Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantificering van Orofacial Phenotypes in Xenopus

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52062

⸱

6 november 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

In dit artikel

Samenvatting

Werkwijze voor het orofaciale grootte en vorm van Xenopus laevis embryo kwantificeren ontwikkeld. In dit protocol worden metingen traditionele formaat gecombineerd met geometrische morfometrie te zorgen voor meer geavanceerde analyses van orofaciale ontwikkeling en defecten.

Samenvatting

Xenopus is uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor het ontleden van de mechanismen die craniofaciale ontwikkeling en defecten. Een methode om orofacial ontwikkeling te kwantificeren zal zorgen voor meer grondige analyse van orofaciale fenotypes bij intrekking met stoffen die genetisch of moleculair kunnen manipuleren genexpressie of eiwit functie. Met tweedimensionale afbeeldingen van de embryonale koppen worden traditionele size-afmetingen zoals orofaciale breedte, hoogte en gebied- gemeten. Daarnaast wordt een ronding maat voor de embryonale mondopening gebruikt om de vorm van de mond beschreven. Geometrische morfometrie van deze tweedimensionale beelden wordt ook uitgevoerd om een ​​meer verfijnde weergave van veranderingen in de vorm van de orofaciale regio. Plaatsen zijn toegewezen aan specifieke punten in het orofaciale gebied en coördinaten worden gecreëerd. Een principle component analyse wordt gebruikt om de mijlpaal coördinaten principe componenten die vervolgens discrimineren de behandeling te verminderengroepen. Deze resultaten worden weergegeven als een scatterplot waarin individuen met gelijkaardige orofacial vormen samen te clusteren. Het is ook nuttig om een ​​discriminantfunctieanalyse die statistisch vergelijkt de posities van de herkenningspunten tussen twee behandelingsgroepen voeren. Deze analyse wordt op een transformatie rooster waar positieveranderingen landmark worden beschouwd als vectoren. Een raster wordt over deze vectoren zodat een kromtrekken patroon wordt weergegeven om aan te geven waar de belangrijke posities mijlpaal zijn veranderd. Vormveranderingen in de discriminantfunctieanalyse zijn gebaseerd op een statistische maat, en derhalve kan worden geëvalueerd door een p-waarde. Deze analyse is eenvoudig en toegankelijk is, is er slechts een stereoscoop en freeware software, en zal dus een waardevol onderzoek en onderwijs resource zijn.

Inleiding

Een van de meest voorkomende en verwoestende types van menselijke aangeboren afwijkingen zijn degenen die de mond en het gezicht, zoals orofaciale schisis 1. Kinderen met misvormde orofaciale structuren ondergaan meerdere operaties gedurende hun leven en worstelen met het gezicht misvormingen, spraak, gehoor en eetproblemen. Daarom is het faciliteren van nieuw onderzoek in cranio- en orofaciale ontwikkeling is van cruciaal belang voor de preventie en behandeling van deze vormen van aangeboren afwijkingen bij de mens. Xenopus laevis heeft ontpopt als een nieuw instrument voor het ontleden van de mechanismen die craniofaciale ontwikkeling (enkele voorbeelden zijn 2,3,4 -11). Daarom kan een kwantitatieve methode om de grootte en vorm verandert analyseren tijdens de ontwikkeling van het hoofd en gezicht van deze soort zeer krachtig 3.

Hier presenteren we een dergelijke werkwijze; een combinatie van traditionele grootte metingen met geometrische morfometrie aangepast van een Xenopus studie 12 en een schat aan studies analyseren van menselijk gezicht vorm 13-15. Het doel van dit protocol is om onderzoekers aan het gezicht grootte en vormen te kwantificeren om onderscheid te maken tussen verschillende orofacial fenotypes tijdens normale en abnormale ontwikkeling. Deze analyse maakt het mogelijk voor een betere differentiatie tussen subtiele craniofaciale defecten, zoals die welke voortvloeien uit synergetische effecten van genen en / of omgevingsfactoren. Daarnaast kan dit kwantificeringsmethode ook zelfs lichte verbetering of redden van een orofacial defect onthullen. Dit maakt het een handige gids bij het analyseren van potentiële therapieën dan ook.

