Methodenartikel

Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA A Receptoren

19.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52115

⸱

14 november 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCL School of Pharmacy, University College London

In dit artikel

Samenvatting

De moleculaire mechanismen die de coördinatie van de vorming van remmende GABA-erge synapsen tijdens ontogenie zijn grotendeels onbekend. Om deze processen te onderzoeken, hebben we een co-cultuurmodel systeem dat embryonale medium stekelige GABAerge neuronen samen gekweekt met stabiel getransfecteerde humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen die functionele GABAA-receptoren omvat ontwikkeld.

Samenvatting

Remmende neuronen werken in het centrale zenuwstelsel om de dynamiek en ruimte-tijdelijke coördinatie van neuronale netwerken te reguleren. GABA (γ-aminoboterzuur) is het overheersende remmende neurotransmitter in de hersenen. Het wordt vrijgegeven vanuit de presynaptische uiteinden van remmende neuronen binnen zeer gespecialiseerde intercellulaire verbindingen, bekend als synapsen, waar het zich bindt aan GABAA receptoren (GABAARs) aanwezig op het plasmamembraan van de synaps-ontvangende, postsynaptische neuronen. Activering van deze GABA-geregen ionenkanalen leidt tot een instroom van chloride, wat resulteert in postsynaptische potentiaalveranderingen die de kans verminderen dat deze neuronen actiepotentialen zullen genereren.

Tijdens de ontwikkeling hebben verschillende typen remmende neuronen met verschillende morfologische, elektrofysiologische en neurochemische kenmerken de mogelijkheid om hun doelneuronen te herkennen en synapsen te vormen die specifieke GABAARs subtypen bevatten. Dit principe van selectieve innervatie van neuronale doelen roept de vraag op hoe de juiste synaptische partners elkaar kunnen identificeren.

Om de onderliggende moleculaire mechanismen te verduidelijken, werd een nieuw in vitro co-cultuur modelsysteem opgezet, waarbij medium spiny GABAerge neuronen, een zeer homogene populatie neuronen geïsoleerd uit het embryonale striatum, werden gekweekt met stabiel getransfecteerde HEK293-cellijnen die verschillende GABAAR subtypen tot expressie brengen. Synapsen vormen zich snel, efficiënt en selectief in dit systeem, en zijn gemakkelijk toegankelijk voor kwantificering. Onze resultaten geven aan dat verschillende GABAAR subtypen verschillen in hun vermogen om synapsvorming te bevorderen, wat suggereert dat dit verminderde in vitro modelsysteem kan worden gebruikt om, althans gedeeltelijk, de in vivo condities te reproduceren die nodig zijn voor de herkenning van de juiste synaptische partners en vorming van specifieke synapsen. Hier worden eerst de protocollen voor het kweken van de medium spiny neuronen en het genereren van HEK293-cellijnen die GABAARs tot expressie brengen beschreven, gevolgd door gedetailleerde instructies over hoe deze twee celtypen in co-cultuur te combineren en de vorming van synaptische contacten te analyseren.

Inleiding

GABA is een van de oudste neurotransmitters in de embryonale hersenen, vóór de meest voorkomende excitatoire neurotransmitter glutamaat 1. Tijdens de ontwikkeling, GABA depolariseert en prikkelt onvolwassen neuronen spelen een belangrijke rol in de regulering van celproliferatie, migratie en vorming van neuronale netwerken zonder induceren excitotoxiciteit. In de volwassen hersenen, is de omkeringspotentiaal voor GABAA-receptor kanalen verschoven naar meer negatieve potentialen door een afname in de intracellulaire concentratie van chloride. Deze verschuiving wordt veroorzaakt door de up-regulatie van de kalium-chloride co-transporter (KCC2), die chloride transporteert uit de cel, en, in parallel, down-regulatie van de natrium-kalium-chloride transporter (NKCC1), die heeft het tegenovergestelde effect 2.

In de hersenen, GABA voornamelijk bindt aan zowel GABA A of B GABA receptoren snelle of langzame synaptische remming bemiddelen, respectievely. GABAA-Rs zijn een klasse van receptors ook bekend als heteropentamere ionotrope of ligand-gated Cys-lus ionkanalen. Twee moleculen van GABA zijn vereist voor de activering van de receptor, dat doorlaatbaar is voor chloride-ionen en in mindere mate, bicarbonaat ionen. De toename chloride conductantie vermindert de doeltreffendheid van depolariserende, prikkelende gebeurtenissen activeren het postsynaptische neuron 3.

Structurele diversiteit van GABA A Rs is al lang erkend als een belangrijke factor in het bepalen van hun breed scala aan functionele en farmacologische eigenschappen. Inheemse GABA A Rs zijn hetero-pentameren samengesteld uit subeenheden met meerdere isovormen ingedeeld: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π en θ 3, met een gemeenschappelijke transmembraan topologie omvattende een groot N-terminaal extracellulair domein, vier transmembraandomeinen (TM), en een grote intracellulaire domein van TM 3 en 4 4. Deβ3 en γ2 subeenheden zijn essentieel voor synaptische inhibitie en organisme overleven, omdat muizen met genetische verwijdering van deze subeenheden na de geboorte sterven 5,6. Daarentegen individuele isovormen van α subeenheid zijn belangrijk voor de functie van specifieke synaptische verbindingen in de hersenen geassocieerd met verschillende gedragingen zoals angst, sedatie, opwinding, en anderen, maar zijn niet individueel, essentieel voor het leven 7-9. GABAA-Rs zijn de belangrijkste plaatsen van werking voor verschillende geneesmiddelen met krachtige kalmerend, hypnotische, anxiolytische en anticonvulsieve effecten, zoals benzodiazepinen, barbituraten, neurosteroids en anesthetica 7,10,11.

Synaptische GABA A Rs bevatten typisch een γ2 subeenheid, twee β subeenheden (meestal β2 en β3) en twee α subeenheden (α1, α2, α3 of α5) 12,13. De overheersende klasse van extra-synaptische receptoren bevat de δ subunit in combinatietwee α subeenheden (α4 of α6) en twee β subeenheden (β2 of β3) 14. Subcellulaire lokalisatie van GABA A Rs tot de neuronen, dendrieten of soma, en insertie in de plasmamembraan zijn afhankelijk van de aanwezigheid van β-subeenheden 15,16. Echter, selectieve opname van verschillende GABA A R subtypes in verschillende typen synapsen goed correleert met de aanwezigheid van specifieke α subeenheden (α1, α2, α3 of α5) 7,17,18. Belangrijk deletie van α1 en α2 subeenheid van muizen veroorzaakt ultrastructurele veranderingen op remmende synapsen 19. Dit suggereert dat GABA RS zelf kan een directe rol spelen bij het ​​reguleren synapsvorming.

Aanwijzingen dat GABAerge synaps ontwikkeling een nauwkeurig gecoördineerd reeks gebeurtenissen, waarbij zowel de neuronale doelen gecontacteerd door verschillende soorten remmende axonen en de receptoren die piekt aanelke klasse van remmende synapsen zijn selectief en functioneel afgestemd 17,20-22. Dit fundamentele beginsel van specificiteit bij GABAergic synapsen werpt de vraag op hoe de pre- en postsynaptische partners herkennen elkaar tijdens de inleiding van synaptische contacten.

