Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie

13.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52053

⸱

26 november 2014

 ,  ,  ,  , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We ontwikkelden een eenvoudig aan te passen streng-specifieke fluorescente in situ hybridisatie (FISH) protocol gecombineerd met immunofluorescentie. Dit maakt een gedetailleerde onderzoek mogelijk van RNA-dynamica met gelijktijdige inzicht in de chromatinestructuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie op enkelcellig niveau.

Samenvatting

Combineren RNA fluorescente in situ hybridisatie (FISH) met immunofluorescentie (immuno-FISH) maakt een techniek die kan worden toegepast bij de enkele cel niveau om de ruimtelijke dynamiek van RNA lokalisatie met gelijktijdige inzicht detecteren in de lokalisatie van eiwitten, epigenetische veranderingen en andere details die kan worden benadrukt door immunofluorescentie. X-chromosoom inactivatie is een paradigma voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) gemedieerde silencing. X-inactief specifieke transcript (Xist) lncRNA accumulatie (genoemd Xist cloud) op één van de twee X-chromosomen in zoogdiercellen vrouwen is een kritieke stap voor X-chromosoom inactivatie initiëren. Xist RNA direct of indirect in wisselwerking met diverse chromatine-modificerende enzymen en introduceert verschillende epigenetische landschappen tot het inactieve X-chromosoom (Xi). Een bekende epigenetische kenmerk van de Xi is de histon H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) wijziging. Hier wordt een eenvoudige en snelle immuno-FISH beschrijven weprotocol voor het opsporen Xist RNA met behulp van RNA FISH met meerdere oligonucleotidenprobes combinatie met immunofluorescentie van H3K27me3 om de lokalisatie van Xist RNA en bijbehorende epigenetische veranderingen te onderzoeken. Met oligonucleotide probes resulteert in een kortere incubatietijd en gevoeligere detectie van Xist RNA vergeleken met in vitro getranscribeerd RNA probes (riboprobes). Dit protocol biedt een krachtige tool voor het begrijpen van de dynamiek van lncRNAs en de bijbehorende epigenetische modificatie, chromatine structuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie.

Inleiding

Zoogdier X-chromosoom inactivatie (XCI) een strategie ter compensatie van de onbalans in X-gebonden gen doseringen XX en XY, waarbij één van de twee X-chromosomen bij vrouwen transcriptioneel geïnactiveerd 1. X-chromosoom inactivatie is een geweldige modelsysteem voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) onderzoek. X-chromosoom inactivatie wordt geregeld op verschillende lncRNAs, en is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia om de overspraak mechanismen tussen lncRNAs, transcriptie, chromatine structuur en nucleaire organisatie 2, 3 ontdekken.

De X inactivatie centrum (XIC) op het X-chromosoom is een complexe genetische locus bestaat uit een aantal genen die niet-coderende RNA's 4. X-inactief specifieke transcript (Xist) lncRNA in eutherian zoogdieren is een dergelijke lncRNA die een cruciale rol in X-chromosoom inactivatie 5,6 speelt. Xist transcripties rondom de locatie van de futuur Xi aan X-chromosoom inactivatie initiëren, en verschijnen als een wolk bij gevisualiseerd met behulp van RNA FISH; Deze informatie is aangeduid als de "Xist Wolk" 7. Sinds Xist RNA interageert met verschillende chromatine-modificerende enzymen, is co-lokalisatie van de Xist wolken met verschillende epigenetische modificaties voor een stille chromatine en repressieve transcriptie waargenomen tijdens X-chromosoom inactivatie 8. Bijvoorbeeld, Xist RNA wisselwerking met polycomb repressieve complexe 2 (PRC2) die verantwoordelijk is voor H3K27me3 en induceert een repressieve chromatine staat 9. Het optreden van de Xist wolk op de Xi en zijn co-lokalisatie met de intensieve H3K27me3 wijziging een facultatieve heterochromatine landschap van de Xi 10,11.

