In vivo en in vitro kweken van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae en Heterorhabditidea)

Samenvatting

Het doel van deze presentatie is in vivo en in vitro technieken voor het opfokken van entomopathogene nematoden aan te tonen. In vivo methoden beschouwen het fokken van deze nematoden met een insect host, terwijl de in-vitro-methoden maken gebruik van rich media-agar.

Samenvatting

Entomopathogene nematoden (EPN) (Steinernematidae en Heterorhabditidea) hebben een mutualistische partnership met Gram-negatieve Gamma-Proteobacteria in de familie Enterobacteriaceae. Xenorhabdus bacteriën worden geassocieerd met steinernematids nematoden terwijl Photorhabdus zijn symbionten van heterorhabditids. Samen nematoden en bacteriën vormen een krachtig insecticide complex dat een breed scala aan soorten insecten doodt in een intieme en specifieke partnerschap. Hierin tonen we in vivo en in vitro technieken vaak gebruikt bij de kweek van deze nematoden onder laboratoriumomstandigheden. Bovendien zijn deze technieken vertegenwoordigen belangrijke stappen voor het succesvol opzetten van EPN culturen en vormen ook de basis voor andere bioassays dat deze organismen voor onderzoek te gebruiken. De productie van aposymbiotic (-symbiont gratis) aaltjes is vaak van cruciaal belang voor een diepgaande en veelzijdige benadering van de studie van de symbiose. Dezeprotocol niet de toevoeging van antibiotica en kan worden bereikt in een korte tijd met standaard laboratoriumuitrusting. Nematoden die op deze wijze relatief robuust zijn, hoewel hun overleving in opslag kan variëren naargelang de gebruikte soort. De technieken beschreven in deze presentatie komen overeen met die beschreven door verschillende auteurs en verfijnd door P. Stock's Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, Verenigde Staten). Deze technieken verschillen van het lichaam van technieken die worden gebruikt bij de massaproductie van deze organismen gewasbescherming doeleinden.

Inleiding

Entomopathogene nematoden (EPN) Steinernema en Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidea) en hun bacteriële symbionten, Xenorhabdus en Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) worden beschouwd als een opkomend model van landdieren-microbe symbiotische relaties ^2-4,6,10,19. Xenorhabdus en Photorhabdus spp. worden gekoesterd als symbionten in de darm van de enige vrije-levende fase van de nematoden, ook wel bekend als de infectieuze jeugdige (IJ) of 3 ^e fase besmettelijk juveniele ^8,10,13. De bacterie-nematode paar pathogeen is voor een breed scala van insecten en is in de biologische bestrijding en geïntegreerde bestrijding programma's wereldwijd ^6,8 succes is uitgevoerd.

Hierin laten wij u een selectie van in vivo en in vitro technieken die vaak worden uitgeoefend voor het opfokken van EPN onder laboratoriumomstandigheden. In vivo methoden overwegen een insect gastheer voor het opfokken van de aaltjes. Meestal onvolwassen stadia van verschillende insecten orders (dwz Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, etc..) Worden beschouwd als geschikte gastheren. In vivo methoden worden meestal beschouwd als voor het onderhoud van de nematode culturen in het lab. Kan deze methode niet geschikt zijn bij het overwegen van de massaproductie van de aaltjes. Grote hoeveelheden insecten hosts kan nodig zijn voor dit doel vraagt ​​meer tijd en extra kosten in verband met het insect opfok.

Entomopathogene nematoden kan ook worden gekweekt in vitro op verschillende media. Afhankelijk van het doel van de studie, in vitro werkwijzen kunnen overwegen of de opname van de symbiotische bacteriën in de media. In deze presentatie, beschrijven we twee meest gebruikte methoden voor de vermeerdering van de EPN. De ingrediënten van de media als bron van voedingsstoffen voor de symbiotische bacterie eennd een sterol bron voor de nematoden. In vitro methoden bieden het voordeel van het houden van EPN zonder een insect host.

Oorspronkelijk vele in vitro media werden ontwikkeld voor de vermenigvuldiging van EPN wanneer geschikte insect gastheren beschikbaar. Echter, de afgelopen jaren, in vitro teeltmethoden zijn geworden op grote schaal gebruikt in het onderzoek gericht op de mutualistische relatie tussen EPN en hun symbiotische bacteriën ^17,19 begrijpen.

De technieken beschreven in deze presentatie overeen met die beschreven door verschillende auteurs en verfijnd door de Stock Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Deze technieken verschillen van het lichaam van technieken die worden gebruikt bij de massaproductie van deze organismen gewasbescherming doeleinden.

