Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal In Vivo

Samenvatting

We beschrijven hier een op fluorescentie gebaseerde primer-extensiemethode om transcriptionele startpunten van bacteriële transcripten en RNA-verwerking in vivo te bepalen met behulp van een geautomatiseerde gel-sequencer.

Samenvatting

Fluorescentie gebaseerde primer extensie (FPE) is een moleculaire methode om transcriptionele startpunten of verwerking websites van RNA-moleculen te bepalen. Dit wordt bereikt door reverse transcriptie van het RNA van belang met specifieke fluorescent gelabelde primers en daaropvolgende analyse van de resulterende cDNA-fragmenten door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. Tegelijkertijd wordt een traditionele Sanger sequencing reactie uitgevoerd op de gel aan de uiteinden van de cDNA-fragmenten wijzen aan hun exacte overeenkomstige basen. In tegenstelling tot de 5'-RACE (Rapid Amplification van cDNA Ends), waarbij het product moet worden gekloneerd en meerdere kandidaat sequentie, kan het grootste deel van de cDNA-fragmenten gegenereerd door primerverlenging gelijktijdig worden gedetecteerd in een gel run. Bovendien kan de gehele procedure (van reverse transcriptie tot de uiteindelijke analyse van de resultaten) in een werkdag worden ingevuld. Door fluorescerend gemerkte primers, het gebruik van gevaarlijke radioactieve isotoop gemerkte reagentiakan worden vermeden en doorlooptijden worden gereduceerd producten tijdens de elektroforese procedure kan worden gedetecteerd.

In het volgende protocol beschrijven we een in vivo fluorescentie primerverlenging methode uiteinden van de RNA 5 'betrouwbaar en snel detecteren afleiden transcriptionele startpunten en RNA verwerking gebeurt (bijvoorbeeld door toxine-antitoxine systeemcomponenten) in S. aureus, E. coli en andere bacteriën.

Inleiding

Primerverlenging ¹ is een moleculaire methode uiteinden van specifieke RNA-moleculen van de 5 'bepalen tot een basisresolutie. Het voordeel van andere methoden, zoals 5'-RACE (snelle amplificatie van cDNA uiteinden) is de snelle doorlooptijd en de mogelijkheid om een ​​mengsel van verschillende lengtes van RNA-moleculen gemakkelijk analyseren.

Deze methode werkt door het onderwerpen RNA moleculen transcriptiereacties keren met specifieke fluorescente primers genereren cDNA fragmenten van bepaalde lengte. Deze cDNA-moleculen worden uitgevoerd naast de traditionele Sanger sequencing reacties ² op denaturerende polyacrylamide gelen en kan worden gedetecteerd door de fluorescentie door het gebruik van fluorescent gemerkte primers. De lengte van de cDNA-fragmenten worden vervolgens beoordeeld in vergelijking met de sequentie ladder, waardoor het in kaart brengen van het 5'-RNA uiteinden.

Traditioneel worden primerverlengingsreacties in combinatiemet radioactieve isotopen cDNA moleculen op röntgenfilms detecteren. Door gezondheid, kwesties afvalverwerking en gebruiksgemak, nieuwere protocollen gebruiken fluorescentie voor de detectie van de primerverlenging met automatische sequencers, hoewel de gevoeligheid iets lager. Met fluorescent gelabelde primers, kan de terugkerende radioactieve labeling procedure worden weggelaten, als fluorescerende primers zijn stabiel gedurende lange tijd (meer dan een jaar in onze handen).

De hier beschreven werkwijze maakt gebruik van een geautomatiseerde sequencer gel, maar met lichte wijzigingen kunnen capillaire sequencer ook worden gebruikt voor de cDNA scheiding en detectie ^3. Het parallellisme gel analyse maakt het mogelijk om zelfs een kleine hoeveelheid RNA splitsing of verwerking detecteren. Een ander voordeel is de hoge resolutie van deze werkwijze, als eindstandige splitsing en verwerking van zelfs één base kan worden gedetecteerd.

Met betrekking tot de detectie van RNA splitsing of verwerkingen typically twee verschillende primer extensions onderscheiden. In één geval wordt de enzymatische behandeling uitgevoerd in vitro met gezuiverde RNA en gezuiverd enzym, terwijl in het andere geval wordt de verwerkingen in vivo en de resulterende RNA wordt gezuiverd. In beide gevallen het RNA onderworpen aan een primer extensie in vitro uitgevoerd, echter afhankelijk van de bron van RNA, wordt de werkwijze ofwel genoemd in vitro of in vivo primer extensie. In het protocol hier geïntroduceerde richten we alleen op in vivo primerverlenging, vanwege het gebruiksgemak (niet gezuiverde eiwitten nodig) en de mogelijkheid om transcriptionele startpunten en verwerking uit te tegelijkertijd. In vitro primerverlengingen in principe ingesteld op dezelfde manier en dit protocol kan dienen als uitgangspunt.