In vitro co-kweek tests met succes toegepast op sommige van de mechanismen van synapsvorming bestuderen en de rol van individuele synaptische spleet-spanning eiwitten testen in dit proces. Een van de gemeenschappelijke trans-synaptische interactie eiwit combinaties die bi-directioneel te synaps vorming en rijping bemiddelen functioneren, zijn de neurexins (Nrxns) en neuroligins (NLS). Nrxns zijn presynaptische eiwitten die alternatieve splicing vertonen in hun laminine-neurexin-geslachtshormoon bindend eiwit domeinen die tot verschillende isovormen 23. Terwijl de Nrxns ook interactie met andere eiwitten, zijn NLS gedacht om hun alomtegenwoordige postsynaptische pa zijnRTNERS 24. Samen vormen deze eiwitten bijdragen aan het vasthouden van de presynaptische en postsynaptische membranen in nauwe en rigide appositie 25. De twee meest voorkomende isovormen NL-1 en NL-2 die aanwezig prikkelende en remmende synapsen, respectievelijk 26 zijn. Een van de eerste co-cultuurmodel systemen, die trans-synaptisch eiwit interacties te onderzoeken, toegepast verschillende soorten niet-neuronale cellen, meestal onsterfelijke cellijnen zoals humane embryonale nier (HEK) 293-cellen tot overexpressie NL- 2. Wanneer deze cellen werden gekweekt met pontine neuronen, werd een accumulatie van presynaptische eiwitten in de nabijheid van het oppervlak van de HEK cellen waargenomen, wat aangeeft vorming van synapsen-achtige contacten. Toevoeging van oplosbaar β-neurexin deze co-kweken remde de vorming van contacten, suggereert dat trans-synaptische interacties tussen Nrxns en NLS nodig synaptische contact wordt 27 zijn. Bovendien transiënte expressievan β-neurexin in COS (C V-1 (mensaap) in O rigin, en het dragen van de S V40 genetisch materiaal) cellen samen gekweekt met gedissocieerde hippocampus Glu en GABA-erge neuronen geïnduceerde expressie van de postsynaptische eiwit gephryin en van GABA A R subeenheden γ2 en α2 bij raakpunten tussen deze twee cellen vormen 28. Een ander voorbeeld van een co-cultuurmodel gebruikt synapsvorming studie betrokken HEK293 cellen tijdelijk getransfecteerd met GABA A R subeenheden α2 / β3 / γ2 en NL-2, en een gemengde populatie van neuronen van de hypothalamus 29. De conclusie dat de expressie van NL-2 is een absolute vereiste voor de vorming van remmende synapsen.

Echter, in de laatste co-cultuur onderzoek stabiel getransfecteerd α1 / β2 / γ2 GABAA Rs in HEK293 cellen bleken voldoende functionele synapsen te induceren wanneer samen gekweekt met GABAerge medium stekelige neuronen, zonder extra trans-synaptische of postsynaptische adhesie-eiwitten. Echter, een belangrijke verhoging van synapsvorming en kracht waargenomen wanneer NL-2 werd co-expressie gebracht met GABAA-Rs 30. Dit geeft aan dat de co-cultuurmodel systeem heeft voordelen boven eerder beschreven modelsystemen, meest duidelijk een verhoogde gevoeligheid en betrouwbaarheid van synaptische contacten detectie. Twee belangrijke factoren die bijdragen aan de algehele verbetering in detectie van synaptische contacten: i) het gebruik van stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen met een hoge en consistente expressie van GABA A R subeenheden op het oppervlak van afzonderlijke cellen. Deze consistentie vergemakkelijkt kwantitatieve vergelijkingen tussen verschillende co-kweekomstandigheden. ii) Het gebruik van een zuivere populatie van GABAerge medium stekelige neuronen gekweekt uit de embryonale striatum 31 verwijdert complicaties en dubbelzinnigheden door het gebruik van gemengde neuronale populaties en allows bijvoorbeeld selectie van de meest geschikte postsynaptische GABA A R die kunnen worden vergeleken met elkaar tijdens synapsvorming.

Vorming van synapsen wordt dat vele trans-synaptische signalen in pre- en postsynaptische cel adhesie complexen omvatten. Door de bi-directionele aard van synaptische signalering en de enorme aantallen van celadhesie moleculen, is het moeilijk om belangrijke componenten betrokken bij synapsvorming identificeren. Aldus transfecteren van een cel adhesie eiwit in een niet-neuronale cellen (in dit geval, de twee meest voorkomende postsynaptische targets voor GABAergic medium stekelige neuronen in vivo, α1 / β2 / γ2 of α1 / β3 / γ2 GABA A R 32) sterk vermindert de complexiteit van trans-synaptische signalen beschikbaar bij de postsynaptische oppervlak en maakt een nauwkeurige kwantitatieve analyse van de werkzaamheid van dit eiwit bevorderen synapsvorming.

Protocol

Sprague-Dawley ratten of BAB / c inteelt muizen (Harlan, UK, het aantal drachtige vrouwtjes gebruikt was 30) werden gehuisvest en geofferd volgens Britse ministerie van Binnenlandse Zaken [en richtlijn Europese Gemeenschappen van 24 november 1986 (86/609 / EEG) ] richtlijnen. Het project werd formeel goedgekeurd door de UCL School of Pharmacy ethische commissie.

1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Medium, en Schotels

  1. Zet en reinig de laminaire stroming kap met 70% ethanol om te werken onder steriele omstandigheden bewaard.
  2. Bereid HEK293 celkweekmedium, bevattende Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium pH 7,4 (DMEM, 500 ml), L-glutamine (2 mM), penicilline (50 eenheden / ml), streptomycine (50 ug / ml) en foetaal runderserum (10 %).
    OPMERKING: penicilline en streptomycine zijn irriterend.
  3. Bereid de serumvrije neuronale kweekmedium bevattende Neurobasal medium pH 7,4 (500 ml), B27 supplement (25 ml), L-glutamine (2 mM), penicilline(50 eenheden / ml), streptomycine (50 ug / ml) en glucose (6 mM).
  4. Bereid 500 ml HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBSS), die HBSS 10x voorraad (50 ml), HEPES (1 M) (5 ml) en water (445 ml), pH 7,4.
  5. Autoclaaf met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4; 1 l), water (1 L), dekglaasjes (13 mm in diameter) en glazen Pasteur pipetten om ze te steriliseren.

