Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

Samenvatting

Live beeldvorming van de embryonale zoogdieren slakkenhuis is uitdagend omdat de ontwikkelingsprocessen bij de hand werken op een tijdelijke helling van meer dan tien dagen. Hier presenteren we een methode voor het kweken en dan het afbeelden embryonale cochleair explant weefsel afkomstig van een fluorescerende reporter muis over vijf dagen.

Samenvatting

Hier presenteren we een methode voor langdurige time-lapse imaging van live-embryonale muis cochleair explants. De ontwikkelings-programma verantwoordelijk is voor de bouw van de sterk geordende, complexe structuur van de zoogdieren slakkenhuis opbrengst voor ongeveer tien dagen. Om veranderingen in genexpressie gedurende deze periode en de reactie op geneesmiddelen of genetische manipulatie studie op lange termijn beeldvorming nodig. Eerder heeft live beeldvorming doorgaans beperkt door de levensvatbaarheid van geëxplanteerde weefsel in een bevochtigde kamer boven op een standaard microscoop. Moeilijkheden bij het handhaven van optimale omstandigheden voor cultuur groei inzake vochtigheid en temperatuur beperkingen van de lengte van imaging experimenten. Een microscoop geïntegreerd in een gewijzigde weefselkweek incubator biedt een uitstekende omgeving voor lange termijn-live beeldvorming. In deze methode demonstreren we hoe embryonale muis cochleair explants stellen en hoe je een incubator microscoop gebruiken om time lapse Imagi voerenng met zowel helderveld en fluorescentie microscopie om het gedrag van een typische embryonale dag (E) 13 cochleaire explantaat en Sox2, een marker van de prosensory cellen van de cochlea, gedurende 5 dagen onderzocht.

Inleiding

Het zoogdier cochlea is een sterk geordende complex orgaan. In de muis, tussen het ontstaan ​​van de primitieve binnenoor van de otic blaasje op dag E11 en de voltooiing van het ontwikkelingsprogramma in de vroege postnatale fase, verschillende golven van celsignalen en gecoördineerde veranderingen in genexpressie plaatsvindt. Loopt van de basis tot top van het cochleaire kanaal is het geluid detecteren zintuiglijke epitheel, of orgaan van Corti. Ontwikkeling van het orgaan van Corti is prachtig gestuurd dat eind ontwikkeling, zal het bestaan ​​uit een enkele rij binnenste haarcellen, drie rijen buitenste haarcellen afgewisseld met vijf rijen van steuncellen (twee rijen pijler cellen drie rijen cellen Deiters ') ^1. Afwijking van deze precieze volgorde leidt tot gehoorverlies, heighlighting het belang van studye Ofthe genese en patroonvorming van de zintuiglijke epithemlium ^2.

In vitro kweken van de embryonale muis Cochlea is een essentieel instrument in het bestuderen van de mechanismen van de ontwikkeling van het orgaan van Corti. Deze techniek werd in 1974 en in de afgelopen 40 jaar is gebruikt om veel van de mechanismen die de sensorische epitheel wordt gespecificeerd en het orgaan van Corti vastgestelde ³ helderen. De cochlea is een complex orgaan met dynamische ontwikkelingsprocessen; een manipulatie kan zo lang duren als zeven dagen te manifesteren ^1. Bijvoorbeeld, het toevoegen GSK 3β remmers een cochleair explantaatkweek op E13, de optimale incubatietijd observeren een robuust effect van de verbinding zes dagen ^4.