De combinatie gezichts metingen en geometrische morfometrie dat wij hier presenteren maakt een bredere statistische analyse van zowel de grootte en vorm van het orofaciale gebied dan de huidige protocollen die grotendeels gebruik slechts één of de ander 15-18. Verder presenteren we een eenvoudige manier om zowel de mediale en laterale gebieden van beoordelenhet gezicht zonder dat geavanceerde driedimensionale beeldvormende apparatuur die wordt gebruikt in de huidige studies 13,19.

We tonen dit protocol op Xenopus laevis embryo's die behandeld worden met een retinolzuurreceptor remmer dat abnormale orofacial ontwikkeling en een mediaan gespleten gehemelte 2,3 induceert. Kwantificering van de afmetingen en vorm van het orofaciale gebied in deze embryo heeft wijzigingen in de midface die analoog aan mensen met gelijke palatinale kloven en muismodellen 20,21 geopenbaard. Echter, dit protocol worden gebruikt om de effecten van andere verbindingen op orofaciale ontwikkeling zoals natuurlijke stoffen, herbiciden of eiwitten zoals groeifactoren beoordelen. Verder, orofaciale grootte en vorm verandert als gevolg van verstoring van de genexpressie via verlies of overexpressie-experimenten (met behulp van antisense morpholinos of Crispers / Talens) kan ook worden gekwantificeerd met behulp van dit protocol. Tenslotte, deze methode specificatie ontwikkelden welly om Xenopus morfologie beoordelen; echter gemakkelijk aangepast voor analyse van alle gewervelde. Andere toepassingen kunnen ook met behulp van dit protocol voor het vergelijken van nauw verwante soorten voor evolutionaire of ecologische studies. Terwijl het voorbeeld dat we hier bieden maakt gebruik van dit protocol om de analyse van het orofaciale gebied te beschrijven, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de analyse van andere regio's, organen, of structuren.

Dit orofaciale kwantificering protocol zal een waardevolle bron voor de onderzoeksgemeenschap, evenals een uitstekend leermiddel voor studenten als een video-demonstratie geworden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten uitgevoerd met behulp van Xenopus laevis werden goedgekeurd door IACUC (protocol # AD20261).

1. Voorbereiding Reagentia en benodigde materialen

  1. Reagentia:
    1. Maak 1 L van 10x MBS (Gewijzigd Barth's Saline) oplossing 22. Voeg NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO 4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7.8) en NaHCO3 (25 mM) tot 1 liter gedestilleerd water. Stel de pH tot 7,8 met NaOH.
    2. Voeg 1 l 1x MBS door verdunning 100 ml 10x MBS-oplossing in 900 ml gedestilleerd water. Voeg 0,7 ml van 1 M CaCl2-oplossing.
    3. Maak 1 L van 0,1 x MBS door verdunning van 100 ml 1 x MBS-oplossing in 900 ml gedestilleerd water. Tot 1 L van 0,1x MBS oplossing, voeg 1 ml van 10 mg / ml gentamicine oplossing voor gebruik in embryo cultuur.
    4. Voeg hoog zoutgehalte MBS door oplossen 4 ml van 5 M NaCl in 100 ml van 10x MBS. Voeg vervolgens gedestilleerd water totdat het totale volume is 1 L.
    5. Voeg 70% ethanol door verdunning 100% ethanol tot 70% ethanol met gedistilleerd water.
    6. Maak BMS-543 door het opstellen van een 10 mM voorraad oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO).
    7. Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) door toevoeging van 4 g paraformaldehyde poeder aan 50 ml gedestilleerd water. Verwarm op een hete plaat bij ongeveer 65 ° C, waarna voeg 5 M NaOH druppelsgewijs tot oplossing verdwijnt.
      1. Zodra de oplossing wist, haal van het vuur en voeg 50 ml 2x PBS en 100 ul Tween-20. Laat afkoelen tot kamertemperatuur op ijs. Stel de pH tussen 7,2 en 7,5 met behulp van HCl.
    8. Voeg een fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween (PBT) door het oplossen van 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4 in 800 ml gedestilleerd water. Met behulp van HCl, breng de pH op 7,4. Voeg 2 ml Tween-20. Pas uiteindelijke volume met gedestilleerd water op gelijke 1 L.
    9. Maak een cysteïne-oplossing door het oplossen van 1 g van cysteïne in 50 ml gedestilleerd water of 0.1x MBS. Voeg 1,5 ml van 5 M NaOH eennd breng de pH op 7,8.
    10. Maak een 10% benzocaïne voorraad oplossing door het toevoegen van 10 g Benzocaine poeder tot 100 ml 100% EtOH. Voor euthanasie van de volwassen mannen en embryo's klaar voor fixatie, te verdunnen tot een 0,05% oplossing.
    11. Wordt testes opslagoplossing door toevoeging van 1 ml kalfsserum 9 ml buffer L15.
  2. Juiste gereedschappen en apparatuur:
    1. Het verkrijgen van de in de tabel van materialen en apparatuur vermeld apparatuur, weergegeven in figuur 1.
    2. Wijzigen van een pipet tool. Plaats de punt van een glazen Pasteur pipet in een vlam van een Bunsen brander. Draai de pipet tip tot het smelt en vormt een afgerond verzegelde einde.
    3. Plat boetseerklei in de bodem van een plastic petrischaal, gladstrijken van de gehele plaat bestrijken (elke grootte kan worden gebruikt) (Figuur 1Aiv).
      1. Druk lichtjes op een straight teasing naald in de klei beklede schaal op een hoek van 45 °. Houd de naald daar, en langzaam de Petrischotel horizontaal naar een depressieve lijn (figuur 1Bi) te creëren. Herhaal dit voor het gewenste aantal rijen.
      2. Gebruik een glazen pipet tool ondiepe, cirkelvormige indrukkingen maken in elke rij van de klei beklede gerecht embryo koppen (figuur 1Bii) en steun plaatst de organisatie van de embryo tijdens het fotograferen.
      3. Voor fotografie, vul schotel met PBT (Figuur 1Biii). Tussen toepassingen, grondig de schotel en klei oppervlak met steriel water, gevolgd door 70% ethanol.

