A Novel In vitro Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

Samenvatting

De toegankelijkheid van betrouwbare modellen om vasculaire bloedinteracties bij mensen te onderzoeken ontbreekt. We presenteren een in vitro model van gekweekte primaire humane endotheelcellen gecombineerd met menselijk volbloed om cellulaire interacties zowel in het bloed (ELISA) als in het vasculaire compartiment (microscopie) te onderzoeken.

Samenvatting

De meerderheid van deze ziekten gepaard gaan met aandoeningen van het cardiovasculaire systeem. Studies naar de complexiteit van de interactie responsen tijdens cardiovasculaire pathologieën geactiveerd worden echter beperkt door het gebrek aan sterke en fysiologisch relevante methoden. Om modelleren pathologische vasculaire gebeurtenissen hebben we een in vitro assay voor het bestuderen van de interactie tussen endotheel en volbloed ontwikkeld. De test bestaat uit primaire humane endotheelcellen, die in contact met menselijk volledig bloed worden geplaatst. De werkwijze gebruikt natieve bloed geen of zeer weinig anticoagulans, waardoor onderzoek delicate interacties tussen moleculaire en cellulaire componenten aanwezig in een bloedvat.

We onderzochten functionaliteit van de test door het vergelijken coagulatie door verschillende volumes bloed geïncubeerd met of zonder menselijke navelstreng endotheel cellen (HUVEC). Overwegende dat een groter bloedvolume bijgedragen aaneen toename van de vorming van trombine antitrombine (TAT) complexen, aanwezig HUVEC resulteerde in verminderde coagulatie. Bovendien pasten wij beeldanalyse van leukocyt hechting aan HUVEC gestimuleerd met tumornecrosefactor (TNFa) en vond de aanwezigheid van CD16 ⁺ cellen significant hoger op TNFa gestimuleerde cellen in vergelijking met niet-gestimuleerde cellen na contact met bloed zijn. Concluderend kan de assay worden toegepast op vasculaire pathologieën, waarbij interacties tussen het endotheel en het bloedcompartiment worden verstoord bestuderen.

Inleiding

Methoden voor het analyseren van bloed-vasculaire interacties in hart-en vaatziekten in het algemeen onderzoek dierproeven te betrekken. Resultaten die in experimenteel onderzoek diermodellen kunnen echter weinig of geen gevolgen voor de menselijke ziekte. ^1,2 Zodoende is er behoefte aan goede en betrouwbare in vitro modellen cellulaire interacties tussen het bloedcompartiment en vasculaire endotheelcellen in onderzoeken een humaan-achtig systeem. We hebben hiertoe een systeem van bloed endotheelcellen kamermodel. Deze is gebaseerd op een eerder beschreven model gebruikt om de interacties tussen biomaterialen en humaan totaal bloed onderzoeken. ³ tegenstelling tot andere in vitro opstellingen waar gewoonlijk beperkt aantal gezuiverde componenten, dwz trombocyten, leukocyten of endotheelcellen zijn, de onderhavige model omvat alle de bestanddelen van een bloedvat.

De opzet van het bloed endotheliale cell kamermodel is ontworpen om het gebruik van vers getrokken menselijk bloed met weinig of geen toegevoegde antistollingsmiddel in te schakelen. Bloed opgeslagen tijdens langere perioden verwerven zogenaamde storage laesies waar afbraak van erytrocyten kan interfereren met delicate interacties tussen bloed en endotheelcellen. ⁴

Om stolselvorming tijdens hanteren van bloed ex vivo voorkomen vereist bij hoge doses anticoagulantia of dat al het materiaal in contact met bloed niet-activerende zijn. Als niet-activerende oppervlakken zijn zeldzaam in de laboratoriumomgeving, kunnen materialen ook worden uitgerust met een beschermende laag van geïmmobiliseerde heparine. Een beschermende laag van geïmmobiliseerde heparine (hierna Corline heparine oppervlak (CHS)) die kunnen worden toegepast op de meeste materialen waardoor een oppervlak waar bloedcontact kunnen optreden zonder dat een activering van de stollingscascade. ⁵ Aldus, door de inrichting van de kamers met CHS, het bloed endotheliale cell kamermodel maakt gebruik van zeer lage concentraties van antistollingsmiddel in het bloed. Het vermijden van de toevoeging van hoge concentraties van antistollingsmiddel in het bloed endotheliale kamer model kunnen gevoelige interacties binnen een bloedvat die anders gemaskeerd bestuderen. ⁶

