Larvale RNA interferentie in de Rode Bloem Kever, Tribolium castaneum

Samenvatting

RNA-interferentie (RNAi) gebaseerde gen knockdown technieken vormen de kern van Tribolium onderzoek. Hier geven we een overzicht van onze larvale RNAi techniek Tribolium castaneum. Larvale RNAi is een eenvoudige, maar krachtige techniek die een snelle toegang tot verlies-van-functie fenotypes biedt, waardoor onderzoekers om de functie van genen te bestuderen in verschillende contexten.

Samenvatting

De rode bloem kever, Tribolium castaneum, biedt een repertoire van experimentele instrumenten voor genetische en ontwikkelingsstoornissen studies, waaronder een volledig geannoteerde genoomsequentie, transposon gebaseerde transgenese en effectieve RNA interferentie (RNAi). Onder deze voordelen, RNAi-gebaseerde gen knockdown technieken vormen de kern van Tribolium onderzoek. T. castaneum tonen een krachtige systemische RNAi reactie, waardoor het mogelijk RNAi op elk gewenst levensfase door simpelweg injecteren van dubbelstrengs RNA (dsRNA) in de kever lichaamsholte.

In dit rapport geven we een overzicht van onze larvale RNAi techniek in T. castaneum. Het protocol omvat (i) isolatie van de echte fase van T. castaneum larven voor injectie, (ii) voorbereiding van de injectie-instelling, en (iii) dsRNA injectie. Larvale RNAi is een eenvoudige, maar krachtige techniek die ons voorziet van een snelle toegang tot verlies-van-functie phenotypes, inclusief meerdere genen knockdown fenotypen en een reeks hypomorfe fenotypen. Aangezien bijna alle T. castaneum weefsels gevoelig voor extracellulaire dsRNA, de larvale RNAi techniek stelt onderzoekers diverse weefsels in diverse contexten, waaronder de genetische basis van organismale responsen in het milieu te bestuderen. Bovendien, de eenvoud van deze techniek stimuleert meer student betrokkenheid bij onderzoek, waardoor T. castaneum een ideale genetische systeem voor gebruik in een klaslokaal.

Inleiding

De rode bloem kever, Tribolium castaneum, wint aan populariteit in verschillende domeinen van de biologie deels te wijten aan het gemak van het uitvoeren van RNA interferentie (RNAi) ^1-3. RNAi-gebaseerde gen knockdown technieken kunnen wetenschappers voeren verlies-van-functie analyseert, zonder gebruik te maken van complexe genetische methoden. T. castaneum tonen een krachtige systemische RNAi reactie, waardoor het mogelijk RNAi op elk gewenst stadium door eenvoudige injectie van dubbelstrengs RNA (dsRNA) in de kever lichaamsholte ^4-6. Gelijktijdige knockdown van meerdere genen is ook mogelijk in T. castaneum door het injecteren van twee of meer verschillende dsRNA moleculen tegelijk ^7,8. Bovendien kan een reeks hypomorfe fenotypen gegenereerd door de concentratie van de geïnjecteerde dsRNA ^8. Deze eigenschappen maken-RNAi gebaseerde omgekeerde genetische technieken aantrekkelijke alternatieven voor de traditionele forward genetics in T. castaneum. Aangezien bijnaalle T. castaneum weefsels gevoelig voor extracellulaire dsRNA moleculen ⁹ laat deze techniek onderzoekers diverse weefsels in diverse contexten bestuderen. Bovendien, hoewel dit rapport richt zich op het uitvoeren van RNAi in T. castaneum veel hier beschreven zijn voor andere insecten. Daarom is dit protocol is handig voor degenen die wensen te vervullen verlies-van-functie analyseert in hun context van belang bij T. castaneum, evenals voor onderzoekers die een RNAi-gebaseerde techniek voor andere insecten.

Injecteren dsRNA tot larven maakt de functionele analyse op diverse kever levensfasen, inclusief tegen de larve, popstadium, en volwassen stadia ^4,5,10. We hebben eerder gemeld onze algemene larvale RNAi protocol zoals moleculaire biologie procedures ^11. In het huidige rapport, richten we ons op het beschrijven van de dsRNA injectie procedures, die zijn het beste uitgelegd met visuele hulpmiddelen. Wij biedenuitvoerige stap-voor-stap injectieprocedures evenals goede en slechte injectie voorbeelden. Deze visuele protocol vormt een aanvulling op onze vorige protocol, en wanneer het wordt gecombineerd, ze zorgen voor een meer uitgebreid overzicht van de larvale RNAi procedures in T. castaneum. Daarnaast bespreken we parameters voor dsRNA moleculen die het succes van RNAi toepassing van RNAi-gebaseerde testen voor fysiologisch onderzoek, alsmede de toepassing van de larvale RNAi protocol in een leer laboratorium beïnvloeden.