2. Xenopus laevis Embryo Cultuur en Inhibitor Behandelingen

  1. In vitro fertilisatie en de cultuur van Xenopus eieren:
    1. Verkrijgen en cultuur Xenopus laevis embryo's met behulp van standaard gepubliceerde methoden 22,23.
    2. Kortom, euthanaseren een volwassen mannetje door onderdompeling in een 0,05% benzocaïne oplossing. Ontleden testes en winkel in testes opslag buffer. Injecterenvolwassen vrouwtjes met humaan choriongonadotrofine (HCG), het verzamelen van eieren in een hoge zout MBS, en bemesten in vitro met ontleed testes (Figuur 2A, B).
    3. Cultuur embryo in 0,1x MBS bij 15 ° C totdat de gewenste graad is bereikt (embryo's volgens de normale tabel van Xenopus laevis bij Nieuwkoop en Faber 24,25).
      1. Hier, cultuur embryo tot stadium 22 (24 uur na de bevruchting (HPF)), en verwijder de vitellinemembraan onder een stereomicroscoop gebruik van twee paar geslepen pincet. Transfer embryo met een standaard, wegwerp pipet een schone petrischaal (100 mm in diameter) met 30-40 ml 0,1x MBS.
  2. Remmer behandeling van Xenopus embryo's (in figuur 2):
    1. Vul de nodige putjes van een 24-well kweekplaat met 1 ml 0,1 x MBS met behulp van een gekalibreerde pipet-man. Bakenen de buitenkant van de put met een fijne punt te markerenER (figuur 2D, inzet). Gebruik de marker ook label de inhoud aan elk putje toegevoegd worden de 24-well kweekplaat deksel. Kopieer deze informatie op een 24-goed set-up pagina in het labjournaal.
    2. Transfer 5-10 embryo's in elk putje met een standaard, wegwerp transferpipet (figuur 2C). Plaats hetzelfde aantal embryo in elk putje.
    3. Bijvullen of verwijderen van de 0.1x MBS, zodat het niveau met de 1 ml gemarkeerde lijn (figuur 2D). Voeg de juiste hoeveelheid DMSO (zodat het uiteindelijke volume van DMSO is 1%) en voorzichtig zwenken. Wees voorzichtig niet te DMSO te dicht bij de embryo's toe te voegen, en de contactgegevens van de embryo's met het oppervlak van de buffer te voorkomen.
    4. Voeg de juiste hoeveelheid van de chemische stof aan de aangegeven putjes en voorzichtig weer te wervelen. Hier, voeg 1 ui 10 mM BMS-453 (een retinoïnezuur receptor antagonist) en 9 pl DMSO tot 1 ml 0,1x MBS.
    5. Als de chemische is lichtgevoelig, losjes wikkel de cultuur gerecht in aluminiumfolie. Cultuur embryo in een 15 ° C incubator tot het gewenste stadium. In dit voorbeeld behandelen embryo gedurende 16-18 uur.
  3. Het wassen van embryo's uit de behandeling en het opfokken tot kikkervisje fasen:
    1. Verwijder de helft tot driekwart van de oplossing met een disposable pipet overdracht. Wees voorzichtig dat u de embryo verstoren. Met behulp van een nieuwe transfer pipet, vul het goed met 0.1x MBS. Herhaal dit 3-6 keer.
    2. Transfer embryo een grote petrischaal (diameter van 150 mm) die 100 ml 0,1 x MBS met gentamicine (1 ml / l). Incubeer de embryo's bij 15 ° C totdat ze fase te bereiken 42-45 (82-100 HPF).
    3. Wijzig de 0.1x MBS oplossing met gentamicine dagelijks, en het verwijderen van dode embryo's onmiddellijk om verontreiniging of de dood van andere embryo's te voorkomen. Noteer het aantal dode embryo's in het laboratorium notebook.
  4. Vaststelling van embryo's in paraformaldehyde (PFA):