Het bloed endotheliale celkamer model bestaat uit twee kamers gevormd door toevoeging van plastic cylinders (hoogte: 8 mm, radius: 9 mm) op een kunststof microscoopglaasje. De randen naar boven op de cilinders zijn voorzien van groeven die zijn voorzien van rubberen O-ringen voor het afdichten van de kamers tegen de celkweek dia. De kamers worden slechts gedeeltelijk gevuld met bloed de lucht in de kamer blijft bloed in beweging wanneer de kamers vervolgens in een verticale positie (figuur 1) wordt geroteerd.

Om de functionaliteit van het model te evalueren, voerden we experimenten met hetzij een volledig CHS gecoatkamer of humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Twee afzonderlijke volumes bloed werden getest en de vorming van trombine antitrombine (TAT) complexen (indirecte marker van coagulatie) werd bepaald met enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Vervolgens hebben we onderzocht het effect van bloedvolume en tumor necrosis factor (TNFa) gestimuleerde endotheelcellen leukocyt rekrutering door beeldanalyse.

Figuur 1. Instellen van het bloed van endotheelcellen kamermodel. (A) Bovenaanzicht schematische tekening van het bloed kamer gemaakt in PMMA. (B) Primaire humane endotheelcellen zijn gekweekt op 1-goed kamer slides. Vers humaan totaal bloed twee kamers toegevoegd op een microscoopglaasje. De kamers en alle materialen die bij het hanteren van het bloed behandeld met een beschermende coating HS. Nadat de wanden van het cell cultuur schuif, worden de cellen geplaatst tegenover het bloed en het systeem wordt dichtgeklemd. (C) Het bloed endotheelcel kamers worden vervolgens geïncubeerd onder draaien bij 37 ° C. Daarna kunnen de reacties in het bloedcompartiment geanalyseerd door ELISA en de endotheelcellen kan worden geanalyseerd door microscopie.

Protocol

OPMERKING: Bloed werd van gezonde individuen door open systeem venapunctie in goedkeuring bij de Ethical Review Board in Uppsala (Permit No. 2008/264).

1. Zaaien Cellen

1. Cultuur primaire humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) bij 37 ° C in 5% _CO2 in T75 kolven bekleed met 1% gelatine in PBS pH 7,4.
2. Verwijderen kweekmedium een ​​T75 kolf die HUVEC (of andere soort primaire humane endotheelcellen) en was de cellen met 2,1 mM EDTA in PBS pH 7,4. Los cellen door toevoeging van 1 ml 0,25% trypsine-EDTA en incubatie gedurende 2 - 3 min bij 37 ° C.
3. Verzamel cellen door de kolf te spoelen met 9 ml 10% FBS in PBS pH 7,4 en breng de celsuspensie aan een 15 ml buis. Spin down de cellen bij 735 g gedurende 5 min.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet zorgvuldig endotheliale celgroei medium microvasculaire (EG GMMV) en tel de cellen in een Bürker kamer. Zaad 21.000 cel / cm ² in 1 putjes celkweek glijbanen en incubeer bij 37 ° C. De HUVEC wordt confluent na 1-2 dagen van de cultuur. Bewaken van de celmorfologie en confluentie dagelijks onder een lichtmicroscoop.