Protocol

1 In vivo kweken van Entomopathogene Nematoden met hun Symboitic Bacteriën

1. Inverteer 100 x 15 mm plastic Petri-schaal en leg twee schijven filtreerpapier (90 mm) in het deksel van de schaal.
2. Verdeel 1 ml van de IJ (infectieve juvenielen) water suspensie (in een concentratie van 1000-2000 IJ / ml) op het filtreerpapier.
   OPMERKING: IJs hoeft oppervlak gesteriliseerd.
3. Voeg 10 larven laatste instar van de grotere waxmoth Galleria mellonella aan het gerecht. Het doel is om ongeveer 100-200 IJs / larve bieden.
4. Bedek de deksel met de bodem van de petrischaal (figuur 1) en label de petrischaal. Vermeld de volgende gegevens: nematode soortnaam (indien bekend); isoleren code / benaming; datum infectie val werd ingesteld.
5. Zet de schaal in een losjes afgesloten plastic zak (om vocht te besparen) en bewaar deze in het donker op een van beide kamertemperatuur of in een incubator tussen 20-25 ° C. Controleer gerechten dagelijks
   OPMERKING: duisternis vergemakkelijkt nematodeninfectie, zoals bootst natuurlijke infectie omstandigheden in de bodem.
6. Na 3-5 dagen, verwijdert kadavers met tekenen van nematodeninfectie een gewijzigde Witte trap ^7.
   OPMERKING: Als de kadavers ruiken verrot, kan dit een indicatie dat de kweek niet succesvol was en / of er verontreinigingen te zijn. Stel een nieuwe infectie kamer met een nieuwe batch van nematoden en insecten.

2 In vitro kweken van Entomopathogene Nematoden met hun symbiotische bacteriën

1. Lever-nier-Agar Methode ^9,19
   1. Hak de lever en nieren in kleine stukjes (2 cm ³ of kleiner) en plaats in een blender met NaCl, agar en 300 ml water en meng tot het vlees wordt een vloeibare pulp, dikke pasta of puree. Vervolgens brengen mengsel een 1 L erlenmeyer.
   2. Voeg de laatste 200 ml water aan de menger vaartuig en decanteer resterende medium in deErlenmeyer. Autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 ° C. Na autoclaveren laat agar afkoelen tot aanraken voordat gieten.
      OPMERKING: Pipetteren van medium is niet aanbevolen, omdat dit medium heeft de neiging om stukken vlees hebben.
   3. Giet ~ 20 ml agar op 5 (of 6) cm petrischaaltjes terwijl de hand roeren of zwenken van de erlenmeyer tussen giet voor een meer homogene media. Laat agar stollen en bewaar gerechten bij 4 ° C totdat het nodig is
      OPMERKING: Gebruik een vlam-gesteriliseerde metalen spatel te breken elke grote stukken vlees gegoten in de petrischaal.
2. Lipid Agar Methode ^9,19
   1. Bereid lipide agar medium door elkaar mengen voedingsstoffen bouillon, agar en gistextract en giet meng in een 2 L Erlenmeyer. Voeg gedestilleerd _H2O en _MgCl2 • 6H ₂ O en autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 ° C.
   2. Voeg steriele mix van maïsolie en glucosestroop mix en roer of schud krachtig en vaak oliedruppels gelijkmatig verspreiden.
      OPMERKING: Steriliseer maïsolie en stroop door het plaatsen van de benodigde hoeveelheid in een UV cross-linker. De olie lost niet op in de vloeistof, maar zorg ervoor dat het in kleine druppeltjes.
   3. Giet ~ 20 ml agar op een 5 (of 6) cm Petrischalen laat agar gestold opslag gerechten bij 4 ° C totdat het nodig is.
   4. Streak de gewenste symbiotische bacteriën op de lipide agar plaat en incubeer platen bij 28 ° C gedurende 24-48 uur.
      OPMERKING: Spread 100-200 ul nachts (12-16 uur) LB subcultuur.
   5. De dag na, voeg ongeveer 0,4 ml gesteriliseerde oppervlak nematode suspensie (eieren of infectieve juvenielen) en incubeer platen bij kamertemperatuur in het donker of in een incubator bij 22 ± 3 ° C.
      OPMERKING: Voeg geen meer dan 0,4 ml van nematode schorsing omdat het een te natte omgeving die ongunstig is voor nematode groei kunnen creëren.
   6. Monitor culturen dagelijks. Cultures zou een nieuwe generatie IJs produceren ongeveer 12 dagen (figuur 2).
   7. Transfer onderste schaal met agar als nematoden gezien kruipen de wanden van de capsule (figuur 3A) om een gewijzigd White trap (zie Orozco e.a.. ¹²⁾ te oogsten IJs (Figuur 3B). Voer deze stap onder een laminaire stroming kap om verontreiniging van de media te verminderen.
   8. Verzamel IJs van de gewijzigde Witte trap op opkomst en spoel IJ ophanging aan elk medium vuil te verwijderen. WINKEL IJ in gesteriliseerd gedestilleerd water bij 10 ° C (in een koude temperatuur incubator of koelruimte) of direct als nodig gebruiken.
      OPMERKING: Afhankelijk van het doel van de studie, het zaad van de platen met ofwel-symbiont gekoloniseerd of aposymbiotic nematoden.