    1. Fix embryo's tussen fasen 42 en 45 (82 en 100HPF, respectievelijk) door ze in een nieuwe 24-well cultuur schotel met 1-2 ml van 0,1x MBS. Label de deksel met dezelfde informatie als de behandeling set-up zoals hierboven beschreven (paragraaf 2.2.1).
    2. Verwijder zoveel 0.1x MBS uit elk goed mogelijk, maar tegelijk het embryo gedekt en het waarborgen van minimaal contact om letsel te voorkomen. Voeg 1-2 ml van 0,05% benzocaïne oplossing in 0,1 x MBS en incubeer tot embryo's niet meer reageren op stimuli.
    3. Voeg 1-2 ml van 4% PFA. Als alternatief plaatst embryo in geëtiketteerde microcentrifugebuisjes voor fixatie, indien gewenst.
    4. Incubeer embryo in PFA gedurende 24 uur bij 4 ° C op een roterende shaker. Verwijder PFA door het uitvoeren van 3-4 wasbeurten met PBT dan een 3-5 hr periode.

3. Het fotograferen van het orofaciale gebied van Xenopus Kikkervisjes

  1. Pre-fotografie preparaat (dit is geïllustreerd in figuur 3):
    1. Vastgezet embryo in een grote petrischaal (150mm in diameter) met ongeveer 100 ml van PBT.
    2. Maak twee insnijdingen aan de kop te scheiden van het lichaam (Figuur 3A, vaste zwarte lijnen). Houd eerst de embryo met een pincet en een insnijding aan de achterste zijde van de darm met een steriele scalpel (Figuur 3B). Maak een tweede incisie aan de anterieure zijde van de darm, in de buurt van het hart, om volledig te verwijderen van het hoofd (Figuur 3C).
    3. Pipette afgehakte hoofden embryo in een met klei beklede schaal (deel 1.2.2) met behulp van een standaard, wegwerp transferpipet.
      1. Voor frontale weergaven, gebruiken twee paar tang om embryo hoofden posterior zijde omlaag te positioneren binnen de cirkelvormige depressies. Met behulp van de tang om zowel het embryo hoofd en de omringende klei, positie embryo's zodanig dat ze worden geconfronteerd met de camera en zijn niet achterlijk of aan beide zijden (Figuur 3D) gekanteld manipuleren. Duw de omringende klei rond het hoofd met behulp van een tang en / of het glaspipet tool om het hoofd vast te zetten.
      2. Voor zijdelings uitzicht, een tang om embryo hoofden te positioneren binnen het cirkelvormige depressies zodanig dat zij aan hun kant, in dezelfde richting, en zijn plat tegen de klei. Manipuleren van de embryo kop en de omringende klei zodat het cement klieren van het embryo naar beneden staan ​​onder dezelfde hoek (figuur 3E). Gebruik het getekend met de plagen naald als een gids om nauwkeurigheid te verzekeren bij het nemen van laterale metingen rijen.
  2. Het vastleggen van beelden van het kikkervisje hoofd:
    1. Fotografeer het hoofd van het kikkervisje met behulp van een dissectie microscoop met een aangesloten digitale camera en de bijbehorende camera software. Gebruik de maximale vergroting die voor alle embryo constant kan worden gehouden.
    2. Centreren embryo en gezicht ze allemaal in dezelfde richting. Maak foto's met behulp van de beste lichtomstandigheden die het mogelijk maken voor de meest nauwkeurige beeld van het orofaciale gebied. Positielichten aan overmatige schaduwen te voorkomen. Beelden opslaan als .tiff-bestanden met de hoogst mogelijke resolutie.