2. Voorbereiding van volbloed

1. Bereid alle kunstmatige oppervlakken die in contact komen met bloed met een dubbele laag geïmmobiliseerd heparine (CHS) volgens de instructies van de fabrikant. CHS beklede materialen stofdicht kunnen worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot 6 maanden zonder verlies van functie.
2. Gebruik open systeem venapunctie om bloed van een gezonde donor kort (<30 min) te tekenen voordat het bloed endotheliale kamer experiment. Koppel een injectienaald (18 G x 50 mm) om CHS gecoat siliconenslang (binnendiameter: 2 mm) vóór zorgvuldig verzamelen bloed in een CHS gecoat 50 ml tube. Supplement bloed met ongefractioneerde heparine tot een eindconcentratie van 0,75 IU / ml bereikt. Meng het bloed zachtjes door inverting de buis 2 - 3 keer.

3. Bloed endotheliale Chamber Model

1. Fabriceren bloed kamers (Figuur 1A; bovenaanzicht) in acryl polymethylmethacrylaat (PMMA), bestaande uit twee cilinders (hoogte 8 mm en radius 9 mm) die zijn gelijmd op een PMMA slide (25 x 75 mm). Breng de randen van de cilinders naar boven met rubberen O-ringen de bloedkamer dichten tegen de objectglaasjes met gekweekte endotheelcellen (Figuur 1B). Draai het bloed kamers verbonden met de cultuur dia met endotheelcellen vervolgens in verticale positie (figuur 1C).
2. Gebruik een CHS gecoat pipettip tot 1,5 ml bloed zetten in elk CHS gecoat kamer verzorgen het bloed niet te activeren.
3. Breng 1 ml bloed in microcentrifuge buisjes die 30 pl 0,34 MK ₃ EDTA tot een eindconcentratie van 10 mM K ₃ EDTA bereiken voor bepaling van initiële plasma eiwitconcentraties gebruikeen enzym gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Meng zorgvuldig het bloed en houdt de buizen op ijs.
4. Verwijder de plastic wanden van de celkweek objectglaasjes volgens de instructies van de fabrikant en zorgvuldig was de cellen in PBS pH 7,4. Zorg ervoor dat vervolgens zoveel vloeistof verwijderen mogelijk van de objectglaasjes. Laat de cellen uitdrogen.
5. Plaats het preparaat op de bloed kamers met cellen naar het bloed. Zet de schuif door het plaatsen van een klem om het bloed van endotheelcellen kamer. Een kunststof glijbaan voor aanvullende ondersteuning breuk van de celkweek objectglaasje te voorkomen bij het plaatsen van de klem.
6. Bevestig het bloed endotheelcel kamer op een roterend wiel (40 cm diameter) plaats in een 37 ° C waterbad. Draai elke kamer op het wiel bij 0,5 g gedurende 30 min.
7. Na incubatie, ontmantelen de bloed endotheelcellen kamer. Was de celcultuur slides in PBS pH 7,4 en bevestig de cellen in ijskoud 1% paraformaldehyde (PFA) fof 10 min. Breng 1 ml bloed uit elke kamer naar microcentrifuge buisjes met 30 pl 0,34 MK ₃ EDTA tot een eindconcentratie van 10 mM K ₃ EDTA bereiken en meng de buizen voorzichtig. Houd de buizen op ijs.
8. Centrifugeer de buizen bij 4560 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng het bloedplasma nieuwe microcentrifuge buizen en bewaar -70 ° C tot verdere analyse.

4. Analyse van Blood endotheliale Interacties

1. Voer immunofluorescente kleuring met muis anti-humaan CD16, gevolgd door secundaire geit anti-muis Alexa 488 en phalloidin-TexasRed. Voer elke stap kleuring gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en het wassen van de objectglaasjes in PBS pH 7,4 tussen elke stap. Tegenkleuring de kernen met DAPI gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Analyseer bloedcomponenten aan de endotheelcellen gebonden met behulp van fluorescentie microscopie in combinatie met beeldanalyse met behulp van geschikte software voor beeldanalyse zoals CellProfiler.
2. Quantify de reacties in het bloedcompartiment met trombine-antitrombine (TAT) ELISA volgens de instructies van de plasmamonsters fabrikant.
3. Gebruik geschikte statistische instrumenten, bijv., Een ongepaarde t-test, om de gegevens te analyseren.