Levende beeldvorming van de ontwikkeling cochlea maakt onderzoek naar veranderingen in de morfologie van het orgaan van Corti, veranderingen in genexpressie, het volgen van migrerende prolifererende of stervende cellen en maakt real-time observatie van de resultaten van farmaceutische middelen en verstoring signalering trajecten. Tot nu, leeft beeldvorming van de cochleais voornamelijk uitgevoerd met behulp van confocale microscopie om het kleine gebieden van het orgaan van Corti in een kort tijdsbestek ^5-8, maar deze techniek heeft beperkingen als gevolg van explant levensvatbaarheid. In beeld brengen van de effecten op de langere termijn manipulaties op trage ontwikkelingsprocessen, de imaging omgeving is cruciaal. Typisch een confocale live beeldvorming systeem een ​​vochtige plastic doos die zit op de microscoop. Warmte en vocht kunnen door de spleten in het incuberen doos waar het de microscoop tafel, door de toegang ramen, door de scharnierende openingen en door de spleten rond verschillende delen van de microscope- ontsnappen als het doel of de lichtbron. Dit is niet optimaal voor het behoud van gezonde explantaten meer dan twee of drie dagen.

We definiëren 'incubator microscoop "als een omgekeerde microscoop verzegeld in een standaard _CO2 incubator, in plaats van een incubator rond de microscoop. Een incubator microscoop exneigt de levensduur van het experiment zodanig dat in plaats beeldvorming gedurende twee of drie dagen, monsters worden afgebeeld maximaal twee weken. Een incubator microscoop biedt een uitstekende omgeving voor celgroei en differentiatie, met minimale verstoring van culturen en standaard gecontroleerde omstandigheden explanteren. In studies die plaatsvinden over meerdere dagen is het gebruikelijk om gebruik te beeldvorming monsters dagelijks door ze te verwijderen uit de incubator en de uitvoering daarvan een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop. Hoewel deze aanpak kan werken, het verwijderen van de gerechten uit de incubator toebrengt stress op de gevoelige ontwikkelen van weefsel. Veranderingen in de zuurgraad van het kweekmedium en schommelingen in de temperatuur als gevolg van verwijdering uit de incubator kan resulteren in een suboptimale ontwikkeling en ongezond weefsel. Beeldvorming hetzelfde gebied op dezelfde focal plane en in dezelfde richting op elk tijdstip is zeer uitdagend. Via een geautomatiseerd systeem in een incubator, kan men gezond houdenweefsel, om beelden te verzamelen op meer tijdstippen en ervoor te zorgen dat hetzelfde gebied zich in elk frame. In de afgelopen jaren verschillende geïntegreerde microscoop weefsel incubators zijn ontwikkeld, zijn deze nuttig niet alleen in klinische praktijk ⁹ maar ook in stamcellen en kankeronderzoek ^10,11.

Hier presenteren we een protocol voor de lange termijn live beeldvorming van embryonale muis cochleair explants. We maken gebruik van een geautomatiseerde microscopie-systeem in een standaard CO ₂ incubator die de mogelijkheid om beelden van meerdere monsters vastleggen op vaste tijdstippen heeft. Het systeem bestaat uit een omgekeerde microscoop set in een couveuse. Monsters worden geplaatst in een roterend podium die beeldvorming van meerdere monsters mogelijk maakt op elk tijdstip. Verlichting, het vastleggen van beelden, en de rotatie van het podium worden aangestuurd door een geautomatiseerd systeem bediend door Metamorph software. Door het instellen van een imaging routine met behulp van de besturingssoftware kunnen we een experiment ingesteld om te werken voor maximaal two weken met minimale menselijke tussenkomst. In dit voorbeeld worden zowel helderveld en fluorescentie grootschalige groei en herschikking van de cochlea, en specifiek de prosensory regio tonen. In dit experiment wordt cochleae ontleed uit Sox2 ^EGFP reporter muizen op embryonale dag E13. In vitro kweken worden opgezet en vervolgens gescand gedurende vijf dagen.