2. Voorbereiding van HEK293- stabiele cellijn die α1 / β3 / γ2-GABA A Rs

  1. Plaat 2x10 6 HEK293 cellen in een 10 cm steriele weefselkweek plaat en incubeer bij 37 ° С in een bevochtigde 5% koolstofdioxide (CO2) atmosfeer (CO2 incubator) om 70-90% confluentie overnacht bereikt.
  2. De volgende dag, transfecteren HEK293 cellen met GABA A R α1 subeenheid cDNA in de PCDN 3.1 (+) expressievector waarin de G418 disulfaat (Tabel 1) resistentiegenen de GABA A R β3 subeenheid cDNA in de expressievector waarin de fleomycine D1 (Tabel 1) resistentiegen (zowel onder de regulatie van een humane cytomegalovirus immediate-early (CMV) promoter), met een kationisch liposoom formulering, die complexeert met negatief geladen nucleïnezuurmoleculen (Tabel 1) volgens het protocol van de fabrikant.
  3. Kort, voeg 500 ul gereduceerd serum medium (pH 7,4; tabel 1) en 7,5 pg van elk cDNA construct naar een steriele 15 ml centrifugebuis, gevolgd door 15 ui liposomale transfectie buffering reagens en meng voor vertrek bij kamertemperatuur 5 min.
  4. Aan dit mengsel, voeg 8.75 ui liposomale transfectie reagens en meng voor vertrek bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Vervolgens 3 ml HEK293 celkweekmedium (zonder antibiotica), pipetteer de inhoud van de centrifugebuis en neer tweemaal over druppelsgewijs op de cellen groeien in een 10 cm weefselkweek schotel en incubeer gedurende 48 uur bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator).
  5. Was de HEK293 cellen voorzichtig met steriel PBS, pH 7,4, en verdun de getransfecteerde HEK293 cellen in nieuwe 10 cm weefselkweekplaten in de volgende verhoudingen: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 en 1:20. Dit zorgt ervoor dat de cellen niet overdreven confluent worden.
  6. Begin selectie van de HEK293 cellen die zowel GABA A R subeenheden door toevoeging van 800 ug / ml van elk antibioticum selectiemerker, G418 en fleomycine D1, aan het kweekmedium. Incubeer de cellen bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator) en vervang het antibioticum bevattend medium (10 ml) om de 2 dagen.
  7. Als kleine witte kolonies beginnen te vormen (gewoonlijk na ongeveer 7 dagen), een zorgvuldige selectie van enkele kolonie van elk van de gerechten en verzamelen met behulp van een steriele P1000pipet tip. Overbrengen naar een putje van een 24-well weefselkweek platen die 500 pl medium en resuspendeer zorgvuldig pipetteren het medium op en neer. Ervoor te zorgen dat precies een kolonie wordt overgebracht in elk putje (in totaal 5-20 kolonies wordt geadviseerd). Incubeer de cellen bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator) en vervang het antibioticum bevattend medium elke 2 dagen.
  8. Nadat de kolonies worden 70-80% confluent voorzichtig pipet het medium op en neer om de cellen los van de bodem van de 24-well weefselkweek platen. Transfer en verdeel de suspensie van cellen tussen 2 putten in een 6-well weefselkweek plaat. Incubeer de cellen bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator) en vervang het antibioticum bevattend medium elke 2 dagen.
  9. Zodra 70-80% confluent, verzamel de cellen van 1 van de 2 putjes die de cellen binnen hetzelfde dubbele punty en bereiden eiwitlysaten. Kort samengevat, was de cellen 2x met PBS, pH 7,4, en voeg 200 ul van 2% natriumdodecylsulfaat (SDS) in PBS, pH 7.4. Verzamel het lysaat en overbrengen naar de microcentrifugebuis. Meet de eiwitconcentratie met BCA eiwit reagens (zie tabel 1) volgens het protocol van de fabrikant. Analyseer de expressie van α1 en β3 subeenheden van GABAA-receptoren door SDS / PAGE en immunoblotting met subeenheid-specifieke antilichamen (konijn anti-α1-specifieke en konijnen anti-β3-specifieke GABA A R antilichamen, zie Tabel 1 voor de informatie op deze antilichamen).
  10. Los en alleen overdragen positieve klonen uit de resterende putjes grotere 6 cm weefselkweekschalen. Incubeer de cellen bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator) en vervang het antibioticum bevattend medium elke 2 dagen.
  11. Geleidelijk uitbreiden van de kolonies van cellen under het antibioticum selectie door ze op 10 cm weefselkweek gerechten en ten slotte naar weefselkweekflessen (T-75 flessen). Incubeer de cellen bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator) en vervang het antibioticum bevattend medium elke 2 dagen.
  12. Plaat 70.000 cellen uit elke kolonie op glazen dekglaasjes (13 mm in diameter) en bevestig de cellen naar het celoppervlak expressie en co-localisatie van GABA A R subeenheden geanalyseerd door immunofluorescentie.
  13. Selecteer de positieve kloon van HEK293-cellen die hoge niveaus van zowel α1 en β3 subeenheden van GABA A-receptoren, plaat 2 x 10 6 cellen in een 10 cm steriele kweekschaal en incubeer bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer ( CO 2 incubator) 's nachts. Zorg dat de cellen worden geïncubeerd in antibioticum bevattende (G418 en fleomycine D1) medium allen tijde.
  14. De volgende dag, transfecteren HEK293-cellen met GABA A R γ2s subeenheid cDNA in de pcDNA ™ 3.1 (+) expressievector waarin hygromycine B resistentie gen met een niet liposomale lipide transfectie reagens (Tabel 1).
    LET OP: Deze transfectie methode zorgt voor een betere overleving en hogere expressie efficiëntie van vreemde eiwitten in langzaam groeiende stabiele cellijnen die onder continue selectie met antibiotica.
  15. In een steriele 15 ml centrifugebuis, voeg 250 pl Enhancer en DNA condensatie buffer (Tabel 1) en 1,4 ug γ2s GABA receptor subeenheid cDNA. Voeg 11,2 ul Enhancer en vortex gedurende 1 seconde voor het verlaten bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  16. Voeg 35 ul van niet-liposomale lipide transfectie reagens en vortex gedurende 10 seconden voor het verlaten bij kamertemperatuur gedurende 10 min. 3 ml G418 / fleomycine D1-bevattend medium en pipetteer de inhoud van de centrifugebuis en twee keer beferts te dragen druppelsgewijs op de cellen groeien in een 10 cm weefselkweek plaat. Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator).
  17. Was de cellen zachtjes met steriele PBS en verdund ze in nieuwe 10 cm weefselkweekplaten in de volgende verhoudingen: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 en 1:20.
  18. Begin selectie van α1 / β3-HEK293 cellen die de γ2s subeenheid door toevoeging van 800 ug / ml antibiotische selectiemerker hygromycine B aan de G418 / fleomycine D1-bevattend medium. Vervang het medium met vers G418 / fleomycine D1 / hygromycine B-bevattend medium (10 ml) om de 2 dagen.
  19. Herhaal stap 2,7-2,12, onder continue selectie in G418 / fleomycine D1 / Hygromycine B-bevattend celcultuurmedium.
  20. Bewaar de positieve klonen bij -140 ° C in antibiotica-vrij celkweekmedium en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) voor het toekomstig gebruik.
  21. Test het niveauexpressie van α1, β3 en γ2s GABA A R subeenheden door immunoblotting en immunofluorescentie in elke kloon na ontdooien, omdat de expressie veranderen door verminderde overleving van cellen onder antibiotische selectie.

3. Onderhoud van HEK293 cellijnen

  1. Ontdooien een flesje control HEK293 cellen of deze die ofwel α1 / β2 / γ2 GABA A-Rs (tabel 1) of α1 / β3 / γ2-GABA A R (hierboven beschreven) in 10 ml celkweekmedium in een 15 ml steriele centrifugebuis. Centrifugeer bij 440 xg gedurende 5 minuten om overmaat DMSO te verwijderen.
  2. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml vers celkweekmedium.
  3. Voeg eerst 9 ml vers celkweekmedium een ​​10 cm weefselkweekschaal bekleed met poly-D-lysine (0,1 mg / ml) en vervolgens 1 ml geresuspendeerde cellen. Schud voorzichtig side-to-side, om de cellen te dispergeren en incubeer bij 37 ° С in een bevochtigde5% CO 2 atmosfeer (CO 2 incubator).
  4. De volgende dag, zuig het medium elke celresten te verwijderen en te vervangen door 10 ml vers HEK293 celkweekmedium.
  5. Selecteer stabiele cellijnen met antibiotica om alle cellen die niet GABA A R-subeenheden tot expressie brengen en dus ook niet de uitdrukking van antibiotica resistentie markers verwijderen. Voor de α1 / β2 / γ2 stabiele cellijn vervangen middendruk vers celkweekmedium bevattende G418 (800 ug / ml). Voor de α1 / β3 / γ2 cellijn, te vervangen door vers kweekmedium bevat G418 (800 ug / ml), fleomycine D1 (800 ug / ml) en hygromycine B (800 ug / ml). LET G418 is een irriterend Hygromycine B is corrosief, giftig en irriterend.
  6. Passage de cellen in een nieuw weefselkweekschaal door enten op een lagere dichtheid verworven wanneer> 70% confluentie. Zuig 10 ml celcultuurmedium en was twee keer kort metPBS, pH 7.4. Voeg 1 ml trypsine-EDTA-oplossing, een oplossing van de protease trypsine (0,05% trypsine) en Ca2 + chelator EDTA (0,02%) in PBS, pH 7,4, om de cellen van de schaal los. LET trypsine-EDTA oplossing is een irriterende stof.
  7. Voeg 10 ml celkweek medium dat de juiste antibiotica, de schaal en zuig de cellen. Centrifugeer de cellen bij 440 g gedurende 5 minuten en resuspendeer ze in 5 ml van het celkweekmedium.
  8. Passage de cellen met een 1:10 verdunning in een nieuw weefselkweek kolf (T-75 fles) met vers celkweekmedium en de juiste antibiotica. Incubeer de cellen bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator) en vervang het medium elke twee dagen. Passage van de cellen bij> 70% samenvloeiing (zie stap 2.8).