3 In vitro kweken van Aposymbiotic (Symbiont-vrij) Entomopathogene Nematoden

1. Infecteren 10-20 G. mellonella larven met IJs van de gewenste nematodensoorten (zie hoofdstuk 1). Na 3 of 4 dagen (op dit moment IJs moeten gerijpttot de eerste generatie volwassenen) verzamelen kadavers.
   OPMERKING: De tijd tot de vervaldatum en het aantal vrouwen die nodig zijn om een ​​voldoende aantal eieren te verkrijgen is afhankelijk van de soort. Infecteren meer G. mellonella larven indien nodig en start dissecties al in de 48 uur na de infectie te beoordelen of ze in de juiste ontwikkelingsstadium.
2. Plaats elke kadaver afzonderlijk in een petrischaal met zoutoplossing (M9 buffer ^18). Ontleden van een kadaver door te trekken haar hoofd met een fijne punt pincet.
3. Verzamel minstens 20 gravid (met eieren binnen) vrouwen met een fijne naald (L-vorm bij voorkeur) en leg ze in een horlogeglas met 10 ml van M9 buffer (Figuur 4A).
4. Bereid een axenizing oplossing overwegen de volgende bestanddelen: 6,75 ml gedestilleerd water, 1,25 ml 5 N NaOH en 2,25 ml commercieel verkrijgbaar chloorbleekloog verdund tot 3% hypochloriet.
   OPMERKING: NaOH is een basische oplossing-handschoenen, veiligheidsbril en andere geschikte beschermendekleding dragen.
   OPMERKING: Bereid verse axenizing oplossing elke keer, als bleekmiddel degradeert in het licht. Bereid verscheidene partijen axenizing oplossing en het uitvoeren van het oppervlak sterilisatie en het oogsten van de eieren in meerdere horlogeglazen.
5. Spoel vrouwtjes tenminste driemaal met M9 buffer vullen horlogeglas met bufferoplossing en zuigen buffer met een pipet. Zorg ervoor dat de vrouwtjes blijven in het horlogeglas. Herhaal deze stap nog twee keer.
6. Voeg onmiddellijk de axenizing oplossing en laat de vrouwtjes in deze oplossing blijven niet langer dan 10-15 min. Let op de nematode weefsels beginnen te desintegreren, terwijl de eieren (die bestand zijn tegen de axenizing oplossing zijn) intact blijven.
7. Handmatig verstoren vrouwenlichamen om het proces te versnellen, door te snijden ze met een naald of een scalpel (Figuur 4B, C). Verwijder eieren door pipetteren ze in 1,5 ml microcentrifugebuizen, het vermijden van het toevoegen van eventuele onopgeloste weefsel.
   OPMERKING: Gebruik als melke microcentrifugebuizen noodzakelijk eieren verzamelen en snel te werken, als de levensvatbaarheid van de eieren zullen afnemen langere blootstelling aan axenizing oplossing.
8. Vortex buizen voor 15 sec met behulp van de "hoge snelheid" om verder te verwijderen nematode weefsels verbonden aan de eieren. Als alternatief, als een vortex niet beschikbaar is, pipet op en neer de oplossing meerdere malen.
9. Pellet eieren door centrifugeren bij ongeveer 18.000 g gedurende 2 minuten. Snelheid verhogen als de eieren niet voldoende pellet. Verwijder axenizing en spoel tweemaal uit het vullen van de microcentrifugebuis met steriel gedestilleerd water en centrifugeer een keer bij 900 xg gedurende 1 minuut.
10. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer eieren in 300-500 ui steriel gedistilleerd water en plaats ze in een steriele 3 cm Petrischaal of gesteriliseerd horlogeglas. Vergeet niet dat de eieren zijn nu-oppervlak gesteriliseerd, dus gebruik steriele pipetten en / of pippetter tips en water om reinheid van de eieren te behouden.
11. Onderzoeken eieren onder een dissectie microscoop (30-50X vergroting) om te bevestigen dat ze intact zijn (Figuur 4D) en overbrengen naar een 5 cm plaat met lever-nier-agar (zie paragraaf 2.1)
    OPMERKING: Plaats niet meer dan 400 ul van het ei schorsing toe te voegen op de platen als het de agar te natte zal maken.
12. Label platen met de juiste informatie en bewaar ze rechtop in het donker bij 28 ° C. Uitbroeden van de eieren moet duidelijk worden 's nachts.
    OPMERKING: water condenseren op het deksel van de schaal, maar het zal verdampen na 1 of 2 dagen. Op dit moment zet de schaal in plastic zak om vocht van de agar te behouden en voorkomen dat het drogen.
13. Observeer gerechten periodiek en gooi elke gerechten die tekenen van schimmel of bacteriële besmetting te tonen. Zodra IJs worden gezien migreren op de muur van de petrischaal, verwijder het deksel en breng de onderste schaal met agar een gewijzigde Wit val ^12. Overweeg steriele omstandigheden bij de overdracht de schaal in de Modified White val verontreiniging van de blootgestelde media te vermijden.
14. Continue monitoring van de Witte Traps en oogst IJ als dat nodig is.
    OPMERKING: Aposymbiotic nematoden zal blijven migreren in het water van de Witte val voor vele dagen en zelfs weken.

