Het bekijken en toegang krijgen tot het kippenembryo tijdens de ontwikkeling kan een uitdaging zijn. We hebben een ex ovo methode ontwikkeld die eenvoudig, kosteneffectief is en gemakkelijk kan worden gebruikt in een klaslokaal of onderzoeksomgeving. Deze methode biedt toegang tot het embryo tot in de late stadia van de embryonale ontwikkeling (HH 40).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geoptimaliseerd Ex-ovo Het kweken van kippenembryo's tot geavanceerde stadia van ontwikkeling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onderzoek in anatomie, embryologie en ontwikkelingsbiologie heeft grotendeels vertrouwd op het gebruik van modelorganismen. Om de ontwikkeling in levende embryo's te bestuderen, worden vaak modelorganismen, zoals de kip, gebruikt. De kip is een uitstekend modelorganisme vanwege zijn lage kosten en minimale onderhoud, maar ze bieden observationele uitdagingen omdat ze zijn ingesloten in een ondoorzichtige eischaal. Om het embryo goed te kunnen bekijken terwijl het zich ontwikkelt, moet de schaal worden voorzien van een raam of verwijderd. Zowel het plaatsen van ramen als ex ovo technieken zijn ontwikkeld om onderzoekers te helpen bij de studie van embryonale ontwikkeling. Echter, elke methode heeft beperkingen en uitdagingen. Hier presenteren we een eenvoudige, geoptimaliseerde ex ovo kweektechniek voor kippenembryo's die de observatie van embryonale ontwikkeling van stadium HH 19 tot late ontwikkelingsstadia (HH 40) mogelijk maakt, wanneer veel organen zich hebben ontwikkeld. Deze techniek is gemakkelijk toe te passen in zowel bachelorklassen als meer geavanceerde onderzoekslaboratoria waar embryomanipulaties worden uitgevoerd.
Inleiding
Ex ovo cultivatie heeft een belangrijke rol gespeeld in de studie van de ontwikkeling van de kip1, 2. Deze kweekmethode is gebruikt om neurologische ziekten, ledemaatontwikkeling, craniofaciale ontwikkeling en als model om misvormingen geassocieerd met diabetes te onderzoeken 3, 4, 5.
Er zijn veel variaties op de ex ovo techniek. De meest gebruikelijke aanpak is om een schuimcup6,7,8 of een glazen kom5 te gebruiken. Bij deze methoden is de cup of kom bekleed met plasticfolie om het embryo te ondersteunen, er wordt een deksel op de cup geplaatst en vervolgens wordt het embryo in een incubator met geschikte vochtigheid geplaatst6. Deze opstelling is echter technisch uitdagend. De eerste uitdaging is de plasticfolie die wordt gebruikt om het embryo te ondersteunen. Deze folie is moeilijk te hanteren en hecht vaak niet goed aan de cup. Om dit probleem op te lossen, wordt er een elastisch bandje om de cup geplaatst om de folie op zijn plaats te houden. Desondanks kan de folie nog steeds glijden, wat fataal is voor het embryo. De plasticfolie kan scheuren of worden doorboord door forceps of naalden die tijdens embryomanipulaties en observaties kunnen worden gebruikt. Ten slotte is deze opstelling niet erg stabiel en kunnen studenten de cups gemakkelijk omver duwen. De hoogte van de cups maakt het ook erg moeilijk om het embryo onder een stereomicroscoop te plaatsen, wat een beperkte objectiefhoogte heeft. Deze uitdagingen maken het voor bachelorstudenten moeilijk om met levende kuikenembryo's te werken in onderwijslaboratoria, zoals cursussen geavanceerde ontwikkelingsbiologie.