Protocol

1 T. castaneum Voorraden en kweken

1. Beslis over een T. castaneum stam gebruikt voor het experiment.
   OPMERKING: Verschillende-lab opgericht T. castaneum stammen beschikbaar. Ga-1 (Georgia-1) is de ouderstam van Ga-2 die werd gebruikt voor genoom ^3. Aangezien Ga-1 aandelen meest DNA polymorfismen (zoals single nucleotide polymorphisms, SNPs) met Ga-2 en gezonder is dan Ga-2 door minder inteelt, het is ideaal voor RNAi experimenten. Pu-11 is een andere handige stam te gebruiken , zoals de unieke verbeterde geel fluorescerend eiwit (EYFP) expressie in de toekomst vleugel primordia stelt ons in staat om de laatste larvale instar van andere stadia te onderscheiden (zie Figuur S4 van Clark-Hachtel et al. 2013 ^12). Het is belangrijk om te documenteren dat beetle stam werd gebruikt in het experiment, zoals genetische achtergronden bijvoorbeeld verschijnen affect de RNAi fenotypen ^13.
2. Bereid T. castaneum cultuur meel met 5% toe te voegen (in gewicht) van gist vooraf gezeefd brouwer om meel organisch volkoren (na mengen, slaan de kweek meel bij -20 ° C). Aliquot de kweek meel (bij kamertemperatuur) in 6 ml plastic Drosophila voorraad flessen (ongeveer 40 g / fles).
3. Cultuur T. castaneum bij 30 ° C met 70% luchtvochtigheid. Gebruik een luchtvochtigheid gecontroleerde incubator indien mogelijk. Voeg 30-40 volwassenen per cultuur fles (man: vrouw verhouding 1: 1) aan de cultuur beginnen.
   Opmerking Hoewel matrijs zelden een probleem bij 30 ° C, lagere temperaturen (bijvoorbeeld 25 ° C) met 70% vochtigheid kunnen schimmelgroei in de kweek bloem veroorzaken. Verlaag de luchtvochtigheid als dit gebeurt.
4. Breng de volwassenen om een ​​nieuwe cultuur fles elke twee weken voor subcultuur (zie stap 5,2-5,5 voor hoe volwassenen van bloem cultuur te isoleren).
   OPMERKING: Het duurt ongeveer drie weken de tijd om de larven van de laatste instar verkrijgen. Alternatieftend, T. castaneum culturen bij een lagere temperatuur (20-25 ° C) worden gehouden, zij het ​​met een lange kweekperiode (ontwikkelingstijd bij 25 ° C is ongeveer het dubbele bij 30 ° C).

2 Voorbereiding van oplossingen en instrumenten voor Larvale dsRNA Injectie

1. Samenstel dsRNA moleculen homoloog aan het doelgen door in vitro transcriptie. Bewaren bij -80 ° C. Zie Philip en Tomoyasu 2011 ¹¹ voor gedetailleerde moleculaire biologische werkwijzen. Zie tevens voor een aantal parameters die moeten worden overwogen bij het ontwerpen dsRNA moleculen.
2. Voeg 10 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,6 bij 25 ° C) door mengen van 8,5 ml van 1 M Na ₂ HPO ₄ 1,5 ml van 1 M NaH _{2PO 4.} Controleer de pH met een pH-meter en dienovereenkomstig aanpassen.
3. Voeg 1 ml van 10x injectie buffer door 10 pl van 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,6 bij 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M KCl, 100 ui groene voedingskleurstof en 790 ui dubbel gedestilleerd water (DDH ₂ O). Verdun de 10x injectie buffer om 2x injectie buffer (200 ul 10x injectie buffer + 800 ul DDH ₂ O) te maken. WINKEL zowel 10x en 2x injectie buffers bij 4 ° C totdat het nodig is.
4. Bereid Sticky glazen dia's.
   1. Bedek een hele glasplaatje met een vorm van herpositioneerbare lijm voor larvale injecties. Voor een volwassene of pupal injecties, maken twee dunne reepjes van lijm langs de lange randen van de glijbaan.
   2. Laat de lijm drogen meerdere dagen, die ervoor zorgt dat de lijm nog kleverig genoeg kevers de dia hechten, maar ook de overblijvende buigzaam genoeg om hun verwijdering na injectie te vergemakkelijken.
      OPMERKING: Als de lijm blijft te plakkerig, gebruik dan een vinger en tik op de lijm, die de kleverigheid zal verminderen. Elke dia kan maximaal 40 of 50 kevers, en kan worden hergebruikt totdat het er niet in slaagt om veilig te houden van de dieren. Alternatively kunnen dubbelzijdige tape worden gebruikt, hoewel de band is soms niet genoeg om de larven te houden lijm.
5. Maak een etherisatie Mand.
   1. Verwijder de zuiger uit een 10 ml wegwerpspuit, en snijd de spuit in de helft rond de 6 ml lijn.
   2. Gooi de onderste helft van de spuit. Kort verwarmen het snijvlak van het bovenste gedeelte van de spuit met een gasbrander en snel op een stuk nylon mesh duwen de gesmolten kunststof die de mazen op de injectiespuit lijm. Knip het overtollige gaas zodra de plastic verhardt.
6. Bereid de ether fles. Voeg 30 ml ether in een smalle mond 100 of 250 ml glazen fles. Voeg verschillende stukken vloeipapier om de verdamping van ether verbeteren.
   OPMERKING: Ether levert brandgevaar en is ook schadelijk. Handvat ether altijd onder een afzuigkap. Sluit het deksel stevig vast terwijl het niet in gebruik is.
   OPMERKING: Het ijs kan worden gebruikt als een veiliger alternatief (zoals in een klaslokaal), hoewel de sedation is minder effectief.