Cytogenetische technieken, zoals DNA / RNA FISH hebben een lange weg van de traditionele methode met behulp speurstoffen 12 tot recente en geavanceerde technieken met verbeterde gevoeligheid enfluorescente beeldvorming met meerdere oligonucleotideprobes 13,14. DNA / RNA FISH combinatie met immunofluorescentie werd routinematig gebruikt als een instrument om cytologische spatiotemporele nucleaire organisatie, RNA lokalisatie, chromatinestructuur en modificaties begrijpen. De meeste standaard probe voorbereiding voor RNA FISH omvat het gebruik van plasmide of bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) klonen en hun verdere kenmerken hetzij nick-translatie of willekeurige priming 15. Echter, bijna 70% van de genen in muizen en 40% van genen bij de mens een overlap vertonen van sense en antisense transcripten 16, waardoor het met een strengs specifieke FISH methode om sense en antisense transcripten onderscheiden. In vitro getranscribeerde RNA probes (riboprobe ) worden vaak gebruikt voor strengs specifieke RNA FISH 17,18; echter, gaat het bereiden van een plasmide kloon of PCR product met T7, SP6 of T3-promotor en synthetiseren riboprobes. Bovendien riboprobes ontleend genomic DNA of cDNA bevatten vaak aspecifiek gebieden en repetitieve elementen, die resulteren in hoge achtergrondruis. Een ander probleem is dat riboprobes, die enkele honderden nucleotiden lang en bevatten meerdere fluoroforen, niet efficiënt kunnen doordringen in de kern. Om dit te omzeilen, hebben meerdere kortere oligonucleotide probes gelabeld met een fluorofoor aan het einde ontwikkeld die goede gevoeligheid, uniform signaalsterkte en gemak van zuivering en behandeling 14 hebben. Daarnaast DNA oligonucleotiden algemeen stabieler dan RNA. We pasten een soortgelijke strategie waarbij oligonucleotiden Xist RNA FISH 19 met immunofluorescentie de epigenetische dynamiek van de Xi geïnduceerd door Xist lncRNA tijdens het X-chromosoom inactivatie begrijpen. Dit protocol wordt het maken van oligonucleotideprobes en goede voorbereiding van cellen, alsook het gebruik van immunofluorescentie en RNA FISH. Xist RNA FISH gebruik van meerdere oligonucleotides is goedkopere wijze op de lange termijn als Xist RNA FISH routinematig uitgevoerd in een laboratorium. Deze techniek kan worden gebruikt om cellen te identificeren lncRNAs in kaart brengen en tegelijkertijd de co-lokalisatie met epigenetische veranderingen of factoren. Een groot voordeel van het protocol is de mogelijkheid om gemakkelijk passen een onderzoek interesses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Probe Voorbereiding

  1. Het verkrijgen van meerdere unieke oligonucleotiden in Xist (20-30 nucleotide-lengte oligonucleotiden, 63-65 ºC smelttemperatuur, tabel 1) met een 5'-amino modificatie en te schorten in het water.
  2. Pool equimolaire hoeveelheden oligonucleotiden met 5'-amino modificatie (totaal 4,5 ug) en label met amine-reactieve fluorescerende kleurstof volgende instructies van de fabrikant.
    1. Los de samengevoegde oligonucleotiden in finale 5 pl nuclease-vrij water en voeg 3 ul van 1 M natriumbicarbonaat de oligonucleotide oplossing.
    2. Voeg 2 pl DMSO aan de flacon van amine-reactieve kleurstof en vortex kort.
    3. Meng de oligonucleotide oplossing met de reactieve kleurstof in DMSO en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker.
  3. Zuiver het fluorescent gelabelde oligonucleotide probes door G-25 kolom, gevolgd door ethanolprecipitatie.
    1. Centrifuge G-25 kolom bij 750 xg gedurende 1 min tot overmaat opslagbuffer verwijderen.
    2. Voeg 40 ul nuclease-vrij water aan de etikettering mengsel verkregen in stap 1.2.3 en gelden voor de G-25 kolom. Centrifugeer bij 750 xg gedurende 2 min.
    3. Voeg 50 ul nuclease-vrij water, 10 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 250 gl ethanol de gezuiverde probe uit stap 1.3.2. Bewaren bij -80 ° C gedurende 30 minuten en centrifugeer bij 21.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
    4. Was de neergeslagen oligonucleotiden eenmaal met 1 ml 70% ethanol.
    5. Resuspendeer in 50 ul nuclease-vrij water of TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) voor een uiteindelijke concentratie van ongeveer 10 uM.
  4. Verdun de fluorescent gelabelde oligonucleotide probes tot een eindconcentratie van 250 nM met hybridisatiebuffer (10% formamide, 2x SSC [300 mM NaCl, 30 mM natriumcitraat]; 2 mg / ml BSA, 10% dextransulfaat).
    OPMERKING: Met deze snelle FISH protocol, oligonucleotide probes in Xist werden ontworpen en gebruikt in een hogere concentratie dan normaal FISH protocol oligonucleotideprobes te gebruiken om de incubatietijd voor hybridisatie verkorten.