Resultaten

De noodzaak van CHS Coating

Om reacties in volbloed specifiek zijn voor die opgewekt door de endotheelcellen gemeten, moeten alle voor bloed endotheliale celkamer materialen worden geleverd met een CHS coating voor gebruik. Figuur 2A (links) toont een onbekleed kamer na 30 min bloedcontact met een duidelijk zichtbare stolsel aanwezig. Behandelen van de kamer met CHS (Figuur 2A, rechts) daarentegen beschermt de bloed ongecontroleerde activering, zodat de resultaten door de endotheliale cel-interacties bloed.

Het effect van de Blood Volume in de Kamer

Coagulatie waarschijnlijker in stilstaand bloed de kans op interactie tussen geactiveerde stollingsfactoren verhoogd. In het bloed endotheelcel kamermodel wordt bloed in beweging gehouden door de circulatie van een luchtbel in de kamer. In oestellen het effect van veranderingen in het bloedvolume luchtbelgrootte bepalen, en dus ook, werd een CHS bekleed kamer verbonden met een CHS beklede glazen dia die werd getest met 1,5 ml of 1,75 ml bloed gedurende 30 min. Het volume van bloed zonder enige beweging van de luchtbel is 2,5 keer groter wanneer 1,75 ml bloed toegevoegd aan de kamer vergelijking met wanneer 1.5 ml van het bloed wordt gebruikt (figuur 2B). De gemeten TAT-waarden stelde verhoogd TAT-formatie met verhoogde bloedvolume (figuur 2D). Wanneer HUVEC (Figuur 2C) werden geïncubeerd met ofwel 1,5 of 1,75 ml volbloed werd geen verschil waargenomen tussen de twee groepen, wat suggereert dat endotheelcellen coagulatie (figuur 2D) kunnen moduleren.

Het effect van TNF op Bloedcel Werving en coagulatie

Om het effect van TNF op leukocyt rekrutering te onderzoeken, werden HUVEC traktatieed met 20 ng / ml TNFa 4 uur vóór bloedcontact. Bloedcontact - met ofwel 1,5 ml of 1,75 ml bloed - werd voortgezet gedurende 30 min waarna de kweek glaasjes werden gekleurd voor CD16 (Figuur 2F), afgebeeld en het aantal CD16 ⁺ cellen werd gekwantificeerd. De werving van CD16 ⁺ cellen significant toe met TNFa behandeling (figuur 2E) 100-256 CD16 ⁺ cellen / mm ² (p <0,0001) met 1,5 ml bloed en 172-378 (p <0,0001) met 1.75 ml bloed. De vorming van TAT complexen werd gemeten in de overeenkomstige plasmamonsters van het bloed geïncubeerd met ofwel TNFa behandelde of onbehandelde cellen (figuur 2G). TNFa gestimuleerde cellen induceerde ongeveer een verdubbeling van TAT complexen in vergelijking met onbehandelde cellen.