4. Voorbereiding van GABAergische Medium doornig Neuron Cultuur

  1. Onder steriele omstandigheden voor te bereiden van een 24-well plaat met poly-L-lysine (0,1 mg / ml) -gecoate dekglaasjes (13 mm in diameter) en incubeer bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator).
  2. De volgende dag, aspireren met een pipet de overmaat poly-L-lysine en wassen dekglaasjes met twee korte 10 sec en twee 5 min lang wassingen met steriel water. Laminine (0,01 mg / ml) toe en incubeer overnacht bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator).
  3. Ontsmetten de dissectie met 70% ethanol en het verzamelen van een reeks ontleden instrumenten zoals gebogen en rechte weefsel forceps, scharen en pincetten, en plaats in 70% ethanol tot het ontleden instrumenten volledig steriliseren.
  4. Plaats de zwangere rat / muis gedood met CO 2 op zijn rug en het reinigen van de huid op de buik met 70% ethanol. Knijp de huid met een pincet en snijd rond de buik door de huid, de spieren en het buikvlies, naar de inwendige organen en de baarmoeder te onthullenmet embryo's duidelijk. Extraheer het embryo (E16-17) van de baarmoeder en plaats ze in een petrischaal met gekoelde PBS.
  5. Plaats de embryo's in de laminaire stroming kap en onthoofden hen, het verzamelen van de koppen in een nieuwe petrischaal met gekoelde HBSS.
  6. Onder een microscoop ontleden, ontleden de hersenen met behulp van de gebogen en rechte tang. Plaats de hersenen naar een nieuwe petrischaal met koud HBSS.
  7. Scheid de twee hersenhelften en de hersenvliezen verwijder voorzichtig. Knip langs de lijn van de hippocampus en schil terug de cortex naar het striatum te onthullen. Observeer het striatum als een gegroefde witte structuur op de voorste van de halve bol.
  8. Prepareer het striatum en snijd het in kleine stukjes (1-2 mm in diameter) en gebruik een vuur gepolijste Pasteur pipet om het materiaal te verzamelen in een steriele 15 ml centrifugebuis met een totaal volume van 1 ml. Brand-polijsten zorgt voor het materiaal wordt verzameld zonder schade.
  9. Met behulp van de brand gepolijst tip van het Pasteur pipet, zuigen de cellen en laat ze 8-10 keer. Waarbij een nieuwe pipet met open polish punt van ongeveer 30% van zijn oorspronkelijke diameter (1 mm), vermaal de oplossing nog eens 4-6 keer totdat het er homogeen.
  10. Filter de cellen met behulp van een 100 um nylon cel zeef in een verse steriele centrifugebuis.
  11. Tel de cellen met een hemocytometer en plaat 70.000 cellen in 500 pi van neuronale kweekmedium per putje in een 24-well weefselkweek platen. Schud de putjes links naar rechts en incubeer bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator) gedurende 14 dagen in vitro (DIV).
  12. Na 7 dagen Controleer de zuiverheid van neuronale kweken en indien glia cellen aanwezig zijn, voeg cytosine β-D-arabinoside (Ara-C, 5 uM) aan de putjes om hun proliferatie te stoppen. Om dit te doen, verwijder 250 ul van neuronale kweekmedium (pH 7,4) uit elk putje en voeg 250 ul vers medium bevattening Ara-C. LET OP! Ara-C is een irriterende stof.

5. Co-cultuur Voorbereiding

  1. Op dag 11 van neuronale cultuur, laag een 6-wells plaat met poly-D-lysine (0,1 mg / ml) onder steriele omstandigheden en incubeer overnacht bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator).
  2. De volgende dag (dag 12 van neuronale cultuur), zuig het overtollige poly-D-lysine en wassen putten 2x kort 2x gedurende 5 minuten met steriel water voor het toevoegen van vers kweekmedium (zonder antibiotica) het bekleden van de putjes met een kleine hoeveelheid van serum uit het medium.
  3. Zuig het kweekmedium van de weefselkweekfles (T-75). Spoel de cellen tweemaal met PBS voor het toevoegen van 1 ml van Ca2 + / Mg2 + chelerende middel EDTA (0,48 mM), die zacht en niet-enzymatisch dissocieert cellen. Schud de cellen om ze los van de bodem van de kolf weefsel.
  4. Voeg 10 ml van de celcultuur medium (zonder antibiotica omdat dit kan interfereren met transfectie), zuigen de cellen en plaats in een steriele centrifugebuis. Pellet cellen op 440 xg gedurende 5 minuten met behulp van een low-speed bench-top centrifuge.
  5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml vers celkweekmedium. Met behulp van een hemocytometer, tellen de cellen en plaat bij een dichtheid van 3 x 10 5 cellen per putje in een 6-wells plaat. Schud zachtjes en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator).
  6. De volgende dag (dag 13 van neuronale cultuur) kortstondig transfecteren de HEK293 cellen met mCherry cDNA in pcDNA3 expressieconstructie behulp liposomaal transfectiereagens. Kort samengevat, in een steriele microcentrifugebuis, voeg 500 ul gereduceerd serum medium en 5 ug mCherry cDNA. Voeg 5 ul van liposomale buffering reagens en meng voor vertrek bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  7. Voeg 8,75 ul van liposomaal transfectie Reagent en meng voor vertrek bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Pipetteer de inhoud van microcentrifugebuis en neer tweemaal overdracht druppelsgewijs aan elk putje van de 6-well weefselkweek plaat en incubeer bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator).
  8. De volgende dag (dag 14 van neuronale cultuur), zuigen de HEK293 cel kweekmedium uit elk van de 6-putjes en spoel elk putje tweemaal kort met PBS (pH 7,4). Voeg 300 ul van Ca2 + / Mg2 + chelerende middel EDTA (0,48 mM) en 200 ul van trypsine-EDTA (0,02-0,48 mM) oplossing aan elk putje en incubeer bij 37 ° С gedurende 5 min.
  9. Voeg 1 ml vers HEK293 celkweekmedium per putje (dit dooft het trypsine) en zuig de losgemaakte cellen in een steriele 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer de cellen bij 440 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 500 pi van neuronale kweekmedium (pH 7,4).
  10. Met behulp van een hemocytometer, tellen de cellen en zaad bij een dichtheid van 30.000 cellen per putje in een 24-well weefselkweek platen bevattende neuronen. Schud de plaat om de cellen te dispergeren en incubeer co-kweken bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator) gedurende 24 uur.

