Hier beschrijven we een methode om het oncogene bacteriële orgaantje, bekend als het Cag Type IV Secretie Systeem (Cag-T4SS), te visualiseren. We ontdekken dat de Cag-T4SS differentieel wordt geproduceerd op het oppervlak van H. pylori als reactie op wisselende omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hoge Resolutie Elektronenmicroscopie van de Helicobacter pylori Cag Type IV Afscheiding System Pili Geproduceerd in wisselende omstandigheden van Iron Beschikbaarheid
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Helicobacter pylori is een spiraalvormig, gramnegatief bacterium dat de menselijke maag van de helft van de wereldbevolking koloniseert1,2. H. pylori is de primaire oorzaak van maagkanker, de op een na meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen wereldwijd3. Een virulentiefactor die is geassocieerd met een verhoogd risico op maagaandoeningen, is het Cag-pathogeniciteits-eiland, een 40-kb gebied binnen het chromosoom van H. pylori dat codeert voor een type IV-secretiesysteem en de cognate effectormolecuul, CagA4,5. De Cag-T4SS is verantwoordelijk voor het transporteren van CagA en peptidoglycaan naar gasthercepitheelcellen5,6. De activiteit van de Cag-T4SS resulteert in talrijke veranderingen in de biologie van gasthercelten, waaronder upregulatie van cytokine-expressie, activering van pro-inflammatoire paden, cytoskeletaal hermodellering, en inductie van oncogeen celsignaleringsnetwerken5-8. De Cag-T4SS is een macromoleculair apparaat dat bestaat uit sub-assemblagecomponenten die de binnen- en buitenmembraan overspannen en zich naar buiten uitstrekken vanuit de cel in de extracellulaire ruimte. Het extracellulaire deel van de Cag-T4SS wordt de “pilus” genoemd5. Talrijke studies hebben aangetoond dat de Cag-T4SS-pilia worden gevormd op het gastheer-pathogeen-interface9,10. De omgevingskenmerken die de biogenese van dit belangrijke orgaan regelen, blijven echter grotendeels onduidelijk. Onlangs hebben we gerapporteerd dat omstandigheden van lage ijzerbeschikbaarheid de Cag-T4SS-activiteit en pilus-biogenese verhoogden. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om H. pylori te kweken onder verschillende omstandigheden van ijzerbeschikbaarheid voorafgaand aan co-cultuur met menselijke maagepitheelcellen. Verder presenteren we het uitgebreide protocol voor visualisatie van het hyper-piliated fenotype dat wordt vertoond onder ijzerbeperkte omstandigheden door middel van hoge resolutie scanning elektronenmicroscopie analyses.
Inleiding
H. pylori-infectie is een belangrijk risicofactor voor maagkanker1. De ziekteverloop varieert echter en hangt af van talrijke factoren, zoals de genetische aanleg van de gastheer, de genetische diversiteit van H. pylori-stammen en omgevingselementen zoals het dieet van de gastheer11. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat er een correlatie bestaat tussen H. pylori-infectie, ijzertekort (gemeten door verlaagde bloedferritine en hemoglobineconcentraties) en verhoogde productie van pro-inflammatoire cytokinen, inclusief IL-8-secretie, die uiteindelijk leidt tot verhoogde progressie van de maagaandoening12. A....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. H. pylori Groei in diverse omstandigheden van de beschikbaarheid van ijzer en co-cultuur met Human maagepitheelcellen
- Selecteer H. pylori stam PMSS1 voor deze studies aangezien het een intact cag pathogeniteit eiland en drukt een soort werking IV secretiesysteem. Ook gebruik maken van een isogene kooi mutant (PMSSI Δ kooi) als negatieve controle. Groeien bacteriën op TSA-platen aangevuld met 5% schapenbloed (agarplaten) gedurende 24 uur bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2.
OPMERKING: Bereid reagentia en assembleren materialen zoals beschreven in de materialen en apparatuur Table. Eindconce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In dit rapport hebben we aangetoond dat de voorwaarden van wisselende beschikbaarheid van ijzer hebben de capaciteit om te moduleren H. pylori Cag-T4SS pilus biogenese bij de gastheer-pathogeen-interface. Wanneer gekweekt in medium alleen, H. pylori vormt een gemiddelde van 3 pili / cel. Toen H. pylori wordt gekweekt in ijzer afbrekende omstandigheden (de synthetische chelator dipyridyl) die sub-remmend bacteriegroei (figuur 1), de bacteriën talrijke Cag-T4SS pili (~ 7 pili / .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
IJzer is een essentieel micronutriënt voor de meeste levensvormen, waaronder bacteriële pathogenen. In een poging om de levensvatbaarheid van binnendringende micro-organismen te beperken, gewervelde gastheren afzonderen voedingsstof ijzer in een proces dat bekend staat als "nutritionele immuniteit" 18. In reactie daarop bacteriële pathogenen ontwikkeld ijzer gebruiken als een globale signaalmolecule hun omgeving waarnemen en regelen de uitwerking van virulentie functies zoals ijzer acquisitie system.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door de Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 en de CTSA award UL1TR000445 van het National Center for Advancing Translational Sciences. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Center for Advancing Translational Sciences of de National Institutes of Health. Scanning electron microscopy experimenten werden deels uitgevoerd met behulp van de VUMC Cell Imaging Shared Resource, ondersteund door NIH-grants CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 en EY08126.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Gemodificeerde brucella bouillon | |||
| Pepton van caseïne (10 g/L) | Sigma | 70172 | |
| Peptische digestie van dierlijk weefsel (10 g/L) | Sigma | 70174 | |
| Gistextract (2 g/L) | Sigma | 92144 | |
| Dextrose (1 g/L) | Sigma | D9434 | |
| Natriumchloride (5 g/L) | Thermo Fisher | S271-10 | |
| Cholesterol (250X) (4 ml/L) | Life Technologies | 12531018 | |
| Ferric chloride (100 of 250 uM) | Sigma | 157740-100G | |
| Dipyridyl (200 uM) | Sigma | D216305-100G | |
| Gemodificeerde RPMI | |||
| RPMI+HEPES (1X) | Life Technologies | 22400-121 | |
| Foetaal bovien serum (100 ml/L) | Life Technologies | 10438-026 | |
| Bereiding voor elektronenmicroscopie | |||
| Paraformaldehyde (2,0% waterig) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Gluteraldehyde (2,5% waterig) | Electron Microscopy Sciences | 16220 | |
| Natriumcacodylate (0,05 M) | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Osmium tetroxide (0,1% waterig) | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| Ethanol (absoluut) | Sigma | E7023 | |
| Colloïdaal zilververf | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| SEM-steekproefstubs | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Dekvlakken | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| Evaluatie van IL-8-secretie | |||
| Quantikine IL-8 ELISA-kit | R&D Systems | D8000C |
Referenties
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
- Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