De werkwijze hier afgebeelde kan worden toegepast op vele bacteriesoorten zolang ze vatbaar hoogzuiverheid en hoge opbrengst bereiden van nucleïnezuren.

Het onderzoek in ons lab richt zich op het regelgevend kader van toxine-antitoxine (TA) systemen ^{van 4,5,} een terrein waarop de primer extension method grote schaal wordt gebruikt. TA-systemen zijn kleine genetische elementen in prokaryotische genomen dat bestaat uit een stabiele en endogeen actief toxische eiwit en een meestal onstabiel eiwit of RNA antitoxine die toxiciteit ^6,7 tegengaat. Toxine activiteit wordt soms uitgeoefend door remming van de replicatie, celwand synthese of andere mechanismen, maar meestal door RNase activiteit ^8,9. Typisch wordt RNase specificiteit bepaald door het uitvoeren van verschillende tests, waaronder de primer extensie methode. Primerverlengingsreacties zijn geschikt voor deze toepassing, als een mengsel van volledige lengte gesplitst en fragmenten tegelijkertijd worden geanalyseerd om te bepalen hun 5 'einden. Een mix van in vitro en in vivo primer extensions, despecifieke toxine RNase splitsing, bijvoorbeeld sequentie specificiteit te bepalen ^10-13.

Figuur 1. Overzicht van primerverlenging procedure. Bacteriële kweken worden geïncubeerd en behandeld volgens de experimentele behoeften. Totaal RNA wordt geëxtraheerd uit de cellen, behandeld met DNase I bij DNA sporen te verwijderen en onderworpen aan een reverse transcriptie reactie met doelspecifieke fluorescente DNA primers hetgeen cDNA. Genomisch DNA of plasmiden worden geëxtraheerd en vervolgens gebruikt voor fluorescerende Sanger sequentiebepaling reacties voor maat vergeleken met de cDNA-fragmenten. Primerverlengingsproducten worden omzomen Sanger sequentiebepaling producten op een denaturerende ureum polyacrylamidegel en geanalyseerd met een geautomatiseerde laser en microscoop. De sequencing basis die lijn staat met de cDNA band is de last basis van de 5 'cDNA (blauwe pijl). Meer informatie in Fekete, et al. ³ Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Een overzicht van de gehele primerverlenging procedure is te vinden in figuur 1. In het kort, bacteriële cellen worden gekweekt, geoogst, de cel pellet gelyseerd en het RNA geëxtraheerd. Gezuiverd RNA wordt vervolgens behandeld met DNase I om sporen van DNA moleculen die kunnen fungeren als sjablonen voor de reverse transcriptase verwijderen. Specifieke fluorescerende primers worden toegevoegd aan het RNA gehybridiseerd aan het gebied van belang en vervolgens reverse getranscribeerd, waardoor enkelstrengs complementair DNA (cDNA). Een sequentie ladder wordt gemaakt door traditionele Sanger sequentiebepaling gebruik fluorescente primers en gescheiden op een denaturerende polyacrylamide gel naast het primerverlengingsproduct cDNA fragmenten. Het resulterendegel geanalyseerd door vergelijking van de fluorescerende banden, waardoor de identificatie van uiteinden van belang de 5 '. Transcriptionele uitgangspunten en verwerking sites worden vervolgens individueel door sequentievergelijkingen beoordeeld.