6. Analyse van synaptische contacten en hun activiteit

  1. Na 23 uur in co-cultuur onderzoeken de vorming van "actieve" contacten tussen GABAergic medium stekelige neuronen en HEK293 cellen met activiteit-afhankelijke opname van anti-synaptotagmin luminale domein-specifiek antilichaam geconjugeerd met een fluorescente kleurstof (Cy5, zie tabel 1) .
    Opmerking: Het antilichaam wordt alleen toegang krijgen tot het luminale domein van synaptotagmin, waaraan het bindt wanneer er continuïteit tussen de synaptische vesikel lumen en extracellulaire ruimte. Dit gebeurt met name tijdens de afgifte van neurotransmitters, waardoor dit ANTIBOdy een uitstekende markering van de actieve presynaptische terminals.
  2. Eerste spoel de co-kweken met neuronale medium (A Neurobasal medium, pH 7,4; zie Tabel 1) en voeg Cy5 gemerkt muis-anti-synaptotagmin antilichaam, verdund 1:50 in neuronale medium (Neurobasal medium A, pH 7,4), de culturen gedurende 30 min. Incubeer de cellen gedurende deze periode bij 37 ° С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer (CO2 incubator).
  3. Om de toegang van het antilichaam te verwijderen, was het co-kweken driemaal kort: eerst met koud normale PBS (pH 7,4), tweede met koude PBS (pH 7,4) die 200 mM NaCl, en de derde met koud normale PBS (pH 7,4)
  4. Fixeer de cellen met 300 pi 4% paraformaldehyde / 4% sucrose in PBS (PFA, pH 7,4) gedurende 10 min onder roeren. Was de cellen tweemaal kort met PBS (pH 7,4) vervolgens met twee langere 10 min wassingen.
  5. Glycine (0,3 M) aan elk voegen en gedurende 10 min onder roeren PFA doven.
  6. Was de cellen Kort indrukkeny tweemaal met PBS (pH 7,4) vervolgens met twee langere 10 min wassingen vóór het toevoegen van 300 gl blokkerende oplossing (1% (w / v) runderserumalbumine (BSA) in PBS, pH 7,4) om de niet-specifieke binding te verminderen van antilichamen.
  7. Zuig het blockingbuffer en voeg de cavia anti-GABA A R-γ2 antilichaam gericht tegen de γ2 N-terminale domein 33 (1: 3000 in PBS, pH 7,4) gedurende de nacht bij 4 ° С.
  8. De volgende dag, zuig het primaire antilichaam uit de putjes en was de cellen tweemaal met PBS kort daarna met twee langere 10 min wassingen.
  9. Permeabilize de cellen met Triton X-100 (0,1%) in blokkerende oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Was de cellen tweemaal kort met PBS (pH 7,4) vervolgens met twee langere 10 min wassingen vóór toevoegen van ofwel de muis anti-glutaminezuur decarboxylase (GAD) 65 antilichaam (1: 4000, Tabel 1) of muis anti-synapsin I antilichaam ( 1: 1000, Tabel 1) gedurende 120 min bij kamertemperatuur temperature.
  11. Was de cellen tweemaal kort met PBS (pH 7,4) vervolgens met twee langere 10 min wassingen en voeg blokkerende oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Centrifugeer de geschikte secundaire antilichamen (meestal geit anti-cavia IgG geconjugeerd met Cy5, geit anti-muis IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 488 of geit anti-muis IgG Alexa Fluor 405, allemaal op 2 ug / ml) aan aggregaten van antilichamen te verwijderen bij 21.910 xg gedurende 10 min, en antilichamen (1: 750) aan blokkeeroplossing. Toepassen op geschikte putjes gedurende 1 uur en dek af met aluminiumfolie om de fluoroforen te beschermen tegen blootstelling aan licht en de daaruit voortvloeiende fotobleking.
  13. Tenslotte was de cellen kort tweemaal met PBS (pH 7,4) vervolgens met twee langere 10 min wassingen om ongebonden secundair antilichaam te verwijderen en monteren dekglaasjes met bevestiging reagens (Verleng Gold, Tabel 1) ongeveer 10 gl per dekglaasje. Wacht 24 uur bij kamertemperatuur in te stellen, terwijl beschermd tegen licht alvorens naar 4° С voor lange termijn opslag.
  14. Analyseer de monsters met behulp van een laser scanning confocale microscoop met een 63x olie-immersie objectief. Zorg ervoor dat de hoeveelheid licht en de detector winst wordt aangepast om de verzadiging te voorkomen.
  15. Observeer potentiële synaps-achtige contacten als regio's van co-localisatie tussen de presynaptische terminals positief voor GAD65, synapsin I of Cy5- gelabeld anti-synaptotagmin en de postsynaptische HEK293 cellen gevisualiseerd door DIC of door de mCherry fluorescerende indicator.
  16. Count potentiële synaps-achtige contacten met behulp van Z-stack reeks optische secties (8 - 10) door middel van een diepte van 4-5 micrometer per cel met behulp van de imaging-software.

Resultaten

Het protocol voor deze neuron-HEK293 cel co-cultuur model systeem is volledig afgestemd op een optimale overleving van de cel mogelijk te maken. In dit systeem, vorming van synaps-achtige contacten en hun analyse berust op een stabiele en consistente expressie van alle drie de GABA A R subeenheden die assembleren tot een functionele receptor. Het is daarom belangrijk om immunocytochemische analyse gebruiken om te testen voor subeenheid expressie op het oppervlak van HEK293 cellen alvorens te voegen aan neuronale culturen. In deze experimenten celoppervlak expressie van α1, β2 en γ2 subeenheden (Figuur 1A) of α1, β3 en γ2 subeenheden (Figuur 1B), werd gedetecteerd onder gebruikmaking subunit antilichamen die binden aan het extracellulaire epitopen van deze subeenheden. Een hoge mate van co-lokalisatie tussen deze subeenheden in de HEK293 oppervlak aangetoond.

Na de oppervlakte-expressie en co-lokalisatie van GABA A bevestigtR subeenheden in HEK293-cellen, co-kweken werden bereid met HEK293-cellen die α1 / β2 / γ2 GABA A R subeenheden en medium stekelige neuronen gekweekt gedurende 14 dagen (14 dagen in vitro (DIV)). Cellen in co-kweek werden gedurende 24 uur, gefixeerd en met behulp van immunocytochemie en confocale microscopie geanalyseerd. Analyse contacten aangegeven dat GAD65 positieve GABAerge axon terminals gevormd sporadisch contacten met de controle HEK293-cellen (Figuur 2A, 2B). Het aantal contacten gedetecteerd 4 uur was 7,3 ± 0,9 per HEK293 cel, en dit aantal werd verminderd tot 5,5 ± 0,5 verbindingen (gemiddelde ± SEM) per HEK293 cellen 24 uur na het toevoegen van HEK293 cellen aan de gekweekte neuronen. In contrast, GAD65-positieve GABAergic axon terminals gevormd tal synaps-achtige contacten met HEK293 cellen die GABA A Rs. Het aantal contacten verkregen 4 uur na toevoeging van HEK293-cellen was 28,3 ± 4,7 per HEK293 cel en dit aantal verdere stijgingd 52,1 ± 6,3 (gemiddelde ± SEM) per HEK293 cel bij 24 uur in co-kweek (Figuur 2A, 2B).

Om te bepalen of deze synaps-achtige contacten waren 'actief' ie ondersteund vesiculaire transmitter release, werd een vesikel-luminale domein-specifieke anti-synaptotagmin Cy5 geconjugeerd antilichaam aan de co-kweekmedium toegevoegd na 23 uur incubatie. Dit antilichaam wordt alleen opgenomen in presynaptische zenuwuiteinden wanneer een porie vormen tussen het synaptische vesikel lumen en de extracellulaire vloeistof in de synaptische spleet tijdens neurotransmitter release. Na afgifte, de poriën sluit, waardoor de synaptotagmin Cy5-geconjugeerd fluorescerend antilichaam aan synaptotagmin in het blaasje. Op deze wijze worden alleen de vesicles actief in neurotransmitter afgifte gelabeld met het antilichaam. In deze experimenten weinig of geen contact tussen de controle HEK293 cellen en het medium stekelige zenuwuiteinden waren actieve & #8217; zoals getoond door het gebrek aan co-localisatie tussen de presynaptische GAD65 / synaptotagmin fluorescentie en mCherry fluorescentie in HEK293-cellen (Figuur 3A). Daarentegen werden veel "actieve" contacten gevormd tussen het medium stekelige zenuwuiteinden en α1 / β2 / γ2 expressie HEK293 cellen, hetgeen blijkt uit de hoge mate van co-localisatie van GAD65 / synaptotagmin en mCherry uitgedrukt bijzonder in HEK293-cellen ( figuur 3B).

