenste tonen worden geselecteerd, verwijder deze door op de Alt-toets ('─'sign verschijnt) en klikkendaarop. Handhaving van de vaagheid schaal op nul, zodat alleen handmatig geselecteerde kleurtonen zijn opgenomen in de meting en 'Gelokaliseerde kleur clusters' moet aangevinkt worden gelaten.
6. Bewaar deze CRSM naar de harde schijf van de computer als een programma-specifieke extract file (.AXT bestand). Met een ander willekeurig gebied van de kernen, belasting, bijwerken, en sla de CRSM (Select, Color Range, Load). Doe dit gedurende ten minste vijf willekeurige velden opdat nucleaire selecties representatief.
   1. Gebruik een gekleurde versie van een afbeelding in grijswaarden voor de creatie van een masker om functies te isoleren, omdat het menselijk oog is beter in staat om onderscheid te maken tussen de verschillende tinten van kleur dan tussen de verschillende grijstinten ^26.
7. Gebruik de nucleaire CRSM segmenteren nucleaire regio's voor het kleuren. Zodra kernen zijn geselecteerd Klik op de afbeelding> Adjustment> Drempel en verplaats de schuifregelaar helemaal naar rechts, zodat de kernen zwart. Als alternatief,klik met de rechtermuisknop en kies 'Fill' kies vervolgens 'Vul aan: zwart'. Klik vervolgens op Select> Inverse en nu druk op DELETE om alle achtergrond te verwijderen (als de optie verschijnt kies je 'invullen om: White'). Dit binarizes wezen het beeld op basis van uw keuze. Laadt dan de waterscheiding plugin van het tabblad filters om overlappende kernen (Filter> Binary> Watershed functie scheiding) te scheiden.
   1. Als veel kernen zijn sterk overlappend, verwijder de kernen uit de analyse door de selectie van hen (Houd de Alt-toets ingedrukt en los te trekken om hen heen met de lasso).
8. Op de nu binaire nucleaire laag, ga dan naar Selecteren> Color Range en> Shadows, individuele kernen te selecteren. Alternatieve hold shift en klik binnen één zwarte kern. Alle kernen zal onmiddellijk worden geselecteerd. Overdragen dan deze selectie om de laag met nucleaire transcriptiefactor kleuring (bijv myogenin) door het selecteren van die laag en deselecteren van alleandere lagen. Lopende lijnen toont nu de positie van de kernen in de myogenin kanaal.
9. Als het werken met pseudocolored beelden klik alleen op het palet Kanalen (aan de rechterkant van het tabblad lagen) en selecteert u alleen het groene kanaal (het beeld verschijnt nu grijs). Klik dan op Afbeelding> Modus> Grijswaarden. Er verschijnt een waarschuwing 'zichtbare lagen afvlakken en gooi verborgen lagen' klik OK, daarna nog een waarschuwing zal zeggen: 'gooi andere kanalen' klik nogmaals op OK. Slechts een enkele laag van grijstinten geselecteerde kernen zal nu aanwezig in het lagen palet zijn.
   1. Klik Record Metingen in het Measurement Log om gegevens voor de geselecteerde kernen te verkrijgen. Als de laag te analyseren (bijv myogenin vlekken) is al een ruwe 16 bit grijsschaalbeeld dan gewoon op de opnameknop drukt Metingen.
   2. Exporteer geselecteerde metingen als TXT-bestand naar de locatie van uw keuze. Deze kunnen dan verder worden verwerkt en in andere gegevensverwerking software p geanalyseerdackages
      LET OP: Het bewerken> stap achteruit commando (druk al Alt, Ctrl en Z toetsen tegelijkertijd) herstelt alle vorige lagen indien nodig.
   3. Corrigeer aspecifieke achtergrond ²⁷ fluorescentie voor resultaten kwantitatieve en vergelijkbaar metingen van fluorescentie intensiteit altijd een mengsel van signaal en achtergrond.
      1. Selecteer de vierkante selectie-instrument en laat 'vaste grootte' kiest 20 bij 20 pixels (of groter indien gewenst en afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen in het beeld). Houd shift kiezen tien of meer achtergrond gebieden verspreid over het gezichtsveld. Druk op 'Record Metingen' in het Measurement Log.
      2. Bereken de gemiddelde geïntegreerde dichtheid (som van alle grijswaarden) per pixel van alle 10 geselecteerde achtergrond gebieden (gezien als de 'gemiddelde grijswaarde' in het meetprotocol). Vermenigvuldig het gemiddelde achtergronddensiteit per pixel door het aantal pixels in het doelobject ( Dwz elke kern) tot gemiddelde achtergrondconcentratie per object te geven.
      3. Trek achtergrond fluorescentie van de voorwerpen oorspronkelijke geïntegreerde dichtheid de uiteindelijke achtergrond gecorrigeerde waarde opleveren. Deze benadering verklaart potentiële veld veldvariatie aspecifieke achtergrondfluorescentie.
         LET OP: Het is van het grootste belang om alleen bonafide achtergrond regio's selecteren als deze correctie heeft een aanzienlijke invloed op de uiteindelijke waarden. Door in te zoomen met behulp van het vergrootglas wordt aanbevolen bij het maken van selecties.
      4. Het kan ook nuttig zijn de algemene achtergrond gecorrigeerde waarde van het gebied van de kern in pixels (zelfde als die gemiddelde grijsniveau / intensiteit per nucleus) om eventuele invloed van nucleair gelokaliseerde achtergrondsignaal die meer bijdraagt ​​tot de integrale densiteit minimaliseren worden gesplitst met een toenemende kerngrootte (figuur 3C).

