Methodenartikel

Fysiologische Recordings en RNA Sequencing van de Smaak Appendages van de Gele-koorts Mosquito Aedes aegypti

7.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52088

⸱

30 december 2014

 , 
1Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Plant Sciences Institute, Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, United States Department of Agriculture

In dit artikel

Samenvatting

Met twee methodologie om genexpressie in grote smaak aanhangsels van Aedes aegypti, hebben we de set genen vermoedelijk onderliggende neuronale reacties op bitter en afstotende verbindingen geïdentificeerd, zoals bepaald door elektrofysiologische onderzoeken.

Samenvatting

Elektrofysiologisch opnemen van actiepotentialen van sensorische neuronen van muggen geeft onderzoekers een kijkje in de chemische waarneming van deze ziekteverspreiders. We hebben recent een bitterzintuiglijk neuron in het labelum van vrouwelijke Aedes aegypti geïdentificeerd dat reageert op DEET en andere afweermiddelen, evenals bittere kinine, door middel van directe elektrofysiologisch onderzoek. Deze smaakreceptorneuronreacties leidden tot onze sequentiebepaling van totaal mRNA uit zowel mannelijke als vrouwelijke labella en tarsus monsters om de veronderstelde chemoreceptiegenen die in deze contact chemoreceptieweefsels tot expressie worden gebracht, te verduidelijken. De monsters van tarsus werden voor beide geslachten verdeeld in pro-, meso- en metathoracische subtypen. We valideerden vervolgens onze dataset door qRT-PCR uit te voeren op dezelfde weefselmonsters en gebruikten statistische methoden om de resultaten tussen de twee methoden te vergelijken. Studies die zich richten op moleculaire functie kunnen nu specifieke genen targeten om diegene te bepalen die betrokken zijn bij de waarneming van afweermiddelen door muggen. Deze receptorpaden kunnen worden gebruikt om nieuwe afweermiddelen te screenen voor het verstoren van het gedrag van gastheronger zoeken om de verspreiding van schadelijke virussen te beteugelen.

Inleiding

Verbindingen zoals DEET, picaridin, Citronellal en IR3535 is aangetoond effectief af te weren muggen, waaronder de belangrijke ziekte vector Aedes aegypti 1,2. We nemen actiepotentialen van sensorische neuronen geassocieerd met specifieke smaak sensilla aan de betrokken met mug afstotende cellen te bepalen. Gekoppeld aan sequentie stroomafwaarts van uitgedrukte genen in deze weefsels kunnen we de genen waarschijnlijk medieert de respons van deze cellen om nieuwe verbindingen op verbeterde waterafstotendheid mogelijkheden screenen identificeren.

RNA-seq is een krachtig hulpmiddel, in snel tempo standaard voor het bijhouden van ruimtelijke en temporele veranderingen in genexpressie. RNA-seq analyses van insecten chemosensory appendages en organen zijn gebruikt om moleculaire receptoren ontdekken in verschillende insectensoorten 3-5, sterk verbeteren van conventionele PCR zoekopdrachten gen door gen 6. Insecten vormen de meest diverse dier klasse, prewoordigd veel mogelijkheden om de verbinding tussen genen en unieke fenotypes bestuderen. RNA-seq technologie kan worden ingezet op een levend insect weefsel. Evenzo kan elektrofysiologische opname van zintuigcellen binnen uniporous gustatory sensilla worden bereikt in veel verschillende insectensoorten. De koppeling van deze twee technieken stelt onderzoekers in staat om de set genen die betrokken zijn in een waargenomen chemosensory fenotype versmallen. Verschillende soorten zullen een bijzondere uitdaging vormen, maar kan de verbinding tussen chemosensory receptor genen en een chemosensory aanpassing op de hoogte. De grootte en morfologie van chemosensory sensilla is variabel en kunnen uitgebreide probleemoplossing vereisen bij het opnemen van actiepotentialen om ruis te verminderen en te identificeren herhaalbare signalen. Dissectie van chemosensory organen kunnen onbeduidend of delicaat en tijdrovend, afhankelijk morfologie en grootte van de insecten. Herstel van hoge kwaliteit RNA kan wat het oplossen van problemen vereisen ook, zoals het vermijden van bepaalde pigmenten tijdensweefsel collectie.