4. Het meten en analyseren van Facial Grootte Afmetingen in Xenopus Kikkervisjes

  1. Meet orofaciale afmetingen (samengevat in figuur 4):
    1. Bepaal het gezicht breedte. De punten worden aangeduid waar de ventrale deel van elk oog voldoet aan de periferie van het gezicht (figuur 4A, pijlen), en meet de afstand tussen deze punten (figuur 4A, rode lijn).
    2. Bepaal het gezicht hoogte. Bepaal eerst de middellijn door de afstand tussen elk oog en de berekening halverwege. Vervolgens trekken horizontale lijnen die de dorsale meeste randen van de ogen en de dorsale punt van het cement klier (figuur 4B, witte lijnen) te markeren. Op de middellijn, de afstand tussen de horizontale lijnen (figuur 4B, rode lijn).
    3. Bepaal thij orofaciale gebied. Gebruik dezelfde horizontale belijning dorsale randen van de ogen en cement klier tot gebied meetgids (Figuur 4C, witte lijnen). Hervat op het punt waar de horizontale lijnmarkering bovenkant cement klier aan de omtrek van de linkerzijde van het vlak (figuur 4Ca).
      1. Trace langs de rand van het gezicht omvat het oog tot het punt waar de horizontale lijnmarkering de top van de ogen aan de omtrek van het vlak (figuur 4CB). Blijf sporen op deze dorsale meest horizontale lijn tot het punt waar het de omtrek van de rechterkant van het vlak (figuur 4 cc).
      2. Trace omlaag langs de rand van het gezicht omvat het oog tot het punt waar de ventrale meest horizontale lijnmarkering bovenkant cement klier aan de omtrek van de rechterzijde van het vlak (figuur 4CD). Blijven traceren langs deze onderste horizontale lijn until het aan het punt waar tracing begonnen. Gebruik foto-editing software om het gebied binnen de opsporing te berekenen.
    4. Bepaal de snuit lengte. Op laterale beelden, maak een verticale lijn die de voorste van het oog markeert. Vervolgens meet de horizontale afstand tussen het voorste punt waar de grootste zijde aan dorsale rand van het cement klier de verticale lijnmarkering het voorste van het oog (figuur 4D).
    5. Bepaal de mond breedte. Meet de horizontale afstand tussen de linker en rechter punt waar de bovenste en onderste "mond" van de opening mond meet (Figuur 4E). Deze kunnen worden beschouwd als de kikker equivalent van de labiale commissuren.
    6. Bepaal de mond rondheid. Bereken mond rondheid als een inverse beeldverhouding waar (4   ×   [Area]) / (π   ×   [Hoofdas] 2 >).
      1. Gebruik de lasso in een foto-editor om de randen van de mondopening te traceren, zoals weergegeven in figuur 4F. Selecteer Analyseren op de werkbalk en kies Meet. Alternatief berekenen rondheid van de meting van de stippellijn diameter van de mondopening.
  2. Data-analyse van gezichtsuitdrukkingen afmetingen:
    1. Voer de metingen gezichts dimensies in een data analyseprogramma de behandelingsgroep vergeleken met de controle. Bepaal het gemiddelde van elke meting voor zowel de experimentele en controlegroepen om staafdiagrammen creëren. Bepaal standaarddeviatie om foutbalken maken. Voer t-test van Student statistisch vergelijken groepen.
      Opmerking: Deze gegevens kunnen zeer variabel vanwege de enigszins verschillende tarieven ontwikkelingsniveau tussen embryo.