Results

Gezuiverde myogene cellen en fibroblasten worden gekweekt in adipogene differentiatie medium gedurende drie dagen, gevolgd door adipogenic voedings- middel van ergens tussen 7-30 dagen op hun vermogen om adipogenese beoordelen. De gezuiverde celpopulaties, Oil Red O kleuring in combinatie met immunokleuring voor adipogene en myogene lineage markers bleek dat alleen de fibroblast fractie staat adipogene differentiatie (figuur 2) was. De massieve ophoping van vet door de fibroblasten is zichtbaar voor het...

Discussion

We hebben een immunomagentic sorteren procedure beschreven voor de selectieve verrijking van de menselijke spier-afgeleide voorlopers van kleine monsters van spierbiopsie materiaal. Deze techniek onschatbare waarde in ons laboratorium voor het overwinnen van het verlies van menselijk spier afgeleide culturen fibroblasten, maar ook voor het begrijpen van de unieke gedrag van verschillende populaties van spier afgeleide voorlopercellen. Eenmaal gezuiverd myogene cellen kunnen worden onderzocht op veranderingen in eiwit en...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase  D	Roche	11088866001
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Moet voor gebruik gefilterd worden
Trypsin/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm cel zeef	BD Biosciences	352360
Collageen oplossing ( 3 mg/ml in 0.1% azijnzuur)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 spuitfilter (0.2 μm)	Sartorius	17573ACK	Polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan
CD56 humane Microbeads	Miltenyi Biotech	130-050-401	Let op de beperkte houdbaarheid van microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, menselijk	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μm Voorafscheidingsfilters	Miltenyi Biotech	130-041-407
Grote celkolommen	Miltenyi Biotech	130-042-202	Deze kolommen worden geleverd met een flow resistor. Het gebruik van de flow resistor is niet nodig om de hoge myogene zuiverheden hier beschreven te verkrijgen.
LS kolommen	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Separator	Miltenyi Biotech	130-042-102	Deze separator past op de grote celkolom, maar niet op de LS kolom.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Moet voor gebruik gefilterd worden
Oil Red O	Sigma	O0625
Triethylfosfaat	Sigma	538728
Whatman Papier	Sigma	Z241121-1PAK	Nr. 42, Asloos. Om het filter voor te bereiden, vouw het ronde filterpapier om een halve cirkel te maken, vouw vervolgens de halve cirkel nogmaals in het half om een kegelvorm te vormen. Plaats de kegel in een trechter voor het filteren.
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	Dit kan worden gekocht met of zonder DAPI en dooft geen initiële fluorescentie.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (gekocht bij Pugh Computers)	ADPH16982*