Demonstreert het effect van afstotende verbindingen door gedrags- beproevingen is direct en informatief, deze benadering is tijdsintensief en breed met betrekking tot werkingsmechanisme. Elektrofysiologie in combinatie met RNA-seq zorgt voor meer specifieke analyses van wat drijft vermijdingsgedrag bij insecten. Zodra de "toolkit" chemische discriminatie geïdentificeerd in een insectensoorten, specifieker pogingen verbeteren bekende insectenwerende mogelijk. Receptoren en geassocieerde eiwitten in sensorische cellen die verantwoordelijk zijn voor deze gedragingen kunnen heteroloog tot expressie worden gebracht voor directe chemische screening. Bovendien kunnen moleculaire modellering voorspellen welke chemicaliën sterke reacties zal uitlokken van deze receptoren 7.

De momentopname van alle actieve genen in een smalle reeks van chemosensory weefsels kan ook nuttig zijn bij het identificeren van gelijkaardige genen in andere soorten. Met behulp van homologie en expressie similarities, onderzoekers kunnen sets van de moleculaire receptoren hoogstwaarschijnlijk bemiddelen reacties op insectenwerende middelen die zijn grotendeels effectief op insecten te vormen. We presenteren de volgende protocol om onderzoekers te helpen bij het deconstrueren insect chemosensory paden en om meer te overtuigen om zich te verdiepen in de neuroethology van niet-model en economisch belangrijke insecten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Het grootbrengen Ae. aegypti volwassenen

  1. Hatch eieren in ongeveer ¾ inch water in ondiepe lade. Overbevolking zal de omvang van de volwassenen te verminderen.
  2. Achterste larven bij 25 ° C (12-hl: 12-HD) en voeden met gemalen vis eten.
    OPMERKING: Overvoeren kan overlevingskansen verminderen.
  3. Verwijder poppen individueel door Pasteur pipet dagelijks en over te dragen aan plastic schaaltjes (9 cm x 5,5 cm) in kleine insluiting emmers met fijn gaas deksels, dus tot oprichting van 24 uur leeftijdsgroepen.
  4. Feed volwassen muskieten 10% sucrose oplossing watje geplaatst op het scherm wanden van een kooihouderij de muggen in een klimaatkamer bij 27 ° C en 70% relatieve vochtigheid onder dezelfde fotoperiode larven.
  5. Voor elektrofysiologie, gebruiken 5-10 dagen oude dieren. In het algemeen zullen grotere dieren betere resultaten. Voor RNA-isolatie, gebruiken dieren die binnen een enkele 24 hr leeftijd groepering in de 5-10 dagen oude range.

2. Voorbereiding van chemische stoffen

  1. Bepaal een geschikte concentratie elektrolyt (bijvoorbeeld 1-10 mM) dat minimale activiteit ontlokt geselecteerde sensorische neuronen. 10 mM NaCl of KCl 1mM redelijk zijn elektrolyten met baseline activiteit te testen bij het begin van een experiment.
  2. Los elke experimentele chemische stof in geschikt oplosmiddel (indien geen water gebruikt ethanol of DMSO) die weinig of geen effect heeft op spike activiteit wanneer vergeleken met alleen elektrolyt. Eindconcentraties van 10% ethanol en 1% DMSO redelijk uitgangsconcentraties.
  3. Kies de juiste (bv kinine voor bitter of sucrose voor zoet) controle chemische stoffen die zijn goed beschreven voeden afschrikmiddelen of stimulerende middelen bij insecten.