Om te testen of een ander subtype van GABA A R ook kunnen bevorderen synaps-achtige formatie in vitro, hebben we samen gekweekt α1 / β3 / γ2 uiten HEK293 cellen met medium stekelige neuronen. Nogmaals, controle HEK293 cellen zelden ontvangen contacten met synapsin-positieve presynaptische terminals bereiken 10,8 ± 0,48 (gemiddelde ± SEM) contacten per HEK293 cel na 24 uur in co-cultuur (Figuur 4A links, 4B). Echter, HEK293 cellen dieα1 / β3 / γ2 GABA A Rs vorm significant meer synaps-achtige contacten met synapsin-positieve presynaptische terminals van medium stekelige neuronen bereiken van 25,3 ± 0,27 (gemiddelde ± SEM) contacten per HEK293 cel na 24 uur in co-cultuur (Figuur 4A rechts, 4B). Dit geeft aan dat α1 / β3 / γ2 GABAA-R tot expressie gebracht in HEK293-cellen kunnen ook synaptische contacten vorming bevorderen, hoewel hun vermogen lager is dan de sterkte van α1 / β2 / γ2 bevattende GABA A Rs.

Deze experimenten geven aan dat de co-cultuurmodel ontwikkeld in ons laboratorium maakt kwantitatieve analyse van synaptische contacten vorming in vitro en de beoordeling van de effectiviteit van verschillende subtypes van GABAA-Rs in dit proces. Deze experimenten demonstreren verder dat GABAA-Rs, naast kritiek functionele componenten van GABAerge synapsen, kan een belangrijke rol spelenin het proces van herkenning en vorming van synaptische contacten tussen remmende neuronen en neuronale geschikte doelcellen, onafhankelijk van andere synaptische adhesie-eiwitten.

figure-results-1
Figuur 1. Immunocytochemische analyse van expressie van GABA A R α1 / β2 / γ2 of α1 / β3 / γ2 in HEK293 stabiele cellijnen. Antilichamen die de extracellulaire domeinen van GABA A R subeenheden werden gebruikt label receptoren tot expressie op het celoppervlak. ( A) HEK293 cellijn die α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) en γ2 (Cy5) op een hoog niveau. (B) HEK293 cellijn die α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) en γ2 (Cy5)subeenheden op een hoog niveau. Schaal bar:. 10 um Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. GABAergische medium stekelige neuronen vormen synaps-achtige contacten met α1 / β2 / γ2- uiten HEK293 cellen in co-cultuur. (A) TL-etikettering van presynaptische terminals met anti-GAD65 antilichamen (in het groen) en HEK293 cellen met mCherry (in rood, links) of de GABA A R γ2 subunit (in blauw, rechts), onthulde punten van co-localisatie tussen deze markers aangeeft vorming van synapsen-achtige contacten na 4 of 24 uur in co-cultuur. Schaal bar: 10 pm (B) Kwantitatieve analyse van synaps-achtige co. ntacts. HEK293 cellen werden geïdentificeerd op basis van hun vorm zoals blijkt uit DIC imaging en / of mCherry expressie en het aantal contacten tussen GAD-65 positieve puncta (groen) en het oppervlak van HEK293 cellen werd geteld door gaten in elke optische deel van een Z-stack series (8-10) per cel met de beeldvormende software, en uitgedrukt als het aantal contacten / cel. De grafiek toont het aantal contacten tussen medium stekelige neuronen en controle HEK293 cellen (lichtgrijs) of α1 / β2 / γ2-HEK293 cellen (zwarte) na 4 en 24 uur in co-cultuur (gemiddelde ± SEM; n = 8 in elke toestand van twee onafhankelijke experimenten). Dit cijfer is gewijzigd van Fuchs et al. (2013) 30. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

ad / 52115 / 52115fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 3. GABA A Rs bevorderen vorming van actieve synaptische contacten. Immunolabeling van synaps-achtige contacten gevormd na 24 uur in co-cultuur tussen medium stekelige neuron terminals positief voor GAD65 (Alexa Fluor 405 cyaan) en (A) controle HEK293 cellen, of (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 cellen, zowel tijdelijk met mCherry construct (rood). Actieve contacten worden geïdentificeerd door co-localisatie tussen de vesikel luminale domein-specifieke anti-synaptotagmin antilichaam (Cy5) en GAD65 specifiek antilichaam zowel in presynaptische terminals en mCherry expressie in HEK293 cellen. Schaal bar:. 10 um Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

igure 4 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 4. GABAergische medium stekelige neuronen vormen synaps-achtige contacten met α1 / β3 / γ2- subunit uiten HEK293 cellen in co-cultuur. (A) Fluorescent labeling van presynaptische terminals met anti-synapsin I antilichamen (groen), en controle HEK293-cellen (links) of α1 / β3 / γ2 expressie HEK293 cellen tijdelijk getransfecteerd met zowel mCherry (rood), geopenbaarde punten co-localisatie tussen deze markers hetgeen de vorming van synapsen-achtige contacten na 24 uur in co-cultuur. Schaal bar: 10 pm (B). Kwantitatieve analyse van de synaps-achtige contacten. HEK293-cellen werden geïdentificeerd door expressie mCherry en het aantal contacten tussen synapsin I-positieve puncta (groen) en het oppervlak van HEK293 cellen werd geteld door gaten in elk gedeelte van een optische Z-stapel series (8-10) per cel met behulp van imaging-software, en uitgedrukt als het aantal contacten / cel. De grafiek toont het aantal contacten tussen medium stekelige neuronen en controle HEK293 cellen (lichtgrijs) of α1 / β3 / γ2-HEK293 cellen (zwarte) na 24 uur in co-cultuur (gemiddelde ± SEM, n = 8-12 cellen in elke aandoening, van twee onafhankelijke experimenten). Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Hoewel dit protocol is technisch moeilijk uit te voeren, zijn er verschillende kritische stappen die moeten worden gevolgd om de meest nauwkeurige en herhaalbare co-cultuur assays bereiken. Ten eerste moet kweekmedium stekelige neuronen worden gezaaid met een optimale dichtheid. Als gezaaid te dun, neuronen hebben de neiging om heel langzaam te ontwikkelen en overleving is sterk verminderd. Anderzijds, indien geënt te dicht, neuronen neiging te aggregeren waarop de analyse van contacten met HEK293 cellen compromitteert. Ten tweede wordt aanbevolen tijdelijk drukken een fluorescerende reporter, GFP of mCherry in HEK293 cellen die stabiel tot expressie GABA A Rs vóór platting ze in de co-cultuur. Dit maakt een betrouwbare herkenning van HEK293-cellen, die kunnen worden aangetast door gelijkenis in vorm en grootte van deze cellen en zeldzame overleven glia cel van neuronale kweken. De efficiënte transfectie met GFP of mCherry cDNA bereiken, HEK293 cellijnen moeten in de exponentiële groeifase engeënt op de juiste dichtheid in 6-well platen. Spaarzame seeding gevolgd door transfectie zal veroorzaken cellen slecht groeien, terwijl de over-seeding wordt voorkomen dat de cellen van het opnemen van de cDNA. Idealiter moeten de cellen worden gezaaid zodat ze tussen 70-90% confluent op de dag van transfectie. Ten derde moet transfectie worden geoptimaliseerd voor elke cellijn gebruikt, zoals sommige cellijnen gevoeliger zijn dan de anderen. Dit komt omdat constitutieve GABAA-R expressie in HEK293 cellen vermindert celoverleving en het vermogen van cellen om te herstellen na transfectie. Bovendien overleving afhankelijk van het type van GABA A Rs expressie in HEK293-cellen, met enkele cellijnen significant gevoeliger dan de andere. Transfectie met behulp van liposomaal reagens een optimale methode voor het uitdrukken van vreemde eiwitten in snel groeiende cellijnen, die zowel de hoge transfectie-efficiëntie en het niveau van expressie. Echter, dit reagens veroorzaakt te veel schade langzaam groeiende cellijnen voordie we regelmatig een niet-liposomale transfectie reagens. Dit werkt op dezelfde manier als de liposomale reagens, maar de hoeveelheid DNA die nodig is voor efficiënte transfectie aanzienlijk verminderd. Dit maakt een grotere celoverleving (ongeveer 80-90%, vergeleken met 60% met liposomaal reagens) maar met lagere transfectie efficiëntie (60%). Tenslotte het aantal controle HEK293 of α1 / β2 / γ2 HEK293 expressie brengende cellen toegevoegd aan neuronale kweken moet worden geoptimaliseerd. Toevoegen van te weinig cellen compromitteert de succesvolle analyse van de contacten tussen HEK293 cellen en neuronen, omdat ze zeer zeldzaam geworden. Omgekeerd, het toevoegen van te veel HEK293 cellen veroorzaakt neuronale celdood binnen enkele uren.