De bovenstaande uitdagingen in de ex ovo methode hebben ertoe geleid dat onderzoekers zich tot de windowing-methode 9,10 wenden om de ontwikkeling van embryo's van kuikens te bekijken. Bij deze techniek wordt een gat of “venster” gemaakt in de eischaal boven het embryo. Het gat kan worden afgedicht met tape of was9 om verdere embryonale ontwikkeling mogelijk te maken. Hoewel de windowing-methode enkele voordelen heeft, zoals de mogelijkheid om embryonale ontwikkeling te bekijken en eenvoudige onderhoud, heeft deze methode ook enkele beperkingen. Ten eerste moet het venster redelijk groot zijn om het hele embryo te kunnen bekijken (vooral in latere stadia). Ten tweede zijn grote vensters moeilijk te af te sluiten; een onjuiste afdichting zal leiden tot steriliteit en overlevingsproblemen. Het gebruik van gesmolten was als afdichting voegt een andere ongemakkelijke en rommelige stap toe aan het protocol. Daarom, hoewel de windowing-methode ideaal kan zijn voor kuikenembryo's in jonge stadia (HH 11 – HH 27), is het bekijken van het hele embryo in latere stadia niet gemakkelijk te bereiken.
Hier beschrijven we een verbeterde en eenvoudige ex ovo kweektechniek11 die het gebruik van hoogtechnologische apparatuur overbodig maakt, gemakkelijk te hanteren is onder een stereomicroscoop, het embryo voldoende ondersteuning geeft om microscopische manipulaties uit te voeren, en onderzoekers in staat stelt om de groei van het embryo in zijn geheel te bekijken tot ver in de latere ontwikkelingsstadia (tot HH 40-41). Met deze vooruitgang in de ex ovo techniek krijgen individuen toegang tot een completer begrip van embryonale ontwikkeling. Groei in latere stadia stelt individuen bijvoorbeeld in staat om ontwikkelingsprocessen te observeren die pas op dit tijdstip optreden, zoals ossificatie, veerontwikkeling en gevorderde ledemaat- en oogontwikkeling. Het hele embryo en extra-embryonale membranen en vaatwerk zijn duidelijk zichtbaar. Ook meer geavanceerd onderzoek kan worden uitgevoerd, zoals embryonale manipulaties (dwz het implanteren van in remmers gedrenkte kralen of het inbrengen van barrières tussen weefsellagen), en onderzoekers zijn dan in staat om de effecten van de manipulaties in latere embryostadia te observeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Alle leveringen zijn opgenomen in tabel 1.
1. Het opslaan van de kippenembryo's
- Incubeer kippeneieren van de stam Gallus gallus horizontaal bij 37 ° C met ongeveer 40% vochtigheid en draai eieren of tweemaal daags. Het draaien van de eieren is belangrijk om te voorkomen dat het embryo uit het naleven van de eierschaal.
- Niet om het ei draaien in de 24 uur voorafgaand aan het opzetten van de kweek anders de embryo zich ventraal van de dooier massa en beschadigd het openen van de eieren in stap 3. Bovendien houden de eieren bij 4 ° C graden voor niet meer dan één week voor incubatie "halt" ontwikkeling, maar dit is niet ideaal.
2. Staging kippenembryo's
- Stadium de kippenembryo's met behulp van de Hamburger en Hamilton 12 stagingtabel. De ideale podium voor het opzetten van de ex-ovo kweken is HH stadium 19-20 (ongeveer 3 dagen incubatie) because dit is kort na het hoofd draait op 53 HPF.
Opmerking: HH stadium 19-20 wordt gekenmerkt door de volgende morfologische kenmerken: somites worden uitgebreid naar de meerderheid van de staart, maar het einde van de staart blijft unsegmented, de staart kiem is gekruld, de allantois is klein en heeft vaatstelsel beperkt, het been-knoppen zijn groter dan de vleugel-knoppen en de ogen zijn ongepigmenteerde of hebben een grijsachtige tint.
3. Het verwijderen van het Embryo van de Shell
- Voordat u het embryo uit de schelp, spuit de shell met 70% ethanol en laat ze drogen. Laat het ei niet draaien snel, omdat dit het embryo zal beschadigen.