5. Kwantitatieve Analyse van Orofacial Shape en Morfometrie

  1. Plaats bezienswaardigheden en crealandmark te coördineren bestand (getoond in figuur 5A).
    1. Kies Landmarks zodat vangen zij de vorm van de doelafbeelding en herhaaldelijk in dezelfde relatieve locatie worden geplaatst in alle monsters geanalyseerd. Als een structuur niet bestaat in alle monsters, mag u een mijlpaal op deze structuur.
      1. Hier plaatst 24 monumenten aan de midface met onderscheidende kenmerken, zoals de ogen, neusgaten en mond te vertegenwoordigen. Voor de consistentie, plaats oriëntatiepunten halverwege eerder geplaatste monumenten (bijvoorbeeld mond oriëntatiepunten, figuur 5Ai).
    2. Leg mijlpaal coördinaten en creëren "mijlpaal coördineren bestand". Open het eerste beeld van een kikkervisje vlak (bijvoorbeeld de eerste controle embryo).
      1. Selecteer het tabblad Plug-ins op de werkbalk en kies Pointpicker uit het dropdown menu. Selecteer de punten toe te voegen tabblad en plaats oriëntatiepunten in gewenste locaties als plaatsen zal verschijnen als veelkleurige kruisen ( Figuur 5Ai).
      2. Verplaats mijlpaal locaties na plaatsing door het selecteren van de Move kruisen tool. Wanneer alle bezienswaardigheden zijn op het beeld zijn geplaatst, selecteert u de weergave Resultaten Tab op de werkbalk en kies Show (Figuur 5Aii) naar mijlpaal coördinaten weer te geven en te kopiëren naar een spreadsheet programma (figuur 5Aiii).
      3. Bij het plakken van deze coördinaten van deze eerste embryo in een spreadsheet programma, laat een lege rij boven de gegevens. In kolom B van deze lege rij (rij 1), typ "LM =" met het aantal monumenten in de steekproef. Hier voert u "LM = 24" sinds 24 monumenten zijn gemaakt (Figuur 5Aiii, rode doos).
      4. In de rij onder de datapunten, typ "ID =" met een naam identificatie van het monster. Hier in figuur 5Aiii, voer "ID = CON1" want dit is de mijlpaal data van de eerste controle embryo (figuur 5Aiii, rode pijl) te coördineren.
      5. Herhaal dit proces met de gezichten van elk embryo in het experiment (experimenteel en controles) totdat alle mijlpaal coördinaten zijn in de spreadsheet ingevoerd.
        LET OP: Het is belangrijk dat elk embryo krijgt een unieke naam in de "ID =" rij. Hier bijvoorbeeld de volgende reeks landmark coördinaten wordt de ID van "CON2" omdat het de tweede embryo in de controlegroep.
      6. Kopieer de gehele tweede en derde kolom in een tekstdocument en opslaan als een .txt bestand.
  2. Stel de morfometrische software voor gegevensanalyse (in figuur 5B).
    1. Hier selecteert u Create New Data Set in het hoofdmenu in de morfometrische softwareprogramma. Noem het bestand en van de bij de desbetreffende vakken data (bijvoorbeeld "retinoïnezuur Remming" en "Facial monumenten", respectievelijk) in het pop-up scherm (Figuur 5BI). Importeer het bestand als een TPS, en select het tekstbestand van coördinaten aan de dataset (Figuur 5BI, rode pijl) te creëren.
    2. Data alignment en Procrustes passen:
      1. Voer een Procrustes pasvorm en uitlijning. Markeer de in het tabblad Project Tree gegevens, kiest Inleidingen op de hoofdwerkbalk, en New Procrustes Fit in het dropdown menu.
      2. Kies Align door Principal Axis en selecteer Uitvoeren Procrustes Fit op de bodem van de doos (Figuur 5Bii, rode pijl). Keer terug naar de voorrondes drop-down menu, selecteer Generate covariantiematrix (figuur 5Biii), en selecteer Uitvoeren.
      3. Bekijk de correlaties van de covariantiematrix in het tabblad Resultaten.
    3. Een "classifier bestand" door aan elk monster in de op de juiste classifier variabele gegevens te onderscheiden of het behoort in de experimentele groep en de controlegroep.
      1. Label twee kolommen in een spreadsheet. Label de header van de eerste kolomn met "ID" en voer dezelfde ID's gegeven voor elk monster (bijvoorbeeld CON1, RARINHIB1, enzovoort; Figuur 5Biv). Label de kop van de tweede kolom met "behandeling" en inbreng in elke cel de behandelingsgroep die overeenkomt met de in de aangrenzende cel ID vermelde sample.
      2. Hier gebruiken "CONTROL en RAR INHIBITOR" labels als classifiers (Figuur 5Biv). Kopiëren naar een tekstbestand en sla op als een .txt bestand. Import Classifier Variabelen in de morfometrische softwareprogramma. Kies Match door Identifier, en opent u het tekstbestand (Figuur 5Bv).
  3. Maak een principale componenten analyse (PCA) scatterplot door de Variatie dropdown menu te selecteren en te kiezen Principal Component Analysis (Figuur 6AI). Selecteer vervolgens het tabblad Grafisch om drie extra tabbladen te zien: PC vorm verandert, eigenwaarden, en pc-scores (figuur 6Aii). Het tabblad PC scores geeft de bivariate belangrijkste component scatterplot van de Procrustes fit mijlpaal data (Figuur 6Aii).
    1. Wijzigen welke hoofdbestanddelen zijn uitgezet, brengen de pop-up menu in het perceel ruimte en selecteer de gewenste as om (figuur 6Aiii, rode pijl) te wijzigen.