Protocol

Muis weefsel werd geoogst uit Sox2 ^EGFP reporter muizen ¹² onderhouden en gedood in overeenstemming met Canadian Council on Animal Care richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Het kweken Embryonale cochleae

1. Supplement Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) door mengen van 8,89 ml DMEM, 1 ml foetaal runderserum (FBS), 100 ui van 100x N2 supplement, en 10 ui 10 mg / ml ciprofloxacine. Supplement Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) door mengen 495 ml HBSS met 5 ml 100% HEPES.
2. Bereid glazen bodem cultuur gerechten:
   1. In een laminaire stroming kap, resuspendeer 200 gl basaalmembraan extract substraat in 5 ml DMEM. Bereid 35 mm diameter glazen bodem cultuur gerechten met 10 mm putten. Pipetteer 150 ul substraat / DMEM in het centrum van elke glazen bodem schotel. Deze gerechten kunnen worden gebruikt na 40 minuten incubatie, of kan worden opgeslagen in een CO ₂ Incubator bij 35 ° C gedurende ten minste een week.
      OPMERKING: Glazen bodem gerechten gebruikt om de volgende redenen: dat de bodem van de schaal is doorzichtig en geschikt voor beeldvorming, het creëren kuiltje in het midden van de schaal waarmee de explantaten te vestigen in een gemakkelijk gelegen stippellijn tenslotte zodat na een experiment van het monster kan worden verwerkt voor immunokleuring en daaropvolgende analyse.
3. Bereid de werkplek en hulpmiddelen:
   1. Zet de laminaire stroming schoon bankje, en spuit omlaag met 70% EtOH om een ​​schone werkruimte te creëren. Geniet forceps, lepels en een zwarte 184 siliconenelastomeer schotel (een mix van 184 siliconenelastomeer (10 delen), hardingsmiddel (1 deel) en houtskool poeder (2,5 g)) in 70% EtOH.
4. In de schone werkplek, oogst embryo's voor het experiment. Verzamel embryo van de juiste dracht in ijskoud HBSS aangevuld met 1% HEPES.
   1. Bepaal een externe of zichtbare orgaan dat zal aantonenreporter activiteit en onderzoekt de embryo met een fluorescentie stereomicroscoop. Verzamel de embryo's die reporter activiteit vertonen in ijskoud HBSS aangevuld met 1% HEPES aangezien dit het onderwerp van het experiment.
5. Verzamel rotsbeenderen:
   1. Snel te werken, met behulp van een koele lichtbron en fijne tang, het verzamelen van de hoofden van de pups. Zorg bij op de halswervels en onder de kaak om beschadiging van de temporale bot voorkomen.
   2. Open de schedel zorgvuldig. Verwijder de hersenen, trim van de voorkant van het hoofd, en breng de achterste schedel frisse koude HBSS ijs aangevuld met 1% HEPES in een schone schotel. Ontleden voorzichtig uit de pinda-vormige rotsbeenderen zorg aan het vestibulair systeem in tact te houden.
6. Ontleden de cochlea:
   1. Breng de rotsbeenderen een zwarte silicone elastomeer gecoate schaal in ijskoud HBSS aangevuld met 1% HEPES, pin het vestibulaire deel van het bot. Plaats insect pinnen opeen schuine hoeken om de temporale stabiliseren en creëren ruimte voor de forceps. Pinnen is een cruciale stap in het proces als de temporale bot te veel mag het zeer moeilijk om een ​​intacte slakkenhuis oogsten bewegen.
   2. Verwijder het kraakbeen rond het slakkenhuis zorgvuldig. Plaats een tand van de tang in het kraakbeen bij de buitenrand van de basis van de cochlea and clip een gat in het kraakbeen.
   3. Clip een flap opzij plaats de tand van de tang en voorzichtig scheiden het dak van het kanaal van het kraakbeen. Clip horizontaal over de bovenkant en de diagonaal, en til het voorste gedeelte van de capsule. Plaats een riek van de tang tussen de resterende kraakbeen en het kanaal en voorzichtig afknippen de laatste sectie. Het apicale oppervlak van de cochlea is nu bloot.
   4. Beginnend bij de basis, de vangst van het gebied waar het dak van het kanaal aan de cochleair epitheel en open het cochleaire kanaal. Haal voorzichtig uit het dak, trimmenindien nodig totdat het product volledig verwijderd. Snij alle delen van membraan links op de mediale zijde van het kanaal. Reinig het kanaal van overtollig mesenchymale weefsel en los het kanaal van het evenwichtsorgaan.
7. Cultuur de explants:
   1. Een explant, luminale oppervlak omhoog, in het centrum van een substraat gecoat glazen bodem cultuur schotel, zorgvuldig te trekken uit alle van de vloeistof en laat twee minuten. Voeg 150 ul aangevuld DMEM druppelsgewijs aan de explantatie, zorg niet te storen. Indien de explantatie vrij opdrijft, verplaatsen met een pincet, maar zorg dat het explantaat bezinkt naar de bodem van de schaal, zodat het kan hechten aan het substraat.
   2. Plaats de glazen bodem gerechten in een diepe 12 cm diameter petrischaal, een schaaltje steriel water vochtigheidsgraad te handhaven. Zet de kweken in een 35 ° C incubator gedurende de nacht zodat de explantatie te hechten aan het substraat en plat.