Protocol

1. High Yield RNA Voorbereiding

1. RNA Isolation
   OPMERKING: Hoge concentraties van totaal RNA zijn nodig voor de primerverlengingsreactie. Spinkolom kits meestal niet de hoeveelheid RNA benodigde verkregen (~ 5-16 ug in 5 pl volume). Daarom zuivering met zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie methode wordt aanbevolen, hieronder beschreven.
   OPMERKING: Fenol is kankerverwekkend, giftig en corrosief. Lees de Material Safety Data Sheets en te gebruiken onder een zuurkast met adequate bescherming!
   1. Groeien of behandelen bacteriële cellen (S. aureus en E. coli in dit voorbeeld) naar wens en oogsten door 10 min centrifugeren bij 4600 x g en 4 ° C. Opmerking: Typisch oogsten we totaal _OD600 van 20 - 70. De celpellets worden opgeslagen gedurende verscheidene weken bij -20 ° C.
   2. Resuspendeer de celpellet in 1 ml zuur guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform-oplossing en naar een2 ml schroef kop met 0,5 ml van 0,1 mm zirkonium glas / silica beads.
   3. Lyse de cellen drie keer in een snelle prep / bead beater op 6,5 m / sec gedurende 30 seconden voor drie rondes, de koeling van de monsters op ijs gedurende 5 minuten na elke run. Opmerking: gehomogeniseerde monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele weken.
   4. Incubeer lysaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en voeg 200 pl chloroform.
   5. Krachtig schudden of vortex het monster gedurende 30 seconden om RNA te extraheren.
   6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min centrifugeer 15 minuten bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C. Opmerking: Oplosmiddelen worden gescheiden in een onderste organische fase (roze, bevat eiwitten), een interfase (wit bevat DNA) en een bovenste waterige fase (heldere, bevat RNA).
      LET OP: Vanaf deze stap op het gebruik alleen RNase vrije reagentia en plastic ware!
   7. Bereid verse RNase-vrij 1,5 ml reageerbuisjes, label op de juiste wijze en voeg ongeveer 500 pi van 100% RNase vrij isopropanol elke (gebruik ongeveer dezelfde volume als de waterige fase in de vorige buis).
   8. Houd de buis onder een hoek om en breng de waterige fase (ongeveer 500 ul) om de vervaardigde buizen met behulp van RNase gratis tips. Laat de interfase niet storen.
   9. Precipiteren de RNA door meerdere keren inverteren en incuberen gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
   10. Centrifugeer de monsters gedurende 15 min bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C en verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie (waterstraal pomp en zuigfles). Laat de witte transparante RNA pellet op de bodem niet verstoren.
   11. Voeg 1 ml van 70-80% RNase ethanol (niet vortex) te wassen. Opmerking: RNA in ethanol kan worden opgeslagen gedurende verscheidene weken bij -20 ° C.
   12. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7500 x g en 4 ° C en verwijder supernatant door pipetteren of bij voorkeur aspiratie.
   13. Lucht drogen RNA pellet voor 15-30 min onder de zuurkast. Niet Kreukherstellend, kan anderszins pellets moeilijk om opnieuw op te lossen zijn.
   14. Resuspendeer de pellet in 50 gl RNase vrij DDH ₂ O of RNA opslagbuffer.
   15. Meet RNA-concentratie met een microvolume UV-Vis spectrofotometer of een kwartscuvette (en conventionele fotometer) en ga verder met DNase I spijsvertering.
2. DNase I digestie van RNA om sporen DNA te verwijderen
   OPMERKING: Aangezien DNA kan als een matrijs in de valse reverse transcriptie (primer extensie) reacties, moet uit het monster worden verwijderd. Verscheidene werkwijzen voor het verwijderen van DNA van RNA oplossingen beschikbaar die meestal afhankelijk DNase spijsvertering. Een eenvoudige maar effectieve en kostenefficiënte methode voor DNA-verwijdering wordt hieronder uiteengezet.
   1. Verwarm waterbad tot 37 ° C.
   2. Meng de in tabel 1 opgesomde verbindingen in een 1,5 ml reageerbuis.
   3. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 ° C in een waterbad, en vervolgens direct doorgaan naar de fenol / chloroform extractie. Opmerking: Hitte inactivatie van het DNase I wordt niet aanbevolen, omdat dit de RNA zou degraderen.
3. Fenol / chloroform extractie van RNA na DNase I Spijsvertering
   OPMERKING: De RNA moet worden gezuiverd om vrije nucleotiden, DNA fragmenten en buffercomponenten van de DNase I digestie verwijderen. Fenol / chloroform extractie zorgt voor hoge terugwinning en concentratie van het RNA monster en daarom hieronder beschreven. Andere werkwijzen voor RNA zuivering kan ook worden gebruikt indien zij aan deze eisen.
   1. Split 500 ul DNase I digestie mengen in twee 250 ui monsters in 2 ml reageerbuizen.
   2. Voeg 1 volume (250 pl) van zure P / C / I oplossing (in water verzadigde fenol, chloroform en isopentanol, verhouding 25: 24: 1, pH 4,5-5).
      OPMERKING: P / C / I oplossing is kankerverwekkend, giftig en corrosief. Lees de Material Safety Data Sheets en te gebruiken onder een zuurkast met adequate bescherming!
   3. Krachtig vortex of plaats in een vortexen platform voor 1-3 min.
   4. Centrifugeer 30 minuten bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C.
   5. Verzamel de bovenste (waterige) fase en over te dragen aan nieuwe buis (250 ul).
   6. Voeg 1/9 volume (28 pl) van 3 M natriumacetaat pH 5,2.
   7. Voeg 2,5-3 eenheden zuivere ethanol (700 ul).
   8. Meng door vortexen kort en plaats bij -80 ° C gedurende 30 minuten of bij -20 ° C gedurende 2-3 uur. Indien nodig, slaan de RNA O / N bij -20 ° C.
   9. Centrifugeer 30-60 minuten bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C.
   10. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
   11. Was de pellet door toevoeging van 1 ml van 70% ethanol op de pellet. Doe niet vortex monster.
   12. Centrifugeer monster gedurende 5 min bij 13.000 - 15.000 x g en 4 ° C.
   13. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
   14. Lucht drogen pellet onder de zuurkast. Bewaar de pellet bij -20 ° CO / N indien nodig.
   15. Los het pellet in 30 pl DEPC behandeld _H2O door vortexen gedurende 2 min en deze oplossing pe lossenllet van de overeenkomstige tweede buis per monster (30 ul oplossing per één extractie paar).
   16. Meet RNA-concentratie, en ervoor te zorgen dat het hoger is dan 1 ug / ul voor gebruik in primer uitbreiding van gemiddeld uitgedrukt mRNA's.
   17. Indien nodig, slaan het RNA bij -20 ° C gedurende enkele weken tot enkele maanden.