Resultaten

De in vivo opfok methode maakt gebruik van levende insecten als gastheer voor de groei nematode en voortplanting. Infectie kamers zijn een efficiënte methode voor het blootstellen van insecten IJs. Dit is de enige fase in de nematoden "levenscyclus dat de bacteriële symbionten vectoren ve insecten host naar de andere. Figuur 1 toont de opstelling voor een infectie kamer en het nodig is om deze kamer bouwen materialen. In vitro houderijmethoden mogelijk EPN groeien zonder insecteng...

Discussie

Met behulp van een geschikte gastheer is een belangrijke factor voor het succesvol in vivo kweken van EPN. Meestal kan zowel steinernematids en heterorhabditids reproduceren en hun levenscyclus met succes te voltooien in larven van de grotere wasmot, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Maar ook andere insectensoorten uit verschillende families en / of bestellingen worden overwogen. Enkele thans beschreven nematode species is bekend dat specificiteit voor een bepaalde insectengastheer. Bijvoor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Voor In vivo Infecties
100 x 15 Petri schotels	VWR	25384-088
Filterpapier, 9 cm grade 1 cellulose	Whatman/VWR	28450-081	Grade 1 filterpapier aanbevolen
Insect gastheren	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Galleria mellonella wordt aanbevolen
Voor Lever-nier Agar (voor 500 ml)
60 x 15 mm Petri schotels	VWR	25384-092
Rundlever, 50 g	Plaatselijke leverancier; slager of supermarkt		Resterende kan worden bevroren en ontdooid voor later gebruik
Rundernier, 50 g	Plaatselijke leverancier; slager of supermarkt		Resterende kan worden bevroren en ontdooid voor later gebruik
Natriumchloride 2,5 g (0,5% uiteindelijke concentratie)	Acros/VWR	200002-434	iedere onderzoekskwaliteit NaCl kan worden gebruikt
Agar, 7,5 g (1,5% agar, uiteindelijke concentratie)	HiMedia/VWR	95026-642	iedere mediakwaliteit agar kan worden gebruikt
500 ml gedistilleerd H2O
Voor Lipide Agar (voor 1 L)
100 x 15 Petri schotels	VWR	25384-088
Voedingsbouillon, 8 g	BD/VWR	90002-660
Gist extract, 5 g	EMD/VWR	EM1.03753.0500
Magnesiumchloride hexahydraat 10 ml (0,2 g/ml)	EMD/VWR	EM-MX0045-1
Maïsolie, 4 ml	Elk merk	Plaatselijke leverancier; supermarkt	Ieder merk maïsolie kan worden gebruikt
Maïssiroop, 96 ml meng 7 ml maïssiroop in 89 ml verwarmde H2O en draai voor homogeniteit	Karo	Plaatselijke leverancier; supermarkt
Agar, 15 g	HiMedia/VWR	95026-642	iedere mediakwaliteit agar kan worden gebruikt
Gedistilleerd H2O, 890 ml