2. Levende Imaging

1. Selecteer explant monsters. Gebruik een fluorescerende stereomicroscoop om de toestand van elke geëxplanteerde cochlea evalueren. Selecteer alleen explants waar het kanaal is intact en aangesloten op het glas van de basis tot apex.
2. Stel de incubator bij 35 ° C met 5% _CO2 cultuur cochleaire weefsel. Zet de kweken in de incubator microscoop:
   1. Zuig zachtjes het aangevuld DMEM en te vervangen door ten minste 500 ul vers medium. Voor beeldvorming tot 6 dagen, 1-1,5 ml beter. Wanneer explantaten losjes gebonden, Pipetteer ring van media over de rand van de schotel. Deze extra vloeistof zal een miniatuur 'vochtige kamer' maken zonder verstoring van de explantatie tijdje te blijven hechten aan de matrix.
      1. Als alternatief gebruik scharnierende schotel dekt om de deksels te openen, terwijl de schotel blijft in de montage in de microscoop als reagentia nodig hebt tijdens intervallen tussen afbeelding collecties uit te wisselen. Scharnierende gerecht covers zodat de deksels te zijngeopend zonder verstoring van de monsters of het verwijderen van de gerechten uit hun instellingen. Dit houdt hun exacte positie voor volgende beeld vangt.
   2. Plaats de glazen bodem gerechten waarin passende monsters in de steekproef gerecht houder. De microscoop heeft in dit voorbeeld een roterend platform dat acht 35 mm monsterschaal houdt.
   3. Onder de laminaire stroming kap vervang de plastic deksels met glazen deksels en steek de gerechten in de schaal voor monsters houder. Het monster schaal houder binnen de couveuse zorg de explantaten niet los van de bodem van de schaal of de media verstoren.
3. Stel de imaging routine:
   1. Schakel de microscoop, UV-lamp en camera en open de beeldbewerkingssoftware.
   2. Zoek de monsters, kies een beeldgebied, vliegtuig van focus en aanpassen van belichting tijden voor elk gerecht in de juiste volgorde. Kies het vlak van aandacht afhankelijk niet alleen van het uitzicht op de explant ten tijde van de start, maar aldus rekening houdend met de manier waarop het weefsel zal bewegen en hoe lang het tijdsverloop zal lopen.
   3. Stel een Z-stack centreren rond de gekozen focal plane in de fluorescentie-kanaal. De frequentie en duur van de bemonstering voor het experiment. De frequentie wordt beperkt door de tijd die nodig is om beelden te verzamelen, zodat dit moet worden bepaald na het selecteren gezichtsveld en waarbij een Z-stack. In dit geval vindt bemonstering plaats iedere 30 minuten gedurende vijf dagen. De duur van het experiment kan tot 14 dagen.
4. Genereer een film:
   1. Aan het einde van de time lapse periode open de beeldbestanden. In dit geval Metamorph software die sequentiële inzamelpunten opent wordt gebruikt. Frame voor frame kies de beste focal plane voor het tonen van de betrokken celpopulatie.
   2. Deze beelden converteren naar een .avi-bestand, of ze te exporteren als een montage van een set van beelden die kunnen worden geopend en geanalyseerd in beeldverwerking software of omgezet naar meerdere forma genererents met behulp van video processing software.