2. primerverlengingsreactie

1. Primer ontwerp
   OPMERKING: Bij het ontwerpen van primers voor een primer extensie experiment, gehoorzamen algemene richtlijnen van de PCR-primer ontwerp (zie de handleiding bij de geautomatiseerde gel sequencer voor meer informatie en discussie sectie in dit document).
   1. Specifiek zorgen dat de primers (i) niet runs basen bevatten, (ii) bezit een G of C aan het 3 'uiteinde, (iii) een evenwichtig GC: AT verhouding, (iv) een annealing temperatuur van 55-60 ° C en (v) binden ten minste 50 bp, beter 100 bp stroomafwaarts van het gebied van belang om duidelijke beelden te ontvangen.
2. Primerverlengingsreactie
   OPMERKING: De primer extensie reactie (cDNA synthese) vereist grote hoeveelheden template RNA. Als de hoeveelheden RNA gebruikt worden gekozen om laag is, kan het signaal te laag op te sporen! Wij adviseren daarom de zuivering van het RNA, zoals hierboven beschreven.
   OPMERKING: LET OP: Gebruik RNase vrij reagentia en plastic ware !!!
   1. Verwarm de thermocycler een temperatuur van 95 ° C en het uitvoeren van alle verdere incubatie stappen in een thermocycler voor gebruiksgemak en reproduceerbaarheid.
   2. Meng de verbindingen van tabel 2 in een PCR-buis voor elk RNA-monster.
   3. Denatureren de monsters gedurende 1 min bij 95 ° C.
   4. Plaats de buizen op ijs en kou voor 5 min naar RNA's en primers hybridiseren.
   5. Stel de PCR machine tot 47 ° C.
   6. Ondertussen bereidt de reverse transcriptie master mix zoals beschreven in Tabel 3.
   7. Voeg 4 ul van reverse transcriptie master mix aan elkaar gehybridiseerd RNAmonster.
   8. Incubeer de buizen gedurende 1 uur bij 47 ° C. Opmerking: De optimale temperatuur voor AMV RT 42 ° C, maar hogere temperaturen helpen om secundaire structuren van de RNA-moleculen te overwinnen.
   9. Stop de reactie door verhitting van de monsters tot 95 ° C gedurende 2 min.
      OPMERKING: Formamide is corrosief, giftig en kan schadelijk zijn voor het ongeboren kind. Lees de Material Safety Data Sheets, met zorg te behandelen en draag geschikte bescherming!
   10. Voeg 6 pl formamide ladingskleurstof (95% (v / v) gedeïoniseerd formamide, 10 mM EDTA, 0,05% (w / v) broomfenolblauw) en opslag voor O / N tot twee weken bij -20 ° C in het donker.

3. Bereiding van het Sequencing Ladder

OPMERKING: De sequencing ladder reactie vereist hetzij matige hoeveelheden plasmiden of grote hoeveelheden genomische DNA. Waar mogelijk, wordt het gebruik van plasmiden in de opeenvolging reactie aanbevolen omwille van het gemak van het isolement en hoge signal intensiteit. In andere gevallen, we routinematig een werkwijze van Marmur ^5,14 aangenomen om genomisch DNA van E. voorbereiden coli en S. aureus cellen zonder fenol gebruiken. In principe elke werkwijze die grote hoeveelheden en zuiverheid van genomisch DNA oplevert worden gebruikt.