3. Electrofysiologie (tip opname 8; figuur 1)

  1. Vorm glaselektroden door mechanisch trekken glas haarvaten. Optimaliseren van warmte en trek instellingen glas trekken om geschikt gevormde recordi vormenng elektroden. Breek voorzichtig einde van glas elektrode behulp van een tang onder een dissectiemicroscoop om elektrode tip opening die groot genoeg is om het doel sensillum envelop, maar klein genoeg om contact met naburige structuren te vermijden creëren.
  2. Onder een microscoop, visueel te identificeren door de morfologie en de positie van het doel sensilla / sensillum om herhaalbaarheid van tip opname te verzekeren. Prep dieren vrije toegang tot sensilla uit hoek van de elektrode toe te laten.
  3. Koude Verdoven volwassen insecten in de vriezer bij -20 ° C. Voorkom schade aan perifere neuronen door blootstelling aan koude temperaturen. Snij smalle stroken plakband met een scheermesje op glasplaatje. Immobiliseren hele insect op een glasplaatje met behulp van smalle stroken.
  4. Plaats een chemisch geslepen wolfraam draad in de dorsale thorax of het oog om te dienen als de onverschillige (grond) elektrode.
  5. Vul het glas elektrode gemaakt in stap 3.1 met een stimulerende oplossing van belang. Met behulp van een injectiespuit ingebracht, vuldopIllary uit trok begin tot eind af te stompen. Schud alle luchtbellen, houdt trok eind naar beneden. Plaats een zilveren draad (chloriding optioneel) in de glazen elektrode gemaakt in stap 3.1 om te dienen als opname en stimulerende elektrode.
  6. Verbinding elektroden een voorversterker die is ontworpen voor opnamen van contact chemoreceptive sensilla bij insecten. Deze voorversterker (300 Hz-3 kHz bandfilter) zal de afwikkeling van de tijd aan de neuronale activiteit zo dicht mogelijk bij introductie stimulus mogelijk vast te leggen verminderen. Verzamelen, opslaan en elektrische signalen met behulp van een microcomputer uitgerust met spike opname software te analyseren.
    OPMERKING: Aarding de opname juist ingesteld drastisch verbeteren signaal-ruisverhouding.
  7. Stimuleer sensilla met een controle-oplossing (alleen elektrolyt) om functionaliteit te waarborgen. Count spikes beginnend 200 msec na de stimulus artefact voor alle voorbereidingen.
  8. Willekeurige volgorde testchemicaliën voor alle experimenten, behalve dosis-respons studiesbias elimineren. Bij dosis-respons studies blootstellen sensilla toenemende concentraties van de experimentele chemicaliën. Laat een minimum van 3 minuten tussen prikkels om voldoende herstel te garanderen.
    OPMERKING: Deze eis kan variëren, afhankelijk van insecten en sensilla. Drempel wordt gedefinieerd als die concentratie waarbij standaardfout niet overlappen met de standaardfout voor de laagste geteste concentratie.