3 Voorbereiding van Larval Injectie Apparatus

1. Een XY kruistafel op een dissectie microscoop.
   OPMERKING: XY mechanische stadia zijn verkrijgbaar bij grote microscoop bedrijven. Alternatief kan goedkoop microscoop fasen worden gebruikt voor de meeste ontleden microscopen met enkele wijzigingen (zie Materialen tabel bijvoorbeeld).
2. Plaats een mechanische manipulator naald in de buurt van de XY kruistafel.
3. Monteer een injectie spuit. Gebruik een vier-weg kraan (met Luer verbindingen) een 30 ml wegwerpspuit verbinding met een glas naaldhouder, waardoor manipulatie van de injectiespuit zonder de druk in de injectienaald (zie Philip en Tomoyasu 2011 ¹¹ voor het openen injectiespuit assemblage).

4 Pulling injectienaalden

1. Trek borosilicaatglas naalden (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm lang) met eennaald trekker.
   OPMERKING: Voor Sutter P-87 of P-97, gebruikt u de instelling "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tijd = 90" of volg hoofdstuk 2 van de Pipette Kookboek Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, en zebravis - Aanbevolen Programma. De optimale instellingen variëren afhankelijk van het model van de naald trekker. Het decor voor een generieke Drosophila injectienaald is een goed uitgangspunt.
2. Winkel trok naalden in een plastic behuizing (bijvoorbeeld een plastic cd-doosje) en zet deze vast met afneembare montage stopverf.

5 Isolatie en Selectie van Larven

1. Plaats een # 25 zeef op een zeef ontvanger.
2. Breng de inhoud van de Kultuurfles (kevers en meel cultuur) op zeef onmiddellijk zeef de inhoud. Laat de inhoud van de zeef niet verlaten zonder het ziften, zoals larven zullen snel proberen te graven door de zeef en vast komen te zitten. Agressief ziften de inhoud aan de bloem te laten vallendoor en laat oudere larven (meestal ^6e en ^7e instar larven), poppen en volwassen (samen met hun afgedankte cuticula, exuviae) achter bovenop de zeef.
3. Breng het op de zeef (kevers en exuviae) het zaad pan materialen. Houd de pan om te voorkomen dat de kevers ontsnapt tikken.
4. Verwijder de exuviae en bloemdeeltjes dat op het oppervlak van de kevers door zachtjes blazen via zaad pan.
5. Tik het zaad pan om de inhoud naar de onderkant van de pan. Dan, laat de pan nog niet aangeboorde gedurende enkele seconden. Wachten voor de volwassenen, die mobieler dan andere stadia zijn, om uit te komen van de stapel. Verwijder volwassenen met een kunst penseel (bijvoorbeeld 1 cm breedte).
6. Afzonderlijke poppen door voorzichtig kloppen de zaad pan terwijl de monding van de pan iets omlaag, zoals poppen neiging om sneller naar de mond rollen. Gebruik een penseel om de poppen te verwijderen, waardoor alleen de larven op het zaad pan.
7. Place de geïsoleerde larven in een schone petrischaal. Selecteer een geschikt stadium van de larven voor injectie en plaats ze in een aparte petrischaal.
   OPMERKING: larven Begin vorig instar (1-2 dagen na de laatste larvale molt) zijn vaak geschikt zijn bij het analyseren van de RNAi effect op volwassen morfologie als op metamorfose. Het is echter soms noodzakelijk om RNAi presteren op de voorlaatste (of zelfs eerder) stadium te vroeg gen-functie te evalueren (bijvoorbeeld figuren 3E-3H. Zie ook Clark-Hachtel et al. 2013 ^12). Gebruik poppen als een grootte verwijzing naar de instar larven identificeren. De larven laatste instar zijn iets langer dan de poppen. Alternatief kan pu-11 worden gebruikt om de laatste instar larven identificeren en het tijdsverloop van de ontwikkeling van larven laatste instar (Figuur S4 van Clark-Hachtel et al. 2013 ¹²⁾ te bepalen.
8. Houd de geselecteerde larven in een petrischaal tot etherisatie. Leg de restvan larven en in andere stadia van kevers (zoals poppen en volwassenen) terug in een cultuur fles met bloem en terug te sturen naar de couveuse.

