Profiterend van Reduced Droplet-oppervlak interactie aan Transport van Bioanalytes Optimaliseer in Digital Microfluidics

Samenvatting

Het protocol voor de fabricage en werking van velddewetende apparaten (Field-DW) wordt beschreven, evenals de voorlopige studies van de effecten van elektrische velden op druppelinhouden.

Samenvatting

Digitale microfluidiek (DMF), een techniek voor het manipuleren van druppels, is een veelbelovende alternatief voor de ontwikkeling van “lab-on-a-chip” platformen. Vaak is de beweging van druppels afhankelijk van de bevochtiging van een oppervlak, direct geassocieerd met het toepassen van een elektrisch veld; oppervlakte-interacties maken de beweging echter afhankelijk van de inhoud van de druppel, waardoor de breedte van toepassingen van de techniek wordt beperkt.

Er zijn enkele alternatieven gepresenteerd om deze afhankelijkheid te minimaliseren. Ze zijn echter afhankelijk van het toevoegen van extra chemische soorten aan de druppel of de omgeving ervan, die mogelijk kunnen interageren met druppel-mogelijkheden. Om deze uitdaging aan te pakken, ontwikkelde onze groep onlangs Field-DW-apparaten om het transport van cellen en eiwitten in DMF mogelijk te maken, zonder extra additieven.

Hier wordt het protocol voor apparaatontwikkeling en -bediening gegeven, inclusief de elektronische interface voor bewegingscontrole. We zetten ook de studies voort met de apparaten en laten zien dat meercellige, relatief grote modelorganismen ook kunnen worden getransporteerd, vermoedelijk onaangetast door de elektrische velden die nodig zijn voor apparaagbewerking.

Inleiding

De miniaturisatie van apparaten die werken met vloeistoffen is van groot belang voor de ontwikkeling van "lab-on-a-chip 'platformen. In deze richting, hebben de afgelopen twee decennia een belangrijke vooruitgang op het gebied van microfluidics getuige, met een verscheidenheid aan toepassingen. ^1-5 Contrasterende met het vervoer van vloeistof in gesloten kanalen (kanaal microfluidics), DMF manipuleert druppels op arrays van elektroden. Een van de meest aantrekkelijke voordelen van deze techniek is de afwezigheid van bewegende delen om vloeistoffen te transporteren en beweging direct gestopt door het uitschakelen van elektrische signalen.

Echter, druppeltje beweging afhankelijk inhoud druppel, zeker een ongewenste eigenschap voor een universele "lab-on-a-chip" platform. Druppeltjes bevattende eiwitten en andere analyten vasthouden aan het apparaat oppervlakken, steeds onbeweeglijk. Ongetwijfeld is dit al de grote beperking voor het verbreden van de reikwijdte van de DMF-toepassingen; ^6-8alternatieven voor het ongewenste oppervlak vervuiling te minimaliseren omvatten de toevoeging van extra chemische species om de druppel of omgeving die potentieel druppeltje inhoud kunnen beïnvloeden.

Voorheen onze groep ontwikkelde een apparaat om het transport van cellen en eiwitten in DMF toe te staan, zonder extra toevoegingen (Field-DW-apparaten). ⁹ Dit werd bereikt door het combineren van een oppervlak op basis van kaars roet, ¹⁰ met een apparaat geometrie die druppel rollende gunsten en leidt tot een opwaartse kracht op de druppel verder afnemende interactie droplet-oppervlak. In deze benadering wordt druppeltje beweging niet geassocieerd met oppervlaktebevochtiging. ¹¹

Het doel van de gedetailleerde methode hieronder beschreven aan een DMF inrichting kan transporteren druppeltjes bevattende eiwitten, cellen en gehele organismen produceren zonder extra toevoegingen. The Field-DW-apparaten maken de weg vrij voor een volledig gecontroleerde platformen grotendeels zelfstandig werken van de druppel chemicusry.

Hier presenteren we ook simulaties blijkt dat, ondanks de voor de werking van het apparaat hoogspanning, de spanningsval over de druppel is een kleine fractie van de aangelegde spanning, op verwaarloosbare effecten op bioanalytes in de druppel. In feite, voorproeven met Caenorhabditis elegans (C. elegans), een nematode gebruikt voor verschillende studies in de biologie, blijkt dat wormen zwemmen ongestoord als voltages toegepast.

Protocol

OPMERKING: In de hierna beschreven procedures, moet veiligheidsrichtlijnen altijd opgevolgd. Van bijzonder belang is de veiligheid bij de behandeling van hoge spanning (> 500 V) en handen wassen.