4. RNA isolatie en sequentiebepaling (figuur 2)

  1. Bereid de nauwsluitende-RNAse vrij stampers door afkoeling ze op droog ijs voordat weefsel disruption.Prepare bijbehorende RNase vrij stampers dat snap cap buizen past strak. Houd verzameling buizen gesloten, tenzij actief ontleden om het overtollige condensvorming te voorkomen.
  2. Met behulp van gefilterde aspirator, plaatsen 30 tot 40 koud-verdoofd muggen (15 sec in de -20 ° C vriezer) op koude fase en sorteer op seks. Plaats dieren dorsale kant naar beneden, grijpen vleugels om niet smaak aanhangsels beschadigen.
  3. Gebruik van twee paar fijne tang, ontleden gepaarde labella of tarsi van mannen of vrouwen onder een dissectiemicroscoop en integratie van aangrenzende weefsels te beperken.
    OPMERKING: 500 gepaarde labella levert ongeveer 800-1000 nanogram totaal mRNA. 400 individuele tarsi (5 segmenten elk) opleveren 1,200-1,800 nanogram totaal mRNA.
  4. Met een paar van hijgend-tang, licht begrijpen mosquito slurf net proximaal van labella bloot innerlijke stiletten. Het gebruik van andere paar collectie-tang, verwijder labella en voeg weefsel kant van inzameling koude buis.
  5. Met een pincet, licht begrijpen mosquito been op het knooppunt van de tibia en de eerste tarsal segment. Het gebruik van andere pincet, verwijder tarsi en voeg weefsel naar de andere kant van inzameling koude buis.
    OPMERKING: Houd rekening met de celtypes op het snijvlak van gewenste en ongewenste weefsel. Hoewel het belangrijk is om de opname van naburig weefsel te beperken, is het even belangrijk om niet gewenste delen van weefsel weg te laten. De final monster moet nauwkeurig het gehele orgaan van belang vertegenwoordigen. Maak een precieze grens met de grijptangen zodanig dat de collectie tang precies kan bevrijden door schrapen of grijpen alleen de gewenste weefsel.
  6. Periodiek, spin down collectie buis kort in 0 ° C centrifuge bij 9000 xg om weefsel aan de onderkant van de buis te houden. Als er vocht ophoopt in de collectie buizen tijdens dissectie, voeg 50 ul van koude Trizol reagens om verzamelde weefsel te dekken.
  7. Met behulp van anti-smudge lab marker, een duidelijk label one-RNase vrij 1,5 ml snap cap buis voor elk type weefsel voor de collectie. Met behulp van 1,5 ml buis rek en vloeibare stikstof, vries dan vermalen weefsel tot fijn poeder (fijne stukjes als in Trizol). Herhaal een keer. Breng totale volume van Trizol tot 1 ml en opnieuw in suspensie gemalen weefsel door vortexen.
  8. Voeg 200 ul van chloroform en meng goed. Na 5 minuten bij kamertemperatuur, het afsluiten van centrifuge bij 4 ° C en 11.000 g gedurende 15 min. Voorzichtigvoeg waterige laag direct op een genomisch DNA filterkolom. Spin down bij 11.000 x g gedurende 5 min. Voeg gelijk volume RNase-free 70% ethanol doorstroom en meng door pipet. Transfer vloeistof aan een RNA collectie kolom en verder RNA-extractie volgens de instructies verstrekt.
  9. Kwantificeren en de zuiverheid van totaal RNA te beoordelen op een precisie-spectrofotometer en doorgaan met elke standaard RNA-sequencing methode.