6 Voorbereiding van injectienaalden

1. Plaats een eerder getrokken glazen naald op een glazen objectglaasje met behulp van kleverige tack of dubbelzijdig tape. Behulp van een tang, het testen van de getrokken uiteinde van de naald tijdens het kijken door de microscoop ontleden om te zien waar de punt bochten. Pak het gebied enigszins in de richting van de punt kant van waar de naald bochten met de tang en draai te breken.
2. Houd goede naalden en gooi anderen. Overweeg een goede naald als het hebben van een opening die is niet te groot of te klein (ongeveer 0,05 mm diameter. Figuren 1A en 1B), en een hoek om de penetratie van de larvale cuticula makkelijker (Figuren 1B en 2A-2B) te maken. Overweeg een slechte naald als (i) te klein is, waardoor de opname van dsRNA oplossing in de naald moeicult (stap 7) (figuren 1D en 2D), (ii) te groot, waardoor larven schade en mogelijke letaliteit bij injectie (Figuren 1C en 2F), (iii) stomp, waardoor penetratie van de cuticula moeilijke en toenemende verwondingen.
3. Steek de naald in de naaldhouder.
   1. Eerst draai de punt van de naaldhouder en plaats de achterkant van de naald in de houder tip. Plaats vervolgens de rubber afdichting onder de houder tip (minimaal 1 cm vanaf de achterkant van de glazen naald).
   2. Plaats de achterkant van de naald in de houder, met de rubberen pakking geheel in de opening van de naaldhouder. Schroef de tip terug op de houder.
4. Plaats de geassembleerde naaldhouder op de naald manipulator. Houd de naald houder dicht bij horizontaal. Pas de positie van de manipulator, zodat de punt van de naald is gelegen in het centrum van het zicht bij het kijken door de microscope.

7 Frontloading dsRNA Oplossing in de Naald

1. Bereid de dsRNA injectieoplossing net vóór injectie door aanpassing van de concentratie DDH ₂ O en mengen van de dsRNA oplossing gelijke volumes 2x injectie buffer (stap 2.3). Houd de gemengde oplossing op ijs. Zie discussie over de dsRNA concentratie.
2. Snijd de punt van een 20 ul wegwerp pipet tip. Pipetteer 10 ul van de oplossing in de bijgesneden pipetpunt. Verwijder voorzichtig de pipet tip van de pipet terwijl u de vloeistof aan het uiteinde door het verstrekken van tegendruk. Alternatief, verwijder voorzichtig de punt en vervolgens de oplossing op het einde van de tip door druk met een vinger.
3. Plaats de pipetpunt met dsRNA oplossing op de microscooptafel middels kleverig kopspijker met de opening naar de punt van de naald.
4. Kijken door de microscoop, langzaam bewegen de geladen tip in de richting van de naald tot aan de punt van denaald zich net in de geladen pipet en in de oplossing.
5. Kijk door de microscoop, trek de zuiger van de injectiespuit langzaam trek de dsRNA oplossing in de naald.
   OPMERKING: Raak de naald niet te vol. Als het einde van het dsRNA oplossing zal de punt van de naald, vertragen de snelheid van het trekken en stoppen laden van de oplossing vóór de punt van de naald zou lucht bereikt. Als er lucht de tip bereikt, zal de oplossing snel worden getrokken in de naaldhouder, wat resulteert in ernstige verontreiniging kwesties. Gedetailleerde reinigingsprocedures van de naaldhouder worden beschreven in Philip en Tomoyasu 2011 ^11.
6. Haal de druk van de injectie spuit en naald houder door het openen van de kraan. Beweeg de pipet uit de buurt van de punt van de naald. Zet de naald omhoog vanaf het podium om te voorkomen dat per ongeluk schade aan de naald, terwijl het plaatsen van de larven op het podium. Verwijder het geleegd pipet tip van het podium.