1. Coating van een geleidend substraat met Kaars Roet

1. Cut koper metaal in rechthoeken (75 x 43 mm, 0,5 mm dik). Reinig elke koper substraat door onderdompeling in koper etsmiddel voor ongeveer 30 sec, wassen met leidingwater voor ongeveer 20 sec, en droog met papier.
   OPMERKING: Bij gebruik van methode 1 hieronder, veranderen de afmetingen 75 x 25 mm om te passen in de machine.
2. Sweep een brandende kaars paraffine onder de koperen substraat gedurende 30-45 seconden, om een ​​ongeveer uniform coating roet (ongeveer 40 urn dik) te verkrijgen. Houd het substraat ~ 1 cm in de vlam. Laat het fragiele roet niet aan.

2. Bescherming van de Roet Layer met Coating

OPMERKING: Het roet laag is zeer fragielEn moet worden bekleed ter bescherming. Twee eenvoudige alternatieven (methode 1 en 2) worden hier voorgesteld, maar robuuster protocollen zijn nog in ontwikkeling.

1. Methode 1
   1. Plaats het monster in de metalen verdamper of sputtering systeem. Na de operatie procedures van het systeem, evacueren de kamer, en start gecontroleerde afzetting van goud op de roet laag (150-200 nm). Laat het apparaat afkoelen tot kamertemperatuur.
   2. Dip-coat de gemetalliseerde substraat in een 1-dodecaanthiol oplossing (1% v / v, in 95% ethanol, ACS / USP), gedurende 10 min in een chemische kap. Vervolgens, het toestel op een hoek van bijna 60 °, voorzichtig wassen het oppervlak met enkele druppels alleen ethanol. Laat de apparaten droog, 's nachts.
2. Methode 2
   1. In een chemische kap onmiddellijk na het bekleden van het substraat met roet en terwijl het substraat nog warm van de kaars vlam, deponeren enkele druppels gefluoreerde vloeistof aan één zijde van desubstraat, en kantel het substraat naar een hoek in de buurt van 90 °. Stort meer druppeltjes, en laat ze rollen over de gehele roet oppervlak.
      OPMERKING: Wanneer de druppel valt op een plek, zal roet uit de buurt van dat gebied worden gewassen. Laat de druppeltjes van vloeibare gefluoreerde spread zoveel mogelijk.
   2. Bak het substraat op een hete plaat (160 ° C gedurende 15 min) in een chemische kap.
   3. Laat het substraat zitten overnacht bij kamertemperatuur vóór gebruik. Slaan voor onbepaalde tijd.

3. Fabricage van Top Elektroden (Aangepast van Abdelgawad et al. ¹²⁾

1. Teken de elektroden met behulp van software voor grafisch ontwerp. Elke elektrode is 2 mm lang, 0,3 mm breed, en de opening tussen elektroden 0,3 mm. De kloof tussen de contacten (snap in de connector, zie hieronder) is 2,3 mm (figuur 1).
2. Knip een flexibele koperen laminaat (35 micrometer dik) in de Monarch-formaat (3,87 x 7,5 inch). Gebruik andere maten if compatibel zijn met de printer. Laad het laminaat in de lade voor handmatige invoer van een kleurenprinter.
3. Zorg ervoor dat "rijke zwarte" of "registratie zwarte" gebruiken, wanneer u afdrukt op de koperen plaat (zie Abdelgawad et al. ¹² voor details) om een dichtere laag zwarte inkt toe op de koperen ondergrond, de bescherming van het gedrukte patroon tijdens het etsen . Laat het bedrukte substraat volledig opdrogen, 's nachts.
4. Binnen een chemische kap, opwarmen (40 ° C) een bekerglas met 50 ml van koper etsmiddel. Dompel de bedrukte laminaat in de beker, en schud het in de oplossing gedurende ongeveer 10 min. Ets hangt af van de koperen etsoplossing. Om de paar minuten, controleer dan de corrosie en zien of het patroon intact is.
5. Was de laminaat met water en verwijder de coating met aceton en ethanol in de chemische kap. Was weer, en voorzichtig droog het laminaat met een papieren handdoek.
6. Zorgvuldig hechten het laminaat met elektroden om een ​​glass slide (75 x 25 mm, ~ 1 mm dik), met behulp van dubbelzijdige tape. Vermijd luchtbellen.
7. Bevestig een film van perfluoralkoxy PFA naar de elektroden met behulp van tape. Dit dient om toevallig contact van de elektroden met de druppel, voorkomen dat die schade top elektroden te wijten aan kortsluiting.

