We ontwikkelden een eenvoudig aan te passen streng-specifieke fluorescente in situ hybridisatie (FISH) protocol gecombineerd met immunofluorescentie. Dit maakt een gedetailleerde onderzoek mogelijk van RNA-dynamica met gelijktijdige inzicht in de chromatinestructuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie op enkelcellig niveau.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Combineren RNA fluorescente in situ hybridisatie (FISH) met immunofluorescentie (immuno-FISH) maakt een techniek die kan worden toegepast bij de enkele cel niveau om de ruimtelijke dynamiek van RNA lokalisatie met gelijktijdige inzicht detecteren in de lokalisatie van eiwitten, epigenetische veranderingen en andere details die kan worden benadrukt door immunofluorescentie. X-chromosoom inactivatie is een paradigma voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) gemedieerde silencing. X-inactief specifieke transcript (Xist) lncRNA accumulatie (genoemd Xist cloud) op één van de twee X-chromosomen in zoogdiercellen vrouwen is een kritieke stap voor X-chromosoom inactivatie initiëren. Xist RNA direct of indirect in wisselwerking met diverse chromatine-modificerende enzymen en introduceert verschillende epigenetische landschappen tot het inactieve X-chromosoom (Xi). Een bekende epigenetische kenmerk van de Xi is de histon H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) wijziging. Hier wordt een eenvoudige en snelle immuno-FISH beschrijven weprotocol voor het opsporen Xist RNA met behulp van RNA FISH met meerdere oligonucleotidenprobes combinatie met immunofluorescentie van H3K27me3 om de lokalisatie van Xist RNA en bijbehorende epigenetische veranderingen te onderzoeken. Met oligonucleotide probes resulteert in een kortere incubatietijd en gevoeligere detectie van Xist RNA vergeleken met in vitro getranscribeerd RNA probes (riboprobes). Dit protocol biedt een krachtige tool voor het begrijpen van de dynamiek van lncRNAs en de bijbehorende epigenetische modificatie, chromatine structuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie.
Inleiding
Zoogdier X-chromosoom inactivatie (XCI) een strategie ter compensatie van de onbalans in X-gebonden gen doseringen XX en XY, waarbij één van de twee X-chromosomen bij vrouwen transcriptioneel geïnactiveerd 1. X-chromosoom inactivatie is een geweldige modelsysteem voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) onderzoek. X-chromosoom inactivatie wordt geregeld op verschillende lncRNAs, en is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia om de overspraak mechanismen tussen lncRNAs, transcriptie, chromatine structuur en nucleaire organisatie 2, 3 ontdekken.
De X inactivatie centrum (XIC) op het X-chromosoom is een complexe gen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Probe Voorbereiding
- Het verkrijgen van meerdere unieke oligonucleotiden in Xist (20-30 nucleotide-lengte oligonucleotiden, 63-65 ºC smelttemperatuur, tabel 1) met een 5'-amino modificatie en te schorten in het water.
- Pool equimolaire hoeveelheden oligonucleotiden met 5'-amino modificatie (totaal 4,5 ug) en label met amine-reactieve fluorescerende kleurstof volgende instructies van de fabrikant.
- Los de samengevoegde oligonucleotiden in finale 5 pl nuclease-vrij water en voeg 3 ul van 1 M natriumbicarbonaat de oligonucleotide oplossing.
- Voeg 2 pl DMSO aan de flacon van amine-reactieve kleurstof en vort....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Representatieve beelden van snelle immuno-FISH zijn weergegeven in figuur 1A. Co-lokalisatie van de Xist RNA wolk en H3K27me3 signaal op de Xi werd ontdekt in het onderscheiden vrouwelijke cellen. Op dag 12 na differentiatie, meer dan 90% EB-cellen hadden een Xist wolk (Figuur 1B). Korte oligonucleotideprobes efficiënt doorgedrongen in de kernen, wat leidt tot een visualisatie van bijna alle H3K27me3 signalen gecolokaliseerd met Xist RNA (figuur 1C, 97%, n = 150).
<.......Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel hebben we een snelle immuno-FISH protocol dat minder dan 5 uur duurt om dia voorbereiding, Xist RNA FISH, en immunofluorescentie voor H3K27me3 voltooien gepresenteerd. In vergelijking met de algemene immuno-FISH aanpak Xist RNA detectie, die meestal nodig overnacht incuberen RNA FISH dit protocol niet alleen aanzienlijk minder tijd, maar verbetert ook de gevoeligheid van immuun-FISH gebruik van oligonucleotide probes.
Aangezien Xist wordt sterk getranscribeerd in X-chromosoom .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten zijn verklaard.
Dankbetuigingen
We danken Hongjae Sunwoo voor het nuttige advies voor oligonucleotide-ontwerp in RNA FISH. We danken ook Serenity Curtis voor het redigeren van het manuscript. N.Y. werd ondersteund door een postdoctorale beurs voor onderzoek in het buitenland van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). Dit werk werd ondersteund door de NIH (RO1-GM102184), de March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), en de Ontwikkelingsfonds en Trustee Grant bij Cincinnati Children's Hospital Medical Center aan Y.O.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| oligonucleotides met 5’-amino modificatie | IDT | ||
| Alexa Fluor 488 Reactieve Kleurstof | Life Technologies | A32750 | |
| MicroSpin G-25 kolommen | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 | |
| Bovine Serum Albumine, Moleculaire Biologie Kwaliteit (voor hybridisatie buffer) | Roche | 10715859103 | |
| Histone H3K27me3 antilichaam | Active Motif | 61017 | |
| Alexa Fluor 555 Geit Anti-Muis, sterk gekruist-geadsorbeerd | Life Technologies | A21424 | |
| ProLong Gold antifade reagens | Life Technologies | P36931 |
Referenties
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