8 dsRNA Injectie

1. Plaats de larven in de etherisatie mand. Met minder dan 10 larven als het leren van de techniek. Gebruik 30-40 larven in een ronde eenmaal vertrouwd bent met de techniek.
2. Plaats de mand met larven in de ether fles en sluit het deksel.
   OPMERKING: Ether levert brandgevaar en is ook schadelijk. Voer deze stap onder een afzuigkap.
3. Etherize larven gedurende ongeveer 3 minuten. Controleer de larven voor beweging na 3 min. Weer terugplaatsen in de ether fles nog 30 seconden als ze nog steeds in beweging. Niet Etherize langer dan 5 minuten en deze letaliteit kan verhogen.
   OPMERKING: De optimale etherisatie kan variëren afhankelijk van de temperatuur en vochtigheid.
4. Breng de etherized larven van de mand om de kleefvrije rand van een glas kleverige dia. Met behulp van een tang en terwijl kijken door de microscoop, pick-up elke larven een voor een en leg ze op de dia. Leg ze opzij en tik zachtjes naar beneden hun lichaam from kop tot staart met de tang, ze iets in rekken als je gaat, om ervoor te zorgen dat ze worden bevestigd op de dia.
5. Leg de kleverige dia met larven op de microscoop podium.
6. Steek de dsRNA geladen naald voorzichtig in de dorsale zijde van de larven te voorkomen dat schade aan het centrale zenuwstelsel. Ook voorkomen dat de dorsale middellijn, als de larvale hart is hier gevestigd. In deze en volgende stappen altijd de fase de larven over de naald (plaats van de naald manipulator om de naald te bewegen).
   OPMERKING: De specifieke injectieplaats maakt niet uit als RNAi in T. castaneum lijkt systemisch zijn. Het is echter gewoonlijk het gemakkelijkst om te injecteren op de dorsale zijde van de thoracale of abdominale segmenten.
7. Na het inbrengen van de naald in de larven, trek de naald iets terug naar de kamer zorgen voor de dsRNA om de larvale lichaamsholte voeren.
8. Druk voorzichtig op de injectiespuit totdat de larven worden groen (of de kleur van de injectie buffer) en een stretched en vol.
   OPMERKING: Indien de techniek leert, probeer zoveel mogelijk injecteren om de hoeveelheid oplossing die kan worden geïnjecteerd in een larve zonder noemenswaardige letaliteit bepalen. Het is gewoonlijk ongeveer 0,5-0,7 pl.
9. Trek de naald uit de larven. Tijdens het verwijderen van de naald, iets terug te trekken op de injectie spuit om dsRNA verlies te voorkomen (ook voorzichtig zijn niet te trekken in de lucht).
10. Injecteren alle larven op de dia. Zorg ervoor dat de larven die niet met succes werden geïnjecteerd verwijderen. Compleet injectie voordat larven wakker (in ongeveer 10 min).
11. Verwijder de dia met ingespoten larven van de injectie microscoop en laat de dia nog 5 minuten totdat alle larven te herstellen van de verdoving.
12. Met een tang en onder een microscoop ontleden, til de larven van kop tot staart om ze los te maken van de kleverige glijbaan. Plaats de onlangs vrijgegeven larven in een schone petrischaal. Laat de larven op de petrischaal voor 10-15 minuten om de injectie toe wond te stollen.
13. Plaats de larven in een nieuwe fles met schone meel en label met de naam passend stam, het type dsRNA geïnjecteerd concentratie van dsRNA, aantal larven geïnjecteerd en de datum.
14. Cultuur de larven geïnjecteerd bij 30 ° C met 70% luchtvochtigheid. Let op de larven voor RNAi fenotypes regelmatig.
    OPMERKING: De laatste larven verpoppen instar binnen 7 dagen. Vervolgens wordt de poppen Eclose tot volwassenen na 7 dagen (als er geen afwijking in timing door RNAi).

9 Bevestiging van Knockdown en fenotypische analyses

1. Overweeg beoordeling efficiëntie van RNAi neerslaan door verschillende moleculaire biologische technieken, zoals kwantitatieve reverse transcriptie-PCR (qRT-PCR) en Western Blotting. Zie Miller et al. 2012 ⁷ en Philip en Tomoyasu 2011 ¹¹ voor gedetailleerde qPCR en Western Blot-protocol, respectievelijk.
2. Analyseer RNAi-gerelateerde fenotypes.
   OPMERKING: RNAi verwantefenotypen worden waargenomen op verschillende stadia en onder verschillende kweekomstandigheden, afhankelijk van de genen die waren gericht. RNAi kan invloed hebben op de kever morfologie, metamorfose, fysiologie en gedrag. Hoe vaak de aanwezigheid van fenotype wordt gecontroleerd en onder welke voorwaarden de kevers worden gefokt moeten worden toegesneden op de specifieke vragen die worden onderzocht door middel van RNAi.

Resultaten

Een van de belangrijkste stappen voor een succesvolle injectie moet een naald maken. Zoals beschreven in stap 6, de punt van de naald moet worden doorbroken vóór injecteren T. castaneum. Voorbeelden van goede en slechte naalden zijn weergegeven in Figuur 1. Een goede naald een scherpe en stijve punt, met een ongeveer 0,05 mm diameter opening (Figuur 1B).

Figuur 2 een succesvolle injectie (Figuren 2A en 2B) en verschillende gevallen van mislukte injecties (Figuren 2C-2F). Met een juiste grootte injectienaald, de naald penetreert de larvale cuticula met minimale weerstand (figuur 2A) en het dsRNA oplossing (groen) stroomt larven zonder lekken (Figuur 2B). Niet te injecteren, omdat het zal overlopen van de dsRNA oplossing leiden, zelfs met een goed formaat injectienaald (Figuur2C). Wanneer de punt van de naald te dun, de naald vaak niet de larvale cuticula en bochten dringen, waardoor de moeilijke injectie (figuur 2D). Als dit gebeurt, het bijknippen van de naald soms helpt. Grotere naalden zijn vaak nog bruikbaar, zij het ​​met enige moeite in het penetreren van de larvale cuticula (figuur 2E). Er is echter een grote hoeveelheid dsRNA snel tot geduwd uit de naald zelfs met lichte druk op de injectiespuit, vaak resulterend in een overloop van de dsRNA oplossing (figuur 2F).