Embryonale medium stekelige neuron culturen moet idealiter worden bereid met striataal weefsel ontleed uit embryonale leeftijd 15 - 17. Toch gebeurt het vaak dat de embryo's zijn iets jonger of ouder zijn dan de optimale leeftijd. In dit geval, het aantal neuronen in cultuur geëntmoeten worden gevarieerd. Weefsel dat is jonger dan E15 moet worden geënt op een iets lagere dichtheid, terwijl weefsel dat ouder is dan E17 moet worden gezaaid met een hogere dichtheid, optimale celoverleving toestaan. Bovendien kan cytosinearabinoside (Ara-C) worden toegevoegd aan oudere kweken groei van glia, die meer overvloedig in oudere weefsel voorkomen.

Bij het maken van co-culturen, is het belangrijk om het optimale aantal getransfecteerde HEK293 of α1 / β2 / γ2 HEK293 expressie brengen plaat, zoals hierboven vermeld. Echter, kan het nodig zijn om dit te bepalen voor elke cellijn, vanwege verschillen in overleving. Typisch 30.000 cellen in een maximaal volume van 50 ul worden toegevoegd aan elk putje van een 24-putjes, die reeds bevat 500 ul neuronale kweekmedium, aangezien dit ervoor zorgt dat het geconditioneerde medium neuronale niet te veel wordt verdund en dat de voorwaarden binnen elk putje vrij constant blijft, bv De concentratie van groeifactoren. Volumes toevoegen van meer dan 50 pi aan elk putje zou in het algemeen de dood van de neuronen.

Een van de grote nadelen van de co-cultuur techniek is dat de neuronale culturen gemaakt van gedissocieerde cellen gekweekt als een monolaag, waardoor de neuronen zijn verwijderd uit hun normale micro en kunnen hun normale anatomische structuur vaststellen. Derhalve missen zij de juiste verbindingen, ingangen en afgescheiden moleculen van andere cellen die de eerste stadia van synapsen ontwikkeling kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, in vivo medium stekelige neuronen dicht geïnnerveerd door glutamaat input van de cortex, thalamus en andere hersengebieden 34 echter in onze neuronale kweken glutamaat synapsen behoren niet omdat deze ingangen worden beschadigd tijdens dissectie van de striatale weefsels. Hoe de afwezigheid van functionele glutamatergische synapsen in gekweekte medium stekelige neuronen affsp hun vermogen om GABA-erge synapsen met elkaar en / of HEK293 cellen die GABAA-Rs vormen blijft een open vraag. Deze vraag kan gemakkelijk worden opgelost door het kweken medium stekelige neuronen met corticale neuronen glutamaat zodat hij met functionele synapsen 35 vóór de toevoeging van HEK293 cellen vormen. Een alternatieve benadering zou zijn om een ​​co-cultuurmodel te ontwerpen gebaseerd op organotypische slice cultures, die enkele van de cytoarchitecture die belangrijk zijn voor rijping en synapsvorming kunnen handhaven. Echter, organotypische slice culturen hebben dichte en heterogene neuropil waarop de analyse hier uitgevoerd in gevaar kunnen brengen. Een ander belangrijk nadeel van het gebruik van co-cultuur assays is dat GABA A Rs uitgedrukt op het oppervlak van HEK293 cellen niet gegroepeerd zoals in neuronen, maar dit blijkt niet noodzakelijk synapsvorming gegeven een voldoende hoge oppervlakte-expressie 30 worden. Bijvoorbeeld, in de rOdent hersenen en in hippocampale culturen, α1 de GABAA-subeenheid R wordt in de meeste GABAerge synapsen alle postsynaptische domeinen van pyramidale cellen. Echter, de α2 specifiek in een subset van synapsen op de somata en dendrieten maar is sterk verrijkt in de axon eerste segment, zoals geopenbaard door immunofluorescentie en elektronenmicroscopie 36. Aangezien synapsvorming in de co-cultuur nog betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd en geanalyseerd 30, suggereert dit dat de dichtheid van GABA A Rs op het celoppervlak van HEK293 cellen vergelijkbaar met of zelfs hoger dan de dichtheid van deze receptoren in synaptische kan clusters in neuronen. Dit kan verklaren, althans gedeeltelijk, waarom synaptische adhesie-eiwitten, zoals neuroligin en postsynaptische dichtheid eiwitten, zoals gephyrin, niet noodzakelijk synapsvorming in de co-cultuur, wanneer het geschikt geassembleerde GABAA-R aanwezig zijn in voldoende dichtheid.

Het is goed gedocumenteerd dat GABA A R structureel en functioneel heterogene, en dat de receptor subunit samenstelling bepaalt de subcellulaire lokalisatie en farmacologische eigenschappen. Bijvoorbeeld wordt de opname van 2 subeenheden bekend als een voorwaarde voor de synaptische lokalisatie van GABA A Rs terwijl de subeenheid vrijwel uitsluitend aanwezig in extrasynaptic GABAA-Rs. De receptoren die nemen alleen αβ combinaties worden ook gedacht aan voornamelijk worden gelokaliseerd aan de extrasynaptic domeinen 12- 14. Of dit specificiteit wordt gehandhaafd in onze co-kweeksysteem kan eenvoudig worden getest door tijdelijk transfecteren 2 of subeenheid cDNAs in HEK293-cellijnen die stabiel α en β-subeenheden, alvorens ze toe te voegen aan neuronale culturen. Onze voorlopige experimenten met deze benadering suggereren dat synaptische contacten gemakkelijk worden alleen gevormd in aanwezigheid van de 2 subunit, wat aangeeft dat de specificity waargenomen in vivo waarschijnlijk in vitro te behouden (gegevens niet getoond).

Bovendien worden GABAA Rs waarin verschillende α subeenheden selectief gelokaliseerd synaptische contacten gevormd met specifieke soorten presynaptische neuronen. Bijvoorbeeld, in de globus pallidus, de α1-GABA A R's meestal aangetroffen striatopallidal (str-GP) en palliopallidal (GP-GP) synapsen, die zich op dendrieten en somatische gebieden van het medium stekelige neuronen, respectievelijk. De α3-GABA A R's zijn gevestigd in perisomatic regio van medium stekelige neuronen en in contact komen met de plaatselijke huisarts axon collateralen, terwijl de α2-GABA A R's bevinden zich aan distale dendrieten van deze neuronen en vooral gecontacteerd door de input van het striatum 32. Expressie van specifieke α subeenheden in verschillende synapsen en in verschillende neuronale compartimenten is ook aangetoond in andere hersengebieden zoals hippocampus 21 en neocortex 18,20. Deze bevindingen doen de vraag hoe de specifieke remmende synapsen zijn gevormd in de hersenen. Heeft de hechting van een specifiek type van presynaptische terminal induceren de invoeging van specifieke GABA A R subtypen in de punten van contact? Zijn de receptoren verhandeld specifieke subcellulaire locaties volgens hun subunit samenstelling, waarbij de plasmamembraan insertie is een voorwaarde voor de adhesie van axonale terminals bepaalde oorsprong? Tot op heden zijn deze vragen onbeantwoord. Het gebruik van verlaagde modelsystemen zoals de co-cultuurmodel systeem, kunnen we beginnen beantwoorden van deze complexe vragen omdat het systeem lastig om transfectie van DNA constructen en toepassing van reagentia en, belangrijker, is het geschikt voor live cell beeldverwerkingsanalyses 30. Dus, door dit modelsysteem we beginnen testen van de rol van individuele moleculen, waaronder verschillende soorten GABA A Rs, weetn aanwezig te zijn bij synaptische contacten zijn. Een ander voordeel is dat synapsen in dit modelsysteem vorm snel, binnen enkele minuten tot uren, waardoor de duur van de experimenten. Vergelijkbare co-cultuurmodel systemen succesvol gebruikt in het verleden om te screenen op de nieuwe synaptogenic moleculen 27,37,38.