- En let niet te veranderen van de oriëntatie van het ei, zorgvuldig barst het ei aan de onderkant (dat wil zeggen, de kant die ventrale tijdens incubatie was) en laat het embryo in een steriele wegen boot (88 x 88 x 23 mm). Vegen van wegen boten met 70% ethanol. Inspecteer het embryo dat de dooierzak niet beschadigd. Als de dooier hals gebroken, gooi het embryo, omdat het niet zal overleven.
- Observeer het embryo te zorgen dat het levensvatbaar is; het hart klopt, verschijnt vaatstelsel normaal, en geen duidelijke afwijkingen aanwezig zijn. Zorg ervoor dat de randen van de wegen boot droog zijn.
- Met behulp van een pipet, drop 40 ul van penicilline / streptomycine (5.000 eenheden penicilline, 5 mg streptomycine per ml) op de top van de albumine te helpen infectie te voorkomen.
4. Voorbereiding van de vochtigheid kamer
- Plaats een kleine stapel kim-doekjes en / of een absorberend kussen van katoen in de bodem van een steriele plastic houder (12 x 12 x 6 cm) afgeveegd met 70% ethanol.
- Voeg steriel, gedestilleerd water aan de kim-doekjes en / of katoen (ongeveer 150 ml water) te bevochtigen.
5. Montage van de Ex Ovo Cultuur
- Plaats de gewichtboot waarin het embryo bovenop de vochtige vulling. Vervolgens plaats helft van een vierkante steriele petrischaal (9.5 x 9.5 cm) bovenop tHij boot weegt om een losse deksel vormen.
- Bedek de plastic container met het deksel. Druk de twee hoeken van het deksel, zorgen voor een gedeeltelijke afsluiting die nog steeds zorgt voor een goede luchtstroom in de kamer.
- Plaats de setup voorzichtig in de 37 o C incubator totdat de gewenste podium.
- Plaats containers van water in de incubator helpen de vochtigheid, indien een gecontroleerde luchtvochtigheid incubator niet beschikbaar. Steriliseer alle water in de kamers en vochtigheid in de incubator en vul indien nodig gedurende de incubatieperiode. 40% luchtvochtigheid is ideaal.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze ex ovo methode maakt het mogelijk voor de observatie van embryo's uit de vroege stadia van ontwikkeling (HH 19/20) tot de late stadia van ontwikkeling (HH 40-41) (Figuur 1A en 1B). Het opzetten van de cultuur bij HH 19-20 verhoogt de overlevingskansen van de embryo's in de cultuur. Voorafgaand aan de kop te draaien (vóór 53 HPF) overlevingskansen is zeer laag in de cultuur en na etappe 21, het embryo heeft de neiging om meer te houden aan de shell op verwijdering d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ex ovo kweken en vensteropdrachten beide hebben voordelen en uitdagingen. Hier vergelijken we de voordelen en uitdagingen van het plastic bekertje ex ovo-methode en de window-methode om onze geoptimaliseerde ex ovo methode hier getoond. Met onze methode kunnen manipulatie en gemakkelijke observatie van het kippenembryo in de late stadia van de ontwikkeling en onze verfijningen aan de traditionele ex ovo methode 1, 2, 3 maken het bovendien zeer makkelijk te gebruiken in unde...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen met betrekking tot de informatie die in dit manuscript informatie.
Dankbetuigingen
We willen graag Paul Poirier, de Media Producer, bij Mount Saint Vincent University bedanken voor zijn werk in het filmen en bewerken van de video deel van dit manuscript. Wij erkennen de Natural Science and Engineering Research Council van Canada voor financiering.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Maak kleine aliquots om bevriezing/ontdooien te voorkomen |
| Vierkante Petrischalen | 9,5 cm x 9,5 cm | ||
| Weegschaal | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
Referenties
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