Bij het uitvoeren van RNAi, is het belangrijk om een ​​positieve controle te beoordelen of RNAi goed werkt, en een negatieve controle om te controleren of het waargenomen effect niet een niet-specifiek effect van dsRNA of een gevolg van injectie procedures (zoals schade door injectie, of afwijking van verdoving). Injectie van dsRNA gericht EYFP kan alsgoede positieve controle bij het ​​gebruik van de pu-11 stam ^5,7. Wanneer EYFP dsRNA geïnjecteerd in de laatste larvale stadium, kan een aanzienlijke vermindering van EYFP signaal in de toekomst vleugel primordia al een dag na injectie (Figuur 3A) worden waargenomen. De knockdown van EYFP volledig twee dagen na injectie van de EYFP dsRNA (Figuur 3B) en dit knockdown blijft via popstadium (figuren 3C en 3D) en gedurende de levensduur van de kever als de dsRNA concentratie hoog genoeg (bijvoorbeeld 1 ug / ul) ^7. EYFP dsRNA kan worden gebruikt als negatieve controle omdat het een niet-endogene gensequentie en mag niet leiden tot morfologische en fysiologische verstoringen (figuren 3A-3D).

We voorzien beelden van larvale RNAi voor rudimentaire (vg), een kritische vleugel gen ^12, als een ander voorbeeld van hoe effectieve deze injectie op basis van RNAi techniek is in T. castaneum. Wanneer dsRNA voor vg wordt geïnjecteerd in voorlaatste etappe larven (een stadium vóór de laatste larvale stadium), kan een volledig verlies van de vleugel structuren worden waargenomen in het popstadium (figuren 3E en 3F). De resulterende volwassen ook volledig mist vleugel structuren (figuren 3G en 3H). Het RNAi resultaat voor vg illustreert zowel de robuustheid en het systematische karakter van RNAi in T. castaneum.

Figuur 1: (A) Voorbeelden van ongebroken, goede en slechte naalden (B) De tip van een goed gebroken good naald (C) het uiteinde van een gebroken naald die te groot en stomp (D) De tip... van een brak n naald die is te dun. Schaal bars (rood) zijn 0,05 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2:... (A) een juiste afmeting injectienaald ingebracht in de laatste instar larven (B) larve passende geïnjecteerd met de groene dsRNA oplossing (C) Overloop van het dsRNA oplossing bij het ​​injectiepunt veroorzaakt door over-injectie (D ) Een dunne naald niet de larvale cuticula doordringen. (E) Een grote injectienaald ingebracht in de laatste instar larven. (F) larve ingespoten met een grote naald, waardoor overloop en lekkage van de dsRNA oplossing. Pijlen geven de naalden.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Voorbeelden van succesvolle RNAi in T. castaneum. (AD) Laatste larvale injectie van de EYFP dsRNA leidt tot een vermindering van EYFP expressie. (A) Larven een dag na injectie. (B) Larven twee dagen na injectie. (C) Controle poppen. (D) Pupae gevolg van larvale EYFP dsRNA injectie. De negatieve controles buffer injectie (A, B) en DsRed dsRNA injectie (C, D). Pijlpunten en pijlen geven EYFP meningsuiting of het ontbreken daarvan in de vleugel primordia en ogen, respectievelijk. (EH) Penultieme larvale RNAi voor vg. (E) Wilde-achtige pop. (F) vg RNAi pop. Het ontbreken van een vleugel structuren is al zichtbaar aan het popstadium (pijl). G) Wildtype volwassene. (H) vg RNAi volwassene. Wing-gerelateerde structuren zijn volledig ontbreekt (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Er zijn enkele belangrijke problemen die moeten worden beschouwd voor het succes van RNAi garanderen, ook de lengte en concentratie van de dsRNA moleculen concurrentie tussen verschillende dsRNA moleculen (bij een poging meerdere neerslaan), en de mogelijkheid Off-Target Effects (OTE).

dsRNA Lengte

De lengte van dsRNA moleculen invloed op de efficiëntie van de systemische RNAi respons, met een langere dsRNA een efficiënter te activeren RNAi ^7,14,15 (hoewel langere grens van dsRNA is momenteel niet bekend). De dsRNA lengte moet langer dan 50 bp zijn effectieve RNAi induceren in T. castaneum ^7. dsRNA tussen 150 bp en 500 bp blijkt ideaal te zijn voor RNAi experimenten. Hoewel langere dsRNA moleculen kunnen ook worden gebruikt, zullen ze een verhoogde kans OTE en het gen klonen stap steeds moeilijker hebben.

dsRNA Concentratie

ve_content "> Verschillende niveaus van gen knockdown kan worden bereikt afhankelijk van de concentratie van dsRNA. 1 ug / ul lijkt een redelijke beginconcentratie, waar vaak een bijna nul fenotype (variabel van de gen (en) plaats ). RNAi kan met een hogere concentratie (bijvoorbeeld 7-8 ug / ul) worden uitgevoerd om een sterkere RNAi fenotype. RNAi met een seriële verdunning van dsRNA te vinden kan soms gunstig zijn om een reeks hypomorfe fenotypen (Aanvullende gegevens van Tomoyasu produceren et al. 2009 ⁸ en Borràs-Castells ongepubliceerde data).