2. Schuif Voorbereiding

OPMERKING: Dia's kunnen worden voorbereid voor immuno-FISH gebruik van muis embryonale stamcellen (ES) of embryoid lichaam (EB) differentiëren cellen 20, 21 door rechtstreeks ofwel groeien ze op een poly-lysine-behandelde dia of met behulp van cytospin met celsuspensie. Hier wordt de voorbereiding dia door cytospin getoond.

  1. Zuig het kweekmedium in een 6-putjes. Wassen met PBS (kamertemperatuur), en zuig grondig.
  2. Voeg 0,5 ml van trypsine aan de 6-putjes, geïncubeerd gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C.
  3. Voeg 5 ml medium en verspreiden cellen door voorzichtig en neer te pipetteren meerdere malen.
  4. Overdracht cellen om een ​​15 ml buis centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g bij kamertemperatuur.
  5. Gooi het medium eend voorzichtig schorsen de cellen in 2 ml PBS.
  6. Tellen cellen met hemocytometer en verdund celsuspensie bij 4 x 10 5 cellen / ml PBS.
  7. Monteer een glijbaan, een filter-kaart en een kamer met een clip en plaats ze in de juiste sleuven in de rotor van de cytospin. Voeg 250 ul van elk bereid in stap 2.6 in elke kamer van de gemonteerde eenheden in de cytospin monster. Centrifugeer bij 1500 rpm gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  8. Vul 3 Coplin potten op ijs met 40 ml van ijskoude PBS, CSK buffer (10 mM PIPES, pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2), en CSKT buffer (CSK buffer met 0,5% Triton X-100), respectievelijk.
  9. Nadat de cytospin klaar snel de schuif over in ijskoude PBS en incubeer gedurende 5 min.
  10. Breng de dia in ijskoud CSK buffer en incubeer gedurende 1 min.
  11. Breng de dia in ijskoud CSKT buffer en incubeer gedurende 5 min.
  12. Breng de schuif terug in ijskoude CSK buffer en incubeer gedurende 1 min.
  13. Breng de schuif in 4% paraformaldehyde in PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

3. Immuunfluorescentie

  1. Plaats de objectglaasjes in een Coplin jar met PBST (1x PBS met 0,1% Tween-20) gedurende enkele seconden.
  2. Plaats de dia's schuin waardoor de resterende buffer te stromen van de glijbaan. Veeg overtollige vloeistof uit de dia en plaats het in een lege pipet-tip doos met water. Overlay de dia met 40 ul van blokkeeroplossing (1x PBS, 1% BSA, 0,1% Tween-20), plaats voorzichtig een dekglaasje en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder het dekglaasje, verwijder de blokkerende oplossing en voeg 40 ul van het histon H3K27me3 primaire antilichaam verdund tot een concentratie van 1: 500 in blokkeeroplossing. Plaats het dekglaasje terug op de glijbaan en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Een RNase-remmer in de blokkerende oplossing zou nuttig zijn om RNA in dit RNA FIS behoudenH-protocol wanneer polyklonale antilichamen worden gebruikt.
  4. Was schuif 2 keer Coplin potten gevuld met PBST gedurende 5 minuten elk, voorzichtig schudden tijdens het wassen.
  5. Plaats de dia's schuin waardoor de resterende buffer te stromen van de glijbaan. Veeg overtollige vloeistof en plaats de schuif terug in de doos tip. Overlay met 40 pl van het secundaire antilichaam (1: 500) verdund in blokkerende oplossing, plaats een dekglaasje en incubeer gedurende 15 minuten in het donker. Voor de volgende stappen, blijven de glijbaan in het donker te allen tijde.
  6. Was 2 keer Coplin potten met PBST zoals in stap 3.4.