5. Kwantitatieve RT-PCR Validatie RNA Sequencing (figuur 3)

  1. Selecteer zoveel genen mogelijk relatieve genexpressie niveaus vergelijken over een dynamisch bereik, zowel voorspelde sequentie overvloed en veronderstelde chemosensory genfunctie.
  2. Ontwerp primerparen voor elk doelwitgen aan een specifieke 100-180 baseparen PCR product amplificeren. Exclusief niet-specifieke gDNA versterking door te zorgen voor ten minste één primer per set overspant een intron grens. U kunt ook gebruik maken van DNase behandeling om genomische besmetting te verminderen.
  3. Verzameleninsect weefsel zoals beschreven in voorgaande paragraaf. Bereken hoeveel weefsel moet voldoende RNA aan alle qRT-PCR reacties te voltooien.
    OPMERKING: Biologische drievoud en technische drievoud reacties zullen maximaal vertrouwen in de resultaten.
  4. Bereken relatieve gen kwantificering X doelgroep - (Ct [doel] -ct [referentie]) voor elk target-gen en het gemiddelde voor elke repliceren, zowel biologische en technische. Gebruik huishoud-gen (en) Ct-waarden normaliseren tussen biologische replicaten en de Y-as schaal wortel in vergelijkingen van relatieve expressieniveaus.
  5. Beoordeel de gelijkenis van RNA-seq en qRT-PCR datasets met de regressie gebaseerde, bootstrap gelijkwaardigheidsprocedure 9 iteratief toegepast op de gegevens van elk weefsel.
    OPMERKING: Deze procedure identificeert de kleinste "regio van overeenkomst" die kunnen worden opgebouwd rond de waargenomen RNA-seq en qRT-PCR data, en laat de relatieve genexpressie zoals gemeten door qRT-PCR geacht statistisch gelijkwaardig aan het meten van relatieve genexpressie door RNA-seq.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het spoor opnames van actiepotentialen van Ae. aegypti smaak sensilla (figuur 1) tonen de doeltreffendheid van directe stimulatie met diverse chemicaliën. Deze techniek kan worden gebruikt om reacties op elk stimuleren chemische gekwantificeerd door het tellen pieken van een gegeven amplitude en duur in een redelijke tijdspanne (over het algemeen minder dan 500 ms). Trace opnames moeten gemakkelijk reproduceerbaar onder een bepaalde set van experimentele omstandigheden zijn. Anders kan de waarg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest uitdagende aspect van de opname actiepotentialen van smaak sensilla is te beslissen welke reacties zijn "normaal". Bij toepassing van enkele smaak sensillum tip opnemen van de eerste keer voor een bepaalde insectensoorten, het totale aantal en de gevoeligheden van de smaak receptor neuronen (GRNs) zijn waarschijnlijk onbekend. Veel voorlopige opnames worden eerst nodig om het bereik en de concentraties van chemicaliën te testen beslissen. In dit geval, begonnen we met de waarneming dat één GRN reageer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Bryan T. Vinyard van de USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD voor statistische analyses. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie aan J.C.D. van het Deployed War Fighter Protection (DWFP) Onderzoeksprogramma, gefinancierd door het Department of Defense via de Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glass capillaryA-M Systems628000Standaard, 1,5 mm X 0,86 mm, 4"
Silver wireA-M Systems7875.015" naakt
Tungsten wireAlfa Products3690,127 mm diameter
Fine forcepsFine Science Tools11252#5SF Inox
Refridgerated stageBioQuip Products1429Chill Table
PreamplifierSyntechTaste Probepreamplifier
Software voor elektrofysiologieSyntechAutospikesoftware voor elektrofysiologie
TetraMin visvoerTetraTropisch visvoerkorrelsvisvoer vermalen tot fijn poeder
TRIzolLife Technologies15596-026RNA isolatiereagens
RNeasy Plus Mini KitQiagen74136inclusief gDNA eliminator en RNeasy spin columns
Nanodrop spectrofotometerNano Drop ProductsND-1000tafelspectrometer
R statistiekfreeware (gemaakt door Robert Gentleman en Ross Ihaka)www.r-project.orgGebruik de lm-functie van het stats-pakket en de equiv.boot-functie van het equivalence-pakket in de R-computeromgeving.
1,5 ml buisjesrekEvergreen240-6388-030Vul vloeibare stikstof in een paar lege putjes om weefsel te bevriezen en te vermalen.
1,5 ml verzamelbuisjes met stamperGrainger6HAX6RNase vrij
CentrifugeThermo Scientific11178160Slinger het bevroren weefsel naar de bodem van de 1,5 ml buis.
Primer-BLAST Primer OntwerptoolNCBIn/a

Referenties

  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
  3. Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
  4. Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930(2012).
  5. Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
  6. Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
  7. Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
  8. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
  9. Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
  10. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  11. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
  12. Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
  13. Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
  14. Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
  15. Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598(2009).
  16. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
  17. Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
  18. Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Registratie van smaakneuronenelektrofysiologische registratieweefseldissectieisolatie van totaal RNAqPCR validatiespike tellingchemoreceptiegenensmaakweefsels

Gerelateerde artikelen