RNAi Competition

Meerdere gen knockdown kan op T. castaneum door injectie verschillende dsRNA moleculen gelijktijdig. Het is echter ook bekend dat met verschillende dsRNA moleculen aanwezig in het organisme vaak resulterende concurrentie tussen de dsRNA's om toegang tot de componenten RNAi 7,14. Het is belangrijk om dezelfde lengte en dezelfde concentratie gebruikt voor dsRNA bij een poging meerdere genen knockdown vermijden een dsRNA, concurrerende-anderen (hoewel verdere aanpassingen van de lengte en concentratie dsRNA kan nodig zijn wanneer de expressieniveaus sterk verschillen naargelang de target genen). Wij en anderen hebben succes uitgevoerd dubbele en driedubbele knockdown (bijvoorbeeld Tomoyasu et al. 2005 ^16, Tomoyasu et al. 2009 ¹⁷ en Yang et al. 2009 ^18). Hoewel mogelijk, viervoudige RNAi (of meer) uitdagend kunnen zijn, als het waarschijnlijk zou leiden tot ernstige vermindering van RNAi doeltreffendheid van alle vier doelgenen.

Off-targeting

OTE is een inherente zorg voor RNAi-gebaseerde benaderingen. Een manier om OTE te minimaliseren is om de regio's in het doelwit-gen die vergelijkbaar sequenties met andere genen delen van deze regio's te identificeren en te voorkomen dat bij het ontwerpen van dsRNA. Een eenvoudige BLAST analyse tegen de T. castaneum voorspelde gen set kan een dergelijke regio's te identificeren. Verschillende online tools evaluatie van potentiële OTE (bijvoorbeeld E-RNAi ¹⁹⁾ ook mogelijk. Uitvoeren RNAi voor twee niet-overlappende gebieden van het doelgen een gemakkelijke en efficiënte manier om de mogelijkheid dat waargenomen fenotypes worden veroorzaakt door OTE elimineren. De mogelijkheid van OTE wordt geminimaliseerd als RNAi voor twee niet-overlappende gebieden tot dezelfde fenotypen (tenzij de twee niet overlappende gebieden hebben een vergelijkbare sequentie).

Evaluatie gen knockdown andere dan fenotypische analyses middel is vaak essentieel om effectief huidige RNAi-gerelateerde gegevens. Twee belangrijke manieren gen knockdown evalueren zijn qRT-PCR en Western blot analyse. qRT-PCR is een handige manier om het niveau van het doelwit mRNA te meten, en is gebruikt in vele RNAi-gerelateerde studies waaronder T. castaneum (zie Miller et al. 2012 ⁷ bijvoorbeeld). Howeveh, voorzichtigheid moeten worden genomen, zoals we onlangs hebben gezien een aantal gevallen waarin het doel-mRNA-niveau is up-gereguleerd door RNAi (hoewel het eiwit product is down-gereguleerd) (Borràs-Castells ongepubliceerde gegevens). Het is onbekend of deze RNAi geïnduceerd mRNA opregulatie uitbreidt of uniek aan bepaalde genen kan worden. Western blot-analyse is een andere manier om gen knockdown bevestigen. Deze methode is betrouwbaar als deze geeft de van het uiteindelijke eiwitproduct. De eis van een specifiek antilichaam tegen het eiwit product van het doelwit-gen is een nadeel aan deze benadering. Gebruik van meerdere onafhankelijke metingen naast fenotypische analyse het vertrouwen van de fenotypische gegevens verkregen door RNAi-analyse toenemen.

Sinds de oprichting in T. castaneum, RNAi is voornamelijk gebruikt om de functie van genen te bestuderen in ontwikkeling en patroonvorming. Deze T. castaneum ontwikkelingsstudies zijn zeer succesvol in karak geweestterizing evolutionair geconserveerd en uiteen functies van genen (beoordeeld in Denell 2008 ¹ en Klingler 2004 ^2). Echter, RNAi-gebaseerde studies in T. castaneum zijn niet beperkt tot de ontwikkelingsbiologie. Bijvoorbeeld, kan RNAi worden gebruikt om de functie van genen te bestuderen in een breed scala van fysiologische en gedragsmatige reacties, zoals stress tolerantie, predatie, agressie, partnerkeuze, activiteit patronen en afweermechanismen.