4. RNA FISH met oligonucleotidenprobes

  1. Voorverwarmen lege pipet-tip box met water op de bodem om dia voorkomen drogen bij 37 ° C voor RNA FISH in stap 4.3.
  2. Plaats de dia's schuin waardoor de resterende buffer te stromen van de glijbaan. Veeg overtollige vloeistof uit de dia uit stap 3.6 en plaats de dia in de pipet-tip doos met water onderaan. Voeg 500 ul van FISH wasbuffer (10% formamide in 2x SSC) op het objectglaasje en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder FISH wasoplossing, voeg 8 pi oligonucleotide probes op de dia, plaats een dekglas en breng de dia naar een voorverwarmde pipet-tip box met water op de bodem; incuberen bij 37 ° C gedurende 1-2 uur.
  4. Plaats 3 voorverwarmde Coplin potten in een waterbad bij 37 ° C met FISH wasbuffer, FISH wasbuffer met DAPI, en 2x SSC.
  5. Na 1-2 uur incubatie voor RNA FISH, zet de schuif in de voorverwarmde FISH wasbuffer.
  6. Incubeer de glijbaan voor een paar minuten totdat het dekglaasje valt van de schuif.
  7. Plaats de schuif weer in de wasbuffer, en verder incuberen gedurende 5 min.
  8. Breng de dia naar een andere Coplin pot met voorverwarmd FISH wasbuffer met 0,5 ng / ml DAPI en incubeer gedurende 5 min.
  9. Breng de dia naar een andere Coplin pot met voorverwarmde 2x SSC en incubeer gedurende 5 kmn.
  10. Plaats de dia's schuin waardoor de resterende buffer te stromen van de glijbaan. Veeg overtollige vloeistof en plaats de schuif terug in een droge tip doos. Voeg 4 ul van antifade met DAPI op de dia en plaats een dekglaasje.
  11. Dicht de dekglaasje met nagellak en observeren onder een microscoop. De slede is bij 4 ° C worden bewaard in het donker gedurende enkele maanden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Representatieve beelden van snelle immuno-FISH zijn weergegeven in figuur 1A. Co-lokalisatie van de Xist RNA wolk en H3K27me3 signaal op de Xi werd ontdekt in het onderscheiden vrouwelijke cellen. Op dag 12 na differentiatie, meer dan 90% EB-cellen hadden een Xist wolk (Figuur 1B). Korte oligonucleotideprobes efficiënt doorgedrongen in de kernen, wat leidt tot een visualisatie van bijna alle H3K27me3 signalen gecolokaliseerd met Xist RNA (figuur 1C, 97%, n = 150).

<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit artikel hebben we een snelle immuno-FISH protocol dat minder dan 5 uur duurt om dia voorbereiding, Xist RNA FISH, en immunofluorescentie voor H3K27me3 voltooien gepresenteerd. In vergelijking met de algemene immuno-FISH aanpak Xist RNA detectie, die meestal nodig overnacht incuberen RNA FISH dit protocol niet alleen aanzienlijk minder tijd, maar verbetert ook de gevoeligheid van immuun-FISH gebruik van oligonucleotide probes.

Aangezien Xist wordt sterk getranscribeerd in X-chromosoom ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

Dankbetuigingen

We danken Hongjae Sunwoo voor het nuttige advies voor oligonucleotide-ontwerp in RNA FISH. We danken ook Serenity Curtis voor het redigeren van het manuscript. N.Y. werd ondersteund door een postdoctorale beurs voor onderzoek in het buitenland van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). Dit werk werd ondersteund door de NIH (RO1-GM102184), de March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), en de Ontwikkelingsfonds en Trustee Grant bij Cincinnati Children's Hospital Medical Center aan Y.O.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
oligonucleotides met 5’-amino modificatieIDT
Alexa Fluor 488 Reactieve KleurstofLife TechnologiesA32750
MicroSpin G-25 kolommenGE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
Bovine Serum Albumine, Moleculaire Biologie Kwaliteit (voor hybridisatie buffer)Roche10715859103
Histone H3K27me3 antilichaamActive Motif61017
Alexa Fluor 555 Geit Anti-Muis, sterk gekruist-geadsorbeerdLife TechnologiesA21424
ProLong Gold antifade reagensLife TechnologiesP36931

Referenties

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171(2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Histon H3K27me3oligonucleotide sondesembryonale lichaamsstambencytospin preparaatfluorescentiemicroscopieepigenetische modificatie
Snel Fluorescent In Situ Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.