4. De elektronische interface (Circuit figuur 2)

1. Soldeer de relais en de condensatoren C om een ​​universele printplaat.
2. Monteer de rest van het 10 relais drivers op een Breadboard voor elektronische schakelingen.
3. Draads ingang elk relais bestuurder om een ​​kanaal in de besturingskaart.
4. Zorgvuldig snap boven elektroden in een connector (figuur 3). Wire uitgang elk relais bestuurder om een ​​bovenelektrode, zoals afgebeeld. Merk op dat er een geaarde connectorcontact tussen twee draden van relais, elektrische ruis te minimaliseren.
   Opmerking: De connector zit op een verstelbare platform t besturenhij afstand (0,1-0,5 mm) tussen de boven- en onderkant (roet-gecoat) substraat.
5. Gebruik een programma om timing voor hoogspanning (HV) applicatie (ongeveer 0,8 sec) 4 elektroden tegelijk bedienen verschuiven 1 elektrode in de richting van beweging (bijvoorbeeld, 0,8 sec aandrijving 1234, dan 2345, 3456, enz ., 0,8 sec voor elke groep, en vervolgens naar achteren, dus druppel in de tegengestelde richting aan).

5. Droplet Visualization and Handling

1. Om druppeltje beweging opnemen, gebruikt het visualisatie systeem, dat bestaat uit een 24X - 96x vergroting samenstel gecombineerd met een CCD camera. Sluit de videorecorder aan op de camera met behulp van S-video.
2. Pipetteer een 4 pl druppelgrootte met C. elegans media op de bodem van de roet beklede substraat.
3. Breng de bovenste elektroden ~ 0,3 mm boven de druppel. De druppel moet dicht bij het midden, net onder de vijfde elektrode, voor gemakkelijkere bediening zijn.
4. Zet de elektronische interface en spanning (500 V _RMS) en stel de bovenste elektrode afstand tot de druppel tot het begint te bewegen. Laat niet de top elektroden raken de druppel.
5. Gegevens verzamelen door het opnemen van het aantal succesvolle overdracht druppel op het apparaat in reactie op elektrische pulsen. Een succesvolle experiment wordt gekenmerkt minstens 700 druppeltje transfers, dwz één overdracht na elke elektrische puls.
6. Verzamel data continu tot de druppel niet meer bewegen in reactie op 5 tot 10 pulsen.
   Opmerking: Als het oppervlak begint te degraderen, kan beweging worden hersteld door dichter bij de druppel waardoor de bovenste elektroden.

Resultaten

Eerder hebben we Field-DW apparatuur gebruikt voor de beweging van eiwitten in DMF toe. In het bijzonder zou druppeltjes met bovine serum albumine (BSA) in een concentratie 2000 maal hoger dan eerder gerapporteerd door andere auteurs (zonder additieven) worden bewogen. Dit was te wijten aan de verminderde interactie tussen druppel en het oppervlak Figuur 4 toont een druppel die fluorescent gelabeld BSA (zie Freire et al ⁹ voor meer informatie over de experimenten.). De eerst...

Discussie

De meest kritische stap van het protocol is de bescherming van het roet laag rechtstreeks bij het succes bewegende druppeltjes. Metalliseren roet laag (methode 1 hierboven) kan bijna 100% van fabricage succes. De maximale werking is ongeveer 10 min; eventueel worden druppel fracties bevochtigen roet door gaten in de metaallaag. Het roet laag met de gefluoreerde vloeibare coating is de makkelijkste en snelste alternatief, en vereist minimale middelen, maar slechts 40-50% van de (min maximaal 20) gefabriceerd substraten w...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Paraffinekaars			Elke paraffinekaars
Sputteringsysteem	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP uitgerust met een Au-doel.
1-dodecanethiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Gefluoreerd vloeistof: Bereid Teflon-AF hars in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), om de hydrofobe coating te creëren.
Grafisch ontwerpsoftware -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Andere softwares kunnen ook worden gebruikt.
Koperlaminaat	Dupont	LF9110
Laserprinter	Xerox	Phaser 6360 of soortgelijk	Controleer op de compatibiliteit met "rijk zwart" of "registratie zwart" (zie tekst).
Koper-etser	Transene	CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film	McMaster-Carr	84955K22
Broodplank	Allied Electronics	70012450 of soortgelijk	Groot genoeg om de assemblage van 10 drivers mogelijk te maken.
Universele printplaat	Allied Electronics	70219535 of soortgelijk
Aansluiting	Allied Electronics	5145154-8 of soortgelijk
Besturingskaart en besturingsprogramma (LabView software)	National Instruments	NI-6229 of soortgelijk
Hoogspanningsversterker	Trek	PZD700
Condensatoren C en C1, 100 nF, 60 V	Allied	8817183
Transistor T, NPN	Allied	9350289
Diode D, 1N4007	Allied	2660007
Relais	Allied	8862527
Visualisatiesysteem	Edmund Optics	VZM 200i of soortgelijk	Systeemvergroting 24X – 96X. Het is gecombineerd met een Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder	Sony	GV-D1000 NTSC of soortgelijk	Het is verbonden met de camera door een S-videokabel.
Simulaties	COMSOL Multiphysics	V. 4.4