Een van de moeilijkheden van de toepassing van RNAi om deze contexten is de kans op pleiotrope effecten. Vaak zal genen van belang een verscheidenheid aan rollen in de hele T. hebben castaneum life cycle, waardoor het verwijderen van genen zonder onbedoelde fenotypische effecten moeilijk. Echter, de mogelijkheid om eenvoudig RNAi voeren op verschillende stadia dikwijls een doeltreffende strategie voor het vermijden van deze pleiotrope effecten. Bijvoorbeeld, het uitvoeren van RNAi bij volwassenen in plaats van larven of poppen misschien kunnen we omzeilen hand werkenneigde letaliteit veroorzaakt door gen knock-down tijdens de vroege ontwikkeling. De flexibiliteit van de RNAi respons in T. castaneum dus maakt dit model een aantrekkelijke keuze voor de aanpassing van RNAi om experimenten van gen-functie in fysiologische en gedragsmatige reacties.

De T. castaneum systeem is ook ideaal voor gebruik in een leer laboratorium. T. castaneum kan gemakkelijk gekweekt op meel / gist mengsel bij kamertemperatuur (25 ° C) zonder frequent subcultuur en RNAi technieken T. castaneum zijn eenvoudig genoeg om te worden aangepast om een laboratorium met jonge, leren wetenschappers. Zoals RNAi tot een essentiële techniek in verschillende biologisch gebied, is het cruciaal dat studenten worden blootgesteld aan deze techniek. De straight-forward aard van de larvale RNAi techniek in T. castaneum stimuleert ook meer studenten worden betrokken in het onderzoek, het maken van T. castaneum een uitstekende kandidaat voor een klaslokaal gericht genetisch systeem.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Organic whole wheat flour	Heartland Mill Inc. Kansas	G1
Brewer’s yeast	MP Biomedicals	2903312	Zijf de gist met #35 roestvrij staal zeef voor gebruik. Draag een beschermende masker en bedek de zeef met plasticfolie, omdat de gezeefde gist een fijn deeltje en ademhalingsgevaar is.
6 oz plastic Drosophila stock flessen	Fisher Scientific	11-888
Zeef	Fisher Scientific	04-881N	8 inch dia. x 2 inch D. Gebruik #25 (Nominale opening 710 µm) voor larven, poppen en volwassenen.
Zeef	Fisher Scientific	04 881 10P	8 inch diameter #35 (Nominale zeefopening: 600 µm)  Roestvrijstalen Zeefjes, 8 inch dia. x 2 inch D. Deze zeef is ideaal om klonten uit gistpoeder te verwijderen.
Zeef ontvanger	Fisher Scientific	04-866B	8 inch diameter
1.5 Quart uitloop monster pan	Seedburo Equipment Co.	Model 33	verzamelpan
Incubator	BioCold Environmental Inc	BC26-IN	Houd het op 30 °C met 70% luchtvochtigheid.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374500
NaH2PO4	Fisher Scientific	S397-500
KCl	Fisher Scientific	P217-500
Voedsel kleurstof	Kroger		groen, blauw of rood preferabel
Microscoop glas plaatje	Fisher Scientific	22-038-103
Tack-It Over&Over	Aleene's		Herpositioneerbare lijm voor plakkerige plaatjes. Dubbelzijdig plakband kan als alternatief worden gebruikt, echter, we vonden dat de hechting varieert.
Kunststof CD case	Amazon
Boroslilicaat glas capillair	Sutter Instrument	BF100-50-15	O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Zonder filament
Naaldtrekker	Sutter Instrument	P-87 of P-97
Verwijderbare montage putty	Loctite Fun-Tak
Gedrukte gas duster	OfficeMax	OM96091
Pincet	Fine Science Tool	11231-30	Dumoxel #3 (om kevers te manipuleren)
Pincet	Fine Science Tool	11252-20	INOX #5 (om naaldpitten te breken)
Ethyl ether, watervrij	Fisher Scientific	E138-500
Nylon gaas	Flystuff/Genessee Scientific	57-102	120 µm poriëngrootte/49% open gebied
Media fles, 100 ml	VWR	89000-926
Stereomicroscoop	Zeiss		SteREO Discovery V12. Injectie microscoop.
Stereomicroscoop	Fisher/Zeiss	12-070-513	Stemi2000. Gebruik om de naald te breken en larven op het plakkerige plaatje te plaatsen.
X-Y mechanische tafel	Zeiss	4354600000000000
X-Y mechanische tafel	Microscopenet.com	A512	Goedkope alternatief
Manipulator	Narishige	M-152
Magnetische standaard	Narishige	GJ-1
Glas capillair houder	Narishige	IM-H1
30 ml Wegwerp spuit	BD spuit	309650	BD Luer-Lok Tip
Vierweg stopkraan	Cole-Parmer Instrument Co.	EW-30600-03	Stopkranen met Luer aansluitingen; 4-weg; mannelijke slip
Kunst schilderspens	Amazon	Art Advantage Olie en Acryl Penselen Set, 24-delig	Elke algemene schilderspens zal werken.