    2. Selecteer de kleurgegevens Points gereedschap (Figuur 6Aiii). Selecteer classificatoren eerder geïmporteerd (Sectie 5.2.2) in het tweede pop-up menu dat verschijnt om de kleur van elke categorie (figuur 6Aiv) te bepalen.
    3. Bekijk de hoeveelheid variantie gevangen genomen door elk van de belangrijkste component in het tabblad Resultaten (Figuur 6AV). Export grafiek als een .bmp bestand.
  4. Maak een discriminant functie analyse (DFA) transformatie rooster in de morphometric software programma door te kiezen discriminantfunctieanalyse onder het tabblad Vergelijking (Figuur 6BI). In het pop-up menu, ervoor zorgen dat de juiste dataset is selecteerd en het soort gegevens de Procrustes-fit coördinaten.
    1. Markeer de paren te vergelijken groepen, en 1.000 permutatietests (Figuur 6Bii) draaien.
    2. Onder Graphics, bekijk de vector kaart van de coördinaten in het tabblad Vorm Difference (Figuur 6Biii). Als het beeld is omgekeerd, brengen de pop-up menu in het perceel ruimte om het schema te draaien in de juiste richting (Figuur 6Biii).
    3. De richting van vectoren weerspiegelt de vorm verschil met de eerste groep ten opzichte van de tweede, die wordt weergegeven in de discriminantfunctie menu voor het uitvoeren van de analyse (figuur 6Bii). Om de richting van de vectoren te keren, brengen de pop-up menu in het perceel ruimte en verandert het teken van de schaal factor zodat het negatief is (Figuur 6Biii, iv). De waarde van de schaal is ingesteld op een factor tien dat het beste het statistische verschillen in mijlpaal positie between de twee groepen zonder vervorming, en wordt meestal overgelaten aan de standaard (Figuur 6Biv).
    4. Ook in het pop-up menu, verandert de grafiek om een transformatie raster om de vectoren superponeren op een rooster (Figuur 6Biii, v).
    5. Geef het aantal horizontale en verticale lijnen van het raster in het pop-up menu (Figuur 6Biii, v).
    6. De grafiek te exporteren als een .bmp bestand.
    7. Bekijk de Procrustes en Mahalinobis afstanden en p-waarden onder de tab Resultaten (Figuur 6Bvi).
  5. Aanvullende morfometrische analyses die nuttig zijn voor de beoordeling van meer dan één behandelingsgroep
    1. Maak een principal component analyse transformatie net. De PC Shape Verandert tabblad toont de vector kaart van vorm verandert goed voor variantie in elk monster groep. Gebruik het pop-up menu in het tekengebied om het beeld goed te oriënteren en superponeren vectoren op een transformatie raster. Zet de schaal factorde waarde op de X-as van de PC scores grafiek die overeenkomt met de geschatte middelpunt van de controlegroep. Exporteer het beeld als een .bmp bestand.
    2. Maak een CVA scatterplot. Selecteer op het tabblad Vergelijking op de hoofdwerkbalk Canonical Variate Analyse, en markeer de classifier variabele set die eerder werd geïmporteerd (zie paragraaf 5.2.3). Selecteer 1000 iteraties voor permutatietests en selecteer Uitvoeren. Selecteer het tabblad CV scores aan de bivariate CVA scatterplot te bekijken. Dit is een kleurcode op basis van de geüploade classifiers. Verander het kleurenschema door de opvoeding van het pop-up menu in het perceel ruimte (zie paragraaf 5.3.3). Exporteren als een .bmp bestand.
    3. Maak een CVA transformatie raster. Een transformatie raster van het CVA resultaten kunnen in de vergelijking meer dan twee groepen. Onder het tabblad Graphics, kiest CV Shape Wijzigingen aan de transformatie rooster van de mijlpaal coördinaten visualiseren. Open het pop-up menu in het perceel ruimte om te veranderende richting van de vector, resultaten superponeren op een transformatie raster, en geeft u het aantal rasterlijnen. De grafiek te exporteren als een .bmp bestand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier wordt een kwantitatieve analyse van orofaciale grootte en vorm werd aangetoond vergelijken embryo's behandeld met een retinoïnezuur receptor inhibitor (RAR remmer) onbehandelde controles. Embryo's werden behandeld met een 1 uM concentratie van deze chemische remmer uit fase 24 tot 30 (26-35 HPF), uitgewassen en in stadium 42 (82 HPF) vast. Zij werden vervolgens verwerkt en geanalyseerd zoals beschreven in het protocol. De resultaten zijn oorspronkelijke gegevens, maar in overeenstemming met waarnemingen in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Xenopus laevis is uitgegroeid tot een nuttig instrument voor het ontleden van de ontwikkelingsbiologie mechanismen onderliggend orofaciale ontwikkeling; Er zijn nog geen protocollen beschrijven grootte en vorm veranderingen van deze regio bij kikkers. De hier beschreven methode zal een belangrijke bijdrage leveren op het gebied van orofaciale ontwikkeling te creëren door meer rigoureuze kwantificering van orofaciale fenotypes in Xenopus en andere gewervelde dieren.