Vijgure 2: Functionaliteit van het bloed van endotheelcellen kamermodel. (A) Chambers met of zonder CHS werden geïncubeerd met volbloed. Zonder CHS, werd een stolsel gevormd na 30 min. Meting van trombine-antitrombine (TAT) complexen, een indirecte marker van stolling in het bloed geïncubeerd zonder CHS was> 6000 ug / ml. (B) Het volume van het bloed niet in beweging gehouden door de roterende luchtbel zal variëren met verschillende bloed volumes. Met de toevoeging van 1,5 ml bloed, dit volume 0,3 ml, dat het zal toenemen tot 0,74 ml onder toevoeging van 1,75 ml. (C) HUVEC afgebeeld met fasecontrastmicroscopie tonen kenmerkende endotheelcellen morfologie van een confluente monolaag vóór bloedcontact. (D) TAT waarden voor volledig CHS gecoate kamers tonen een klein verschil wanneer verschillende bloed volumes worden toegevoegd. De toevoeging van 1,5 ml bloed resulteerde in 35 ± 11 pg / ml (n = 7) in vergelijking met 1,75 ml, waardoor 8577; 70 ug / ml TAT (n = 8). Dit verschil is niet meer aanwezig als HUVEC worden geïncubeerd met dezelfde bloedvolume; 66 ± 55 pg / ml 1,5 ml (n = 5) en 66 ± 29 pg / ml 1,75 ml (n = 7). (E) Kwantificering van het aantal CD16 ⁺ cellen aanwezig op zowel gestimuleerde TNFa of gestimuleerde HUVEC na bloedcontact. Het aantal CD16 ⁺ cellen is aanzienlijk toegenomen met TNF gestimuleerde cellen geïncubeerd ofwel met 1,5 ml (basaal: 100 ± 40 cellen / mm; TNFa: 256 ± 121 cellen / mm) of 1,75 ml (basaal: 172 ± 67 cellen / mm; TNFa: 378 ± 185 cellen / mm) van volbloed (F) Vertegenwoordiger beelden van gestimuleerde en TNF gestimuleerde HUVEC gekleurd voor phalloidin (red), CD16 (groen) en DAPI (blauw).. Schaal bar = 250 urn (G) De vorming van TAT complexen ruwweg verdubbeld door TNFa gestimuleerde cellen in vergelijking met onbehandelde cellen geïncubeerd met bloed (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 maal meer TAT, n = 3; 1.75 ml: 1,7 ± 1,0 maal TAT, n = 4). Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaard deviatie; p-waarden werden berekend door de ongepaarde t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Meerdere interacties tussen bloed en vaatwand worden normaal gehouden in een rusttoestand door niet hechtende en antitrombotische aard van het endotheel. ⁷ tijdens pathologische aandoeningen waarbij ontsteking is het endotheel geactiveerd met een resulterende toename van hechting receptor expressie en ⁸ een verminderd vermogen om te remmen hemostase. ⁹ Activering van de cascade in het bloed beurt versterkt de trombogeniciteit van het endotheel waardoor verdere trombose en rekrutering van leukocyten. ¹⁰ Voor een beter begrip te krijgen van deze delicate interacties tussen endotheliale cellen en bloed, we ontwikkelde een nieuwe in vitro werkwijze waarbij gekweekte endotheelcellen in contact met bloed worden geplaatst. Voor zover wij weten ons setup eerste endotheelcellen volledig menselijk bloed met geen of zeer weinig antistollingsmiddel voor langere tijd.

nt "> De gevoeligheid van het systeem wordt ingeschakeld open systeem venapunctie in combinatie met een beschermende laag van geïmmobiliseerde heparine op alle oppervlakken in contact met bloed. Het gebruik van een open tijdens bloed verkrijgen vermindert de activering van de cascade systemen tijdens venapunctie terwijl die het gebruik van een zelf bepaalde hoeveelheid anticoagulant. handel verkrijgbare geëvacueerd bloed buizen kunnen echter worden gebruikt, afhankelijk van het beoogde eindpunt van de studie. De eindconcentratie van anticoagulans toegevoegd meeste commercieel beschikbare gesloten systeem buizen kunnen gevoelig remmen en anders moeilijk te bestuderen, interacties in de setup. ⁶ een beschermende heparine oppervlak voorkomt verdere activering van bloed door oppervlaktecontact door anderen dan de endotheelcellen oppervlakken. ⁵ inderdaad incubatie van bloed aangevuld met een kleine hoeveelheid ongefractioneerde heparine kamer zonder de bescherming van CHS gevolg stolselvorming.