Begrijpen hoe het centrale zenuwstelsel ontwikkelt, rijpt en vormen verbindingen tussen neuronen zo ingewikkeld om de controle, bijvoorbeeld, gedrag of cognitie, is van fundamenteel belang. Deze afstand doel alleen bereikt door afbakening van de moleculaire mechanismen die de stappen van herkenning en cel-cel communicatie regelen tijdens de ontwikkeling. Vanwege enorme complexiteit, kan de moleculaire details van deze meervoudige cellulaire interacties momenteel bestudeerd worden met precisie slechts in verminderde systemen. De mogelijkheid om de complexiteit van deze systemen verhogen door expressie meervoudige combinaties van eiwitten en bestuderen hoeze interageren heeft een aantal voordelen in vergelijking met bijvoorbeeld genetische deletie benaderingen. Dit is omdat nauwkeurige interpretatie van de effecten van een enkel gen deletie wordt vaak aangetast door veranderingen geassocieerd compenserende mechanismen maskeren van de effecten van oorspronkelijke laesies, vooral in de zich ontwikkelende hersenen. De eenvoudige maar informatieve co-cultuur techniek beschreven is toegestaan ​​een ontdekking van de structurele rol van GABA A Rs in synapsvorming en opende de mogelijkheid te onderzoeken hoe GABA A Rs en andere celadhesie moleculen en / of synaptische matrixeiwitten met elkaar tijdens synaptogenese. Synaptische matrixeiwitten van bijzonder belang omdat zij onlangs aangetoond een belangrijke rol bij de glutamaterge synapsvorming 39 spelen. Verdere ontwikkeling van co-cultuur modellen is belangrijk omdat ze de potentie hebben om onze kennis van de moleculaire mechanismen die leiden de 'normale & vooruit# 8217; hersenontwikkeling en verhogen ons begrip van deze mechanismen worden veranderd in veel neurologische aandoeningen, zoals epilepsie, schizofrenie, autisme spectrum stoornissen en vele anderen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

We willen graag financiële steun van de MRC UK (G0800498) erkennen. We willen ook graag professor JM Fritschy, Universiteit van Zürich, bedanken voor het verstrekken van de GABA A -R subunit-specifieke γ2 antilichaam en Professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, voor het verstrekken van de pcDNA 3.1 (+) expressie vectoren die de resistentie tegen antibiotica genen voor de productie van stabiel getransfecteerde HEK293 cellijnen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Life Technologies11960-044Verwarmen in waterbad op 37 °C voor gebruik
L-GlutamineLife Technologies25030-024
Penicilline/StreptomycineLife Technologies15070-063Gevaar: irriterend
FBS (Fetal Bovine Serum)Life Technologies10106-169
NeuralbasalLife Technologies21103-049Verwarmen in waterbad op 37 °C voor gebruik
B27 SupplementLife Technologies17504-044
GlucoseSigma-AldrichG8769
HBSS (10X)Life Technologies14180-046
HEPES (1M)Life Technologies15630-056
PBS (1X)Life Technologies10010-031
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selectie)Life TechnologiesV790-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selectie)Life TechnologiesV860-20
pcDNA 3.1(+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selectie)Life TechnologiesV870-20
Stable HEKα1β2γ2 lijnSanofi-Synthelabo, Parijs
Poly-D-lysineSigma-AldrichP1149
G418 disulfaat zout (Geneticin)Sigma-AldrichG5013Gevaar: irriterend
Phleomycine D1 (Zeocin)Life TechnologiesR25001
Hygromycine BLife Technologies10687-010Gevaar: toxisch, irriterend en corrosief
Trypsine-EDTALife Technologies25300-054Verwarmen in waterbad op 37 °C voor gebruik. Gevaar: irriterend.
Poly-L-lysineSigma-AldrichP6282
LaminineSigma-AldrichL2020
100 μm Nylon Cell StrainerVWR734-0004
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)Sigma-AldrichC1768Gevaar: irriterend
Chelerend middel (Versene)Life Technologies15040-033
Liposomale transfectie reagens (Lipofectamine LTX) met liposomale transfectie buffering reagens (PLUS reagens).Life Technologies15338-100Alternatieve transfectie methode: Effectene Reagent
Niet-liposomaal transfectie reagens (Effectene reagens)Qiagen301425
Gereduceerd serum medium (Opti-MEM)Life Technologies11058-021
Muis anti-Synaptotagmin antilichaam geconjugeerd aan Cy5Synaptic Systems105311C5
Neurobasal ALife Technologies10888-022
Natriumchloride (NaCl)VWR27810.364
GlycineSigma-AldrichG1726
BSA (Bovine Serum Albumine)Sigma-AldrichA3294
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antilichaamProf. Jean Marc FritschyN/A(Institut van Zürich, Zwitserland) Fritschy, JM en Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).
Triton X-100PromegaH5141
Muis anti-Glutamaat Decarboxylase (GAD)65 antilichaamMerck MilliporeMAB351
Muis anti-synapsine antilichaamSynaptic Systems106-011
Muis anti-β2/3 antilichaam (BD17)Merck MilliporeMAB341
Konijn anti-α1 GABAA receptor antilichaamProfessor Anne StephensonN/A(UCL School of Pharmacy, Londen) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172
Geit anti-guinea pig geconjugeerd aan Cy5 antilichaamMerck MilliporeAP1085
Geit anti-muis Alexa Fluor 488 antilichaamMerck MilliporeAP124S
Geit anti-muis Alexa Fluor 405 antilichaamLife TechnologiesA31553
Geit anti-muis Alexa Fluor 555 antilichaamLife TechnologiesA21422
Geit anti-konijn Alexa Fluor 488 antilichaamLife TechnologiesA11008
Montage reagens (Prolong Gold)Life TechnologiesP36930Gebruik op kamertemperatuur

Referenties

  1. Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
  2. Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
  3. Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
  4. Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
  5. Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
  6. Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
  7. Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
  8. Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
  9. Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
  10. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
  11. Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
  12. Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
  13. Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
  14. Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
  15. Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
  16. Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
  17. Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
  18. Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
  19. Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
  20. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  21. Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
  22. Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
  23. Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
  24. Siddiqui, T. J., Craig, A. M. Synaptic organizing complexes. Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).
  25. Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
  26. Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
  27. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  28. Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
  29. Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
  30. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
  31. Ventimiglia, R., Lindsay, R. Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).
  32. Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
  33. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
  34. Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
  35. Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
  36. Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
  37. Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
  38. Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
  39. Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).

Herprints en machtigingen

Tags

GABAerge synapsvormingGABA A-receptorenimmunofluorescentieanalyseconfocale microscopiedissectie van het striatumneuronale cultuursynaptische contacten
Remmende Synapse Formation in een co-cultuur model Integratie GABAergic Medium Maxomys Neuronen en HEK293 cellen die stabiel GABA A Receptoren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.