De eerst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Start-up gelden aan A. Dickinson uit VCU dit werk ondersteund.

De auteurs willen Dan Nacu erkennen voor zijn artistieke talent in het maken van de schematische weergave.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dissecting microscopeZeissuitgerust met AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forcepsFine Science Tools11251-10
Steriele, wegwerp scalpelSklar06-2015
24-well plateFisher Scientific087721
Standaard wegwerp overdracht pipettenFisher Scientific13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri schotelsFalcon351058
IncubatorsEctotherm ingesteld op 15 °C of 20 °C
ModelleringskleiPremo, of andere niet-giftige modelkleiin zwart of wit
Rechte priknaaldThermo Scientific19010
Capillaire buis (voor naalden)FHC30-30-1Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fiber, 100 mm elk
Naaldtrekker, Model P-97Sutter Instrument Co.Naaldtrekker: P-97 Flaming/Bown micropipettrekker Filament: FB300BVoor filamenten, gebruik Sutter 3,00 mm vierkante doosfilamenten, 3,0 mm breed.
PipettemenGilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
CysteïneSigma-Aldrich52-90-4
Paraformaldehyde poederSigma-Aldrich158127
Petri schotelsFalcom353003, 351058100 mm diameter en 150 mm in diameter
100% EthanolVWR89125-170

Referenties

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Xenopus embryo sgeometrische morfometrieanalyse van gelaatsdimensieslandmark mappingprincipale componentenanalysediscriminante functieanalysetransformatieroosterstereoscoopbeeldvormingfreeware software
Kwantificering van Orofacial Phenotypes in Xenopus
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.