Resultaten

Hier laten we een montage (figuur 1) en een film (figuur 2) tonen hoe een typische organotypische cochleair explantatie groeien als uitgeplaat op E13.5. Een Sox2 reporter muis werd gebruikt om de prosensory regio visualiseren. De film illustreert dat de cochlea ondergaat groei en convergentie en uitbreiding, hebben de cellen in het laterale gebied van de groene Sox2 domein niet te verdelen als het weefsel rondom het uitzet. Dit is een kenmerk van het orgaan van Corti; ...

Discussie

Er zijn een aantal technische punten om te overwegen wanneer culturen worden vastgesteld en bij het opzetten van de time-lapse microscoop om voor de lange termijn beeldvorming.

We gebruiken basaalmembraan matrix als een substraat voor het kweken cochleaire explantaten, maar de ondergrond moet worden afgestemd op het celtype. Om bijvoorbeeld het neuronale culturen, kan het beter zijn om een ​​fibronectine bekleding. Incubatie temperatuur en gassamenstelling moet ook worden gekozen op basis va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle media	Gibco	12430	Meerdere merken produceren dit
Basement membrane extract	Corning	354230	Matrigel. Alternatieve vergelijkbare producten zijn verkrijgbaar bij andere leveranciers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29
Fetaal bovien serum	Gibco	16000044	Meerdere merken produceren dit http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
HEPES	Gibco	5630080	Meerdere merken produceren dit http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
100 x N2 supplement	Gibco	17502-048	Meerdere merken produceren dit http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850-5G-F	Meerdere merken produceren dit http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA
Hank's balanced salt solution	Gibco	14170161	Meerdere merken produceren dit. Moet voor gebruik worden gekoeld. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Fine Forceps	Fine Science tools	11254-20	Maat nummer 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
Curette	Fine Science Tools	10080-05	maat 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Insect Pins	Fine Science Tools	26001-35	Moet roestvrij staal zijn http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
50 mm plastic schalen	Corning/Falcon	351006	Meerdere merken produceren dit
houtskool	Sigma Aldrich	05105-250G	Meerdere merken produceren vergelijkbare items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA
184 silicone elastomer	Dow/Corning	SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Schalen worden enkele weken van tevoren zelf gemaakt. Silicone elastomer kan van elke leverancier zijn.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C	De afmetingen van de schotel worden bepaald door de specificaties van het beeldvormingssysteem.  35 mm diameter, 10 mm put, nummer 0 dekglas past op Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2
Stereomicroscoop	Zeiss	495101-9804-000	Stemi 2000 model. meerdere merken produceren vergelijkbare items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Cold Light Source	Zeiss	000000-1063-182	Meerdere merken produceren vergelijkbare items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Fluorescent Stereomicroscope	Leica microsystems	Contact Leica microsystems	Leica M165-FC. Meerdere merken produceren vergelijkbare items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Incubator Microscope +imaging software	Olympus	Contact Olympus	Inverted microcope afgesloten binnen een Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscoop met eigen Metamorpoh beeldvormingssoftware. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Clean bench	Thermo Scientific	51029701	Meerdere merken produceren vergelijkbare items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
CO2 incubator	Thermo Scientific	3310	Meerdere merken produceren vergelijkbare items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Laminar Flow hood	Thermo Scientific	51026651	Meerdere merken produceren vergelijkbare items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html