De luchtbel in de kamer maakt het mengen van het bloed tijdens incubatie met de endotheelcellen. Om het effect van de omvang luchtbel beoordelen, gebruikten we twee verschillende bloedvolume. In dit model, maten we vergelijkbare TAT niveaus ongeacht luchtbelgrootte in kamers geïncubeerd met HUVEC. TAT werd echter verhoogd met een kleine luchtbel grootte in de volledig CHS behandelde kamers. Dit, overeenkomstig de eerder beschreven endotheliale cellen te ¹¹ geeft een regulerend effect op de verhoogde activering van de stolling door de endotheliale cellen die ontbreekt in de inerte CHS kamer. De luchtbel in het systeem een ​​stroom bij rotatie van de kamer. De grootte van de bel invloed krachten in dit draaisysteem. Dit blijkt uit onze resultaten in figuur 2D waren een kleinere bubbel creëert hogere TAT waarden die een verminderde werking na het bloed dwz, het bloed bewegingbinnen de kamer lager en daardoor activering van de cascade systeem optreedt in hogere mate. Opgemerkt zij dat in dit systeem creëren we een roterende stroming die verschillende snelheid wordt in de kamer met de hoogste snelheid langs de wanden en het laagste in het midden. Dit is duidelijk geen optimale milieu voor stroming en afschuifspanning voor endotheelcellen, maar hebben we een systeem produceert stabiele en reproduceerbare resultaten. Optimalere omstandigheden zou omvatten circulerende laminaire stroming in de afwezigheid van turbulentie. Dit is echter niet mogelijk het model vertegenwoordigd hier en onze kennis dergelijk systeem niet bijgewerkt. Hoewel er verschillende microfluïdische systemen commercieel beschikbaar die onmogelijk te combineren met volbloed met geen of lage anticoagulans toegevoegd aan het systeem daardoor niet goed gevoelige beoordeling van de interactie mogelijk tussen alle componenten aanwezig in bloed en endotheelcellen.

Verder is er een 2-voudige toename rekrutering van bloedcellen naar TNFa geactiveerde HUVEC in combinatie met een verdubbelde vorming van TAT onafhankelijk van het bloedvolume. Dit verifieert stabiliteit van het modelsysteem en toont ook de mogelijkheid om een ​​geactiveerd endotheel in combinatie met volbloed. Toekomst op het bloed endotheelcel kamer worden gebruikt bloedcellen rekrutering naar geactiveerde endotheelcellen onderzocht door een verscheidenheid van merkers uitgedrukt op cellen onder verschillende omstandigheden en fasen van activatie. Verder kan het model worden gebruikt in combinatie met farmacologische middelen om de effecten van inflammatoire te evalueren.

Samengevat, laten we het grote voordeel van het combineren van een kamer model met menselijk bloed en vasculaire cellen volledig menselijke in vitro systeem om relevante onderzoeken van vaatziekten met uitgevonden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)	PromoCell	C-12200	Elke andere vorm van primaire humane endotheelcellen mag worden gebruikt.
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)	PromoCell	C-22120
Gelatin	Sigma-Aldrich	G-2500	Bereid 1% gelatine in PBS, incubeer 5 ml in een T75 gedurende 15 minuten en verwijder voor het kweken van cellen.
TAT ELISA	Enzyme Research Lab.	TAT-EIA-C
Mouse anti-human CD16	DAKO	F7011	Verdunning 1:100
Goat anti-mouse Alexa 488	Molecular Probes	A11001	Verdunning 1:500
Phalloidin-Texas Red	Molecular Probes	A22287	Verdunning 1:200
DAPI	Molecular Probes	D1306	Verdunning 10 μg/ml
EDTA	Sigma	E-6758
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437
1 well cell culture slides	BD Falcon	354101
Blood Chambers	NA	NA	Blood Chamber kan worden vervaardigd in PMMA of een andere kunststof die in staat is om CHS te binden
Clamps	Office Depot	2052204
Corline Heparin Surface (CHS)	Corline Systems AB	945-00
Hypodermic needle	Terumo	NN-1850R	Grootte: 18 G x 5 mm
Unfractionated Heparin (UFH)	Leo Pharma	585679
K3EDTA	Alfa Aesar	1709958	Bereid een 0.34 M stamoplossing in milliQ H2O
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
Fluorescence microscope	Nikon	80i
Light microscope	Nikon	TS100
Image analysis software	Broad Institute	CellProfiler	Beschikbaar gratis op www.cellprofiler.org