1. Genomisch DNA Isolation
   1. Kweek 10 ml van E. coli of S. aureus O / N in LB, BM ⁵ of TSB medium.
   2. Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 4600 x g in een 15 ml Falcon buis.
   3. Pellet geresuspendeerd in 2 ml buffer P1 zoals in sommige mini voorbereiding kits (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 ug / ml RNase A).
   4. Lyse cellen gedurende 45-60 minuten bij 20-40 gl lysostafine (0,5 mg / ml, opslag bij -20 ° C). Opmerking: Voor E. coli cellen de enzymatische voorbehandeling kan ofwel worden weggelaten of lysozyme gebruikt.
   5. Voeg 100 ul van verzadigde SDS-oplossing (in 45% ethanol) om de schorsing en incubate gedurende 5 min bij 37 ° C.
   6. Voeg 650 ul 5 M NaClO ₄ en de kort vortex cellen.
      OPMERKING: Chloroform is een potentieel carcinogeen. Lees de Material Safety Data Sheets en te gebruiken onder een zuurkast met adequate bescherming !!!
   7. 3 ml chloroform / isopentanol (24: 1 verhouding) aan het mengsel en schud gedurende tenminste 60 sec. Opmerking: De vloeistof moet veranderen in een homogene witte emulsie.
   8. Centrifuge monster gedurende 10 minuten bij 4600 xg en RT om de fasen te scheiden.
   9. Dragen de duidelijke bovenste (waterige) fase zorgvuldig naar een nieuwe buis. Als oplossing troebel, herhaal de chloroform / isopentanol extractie. Meet het volume van de DNA-oplossing en stelt een nieuwe buis met 2 volumina ethanol (100%).
   10. Langzaam decanteren of pipet de DNA-oplossing in de ethanol die buis. Opmerking: DNA moet zo transparant, dichte spoelen op de bodem of als volledig uitgedroogd als een zwevende witte cluster neerslaan.
   11. Haal de DNA met haken van glas Pasteur pipetten (figuur 2) en tweemaal wassen elk monster door dompelen in een afzonderlijke buis van 1 ml van 70% ethanol.
   12. Plaats de haken rechtop in een rek en de lucht droog de pellet gedurende 60 min. Sla zonodig de gedroogde DNA enkele dagen bij kamertemperatuur.
   13. Ontbinden DNA door het afbreken van de DNA bedekt glas haken en het plaatsen in een 2,0 ml reactie buis met 100-500 ul DDH ₂ O. Stel het volume op een definitieve DNA-concentratie van 1.000 - 1.500 ng / ul. Voor een sequentiebepalingsreactie Gebruik 10-18 ug genomisch DNA.

Figuur 2. Instructie over hoe een DNA hengel te maken. Houd de punt van een glazen Pasteur pipet in de vlam van een bunsenbrander. Hierdoor wordt de glazen beginnen smelten na enkele seconden, waardoor een kleine haak thij beëindigen. Snel te verwijderen van de vlam en laat afkoelen gedurende 1 min.

2. Plasmide Isolation
   1. Bereid plasmiden met standaard mini voorbereiding kits en oplossen in elutiebuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5). Afhankelijk van de grootte plasmide, gebruikt 100-500 ng plasmide voor een ladder sequencing.
3. Sanger Sequencing reactie
   OPMERKING: Hieronder vindt u een eenvoudig protocol dat een fluorescent gelabelde primer sequencing kit gebruikt met 7-deaza-dGTP die goed werkt voor de primer extensie. Raadpleeg de sequencing kit handleiding voor gedetailleerde informatie. Let op de sequencing reactie dezelfde primer dient als de primerverlengingsreactie op producten van dezelfde lengte te maken.
   1. Meng 12 ui genomisch DNA (~ 10-15 ug) met 1 pl DMSO en 1 pl fluorescent gelabelde primer (2 pmol / pl).
   2. Aan elk 1 gl van de vier sequentiebepaling reactiemengsels (A, C, G of T), voeg 3 ul van de DNA / DMSO / Primer mix.
   3. Plaats de monsters in een PCR-machine, en voer de volgende PCR-programma: 95 ° C gedurende 2 minuten; 35 cycli van 95 ° C gedurende 20 sec, 54 ° C gedurende 20 sec, 70 ° C gedurende 30 seconden; houden bij 4 ° C voor altijd.
   4. Na de run, verwijder de monsters uit de machine, voeg 6 pi laadkleurstof en op te slaan op ijs (korte termijn) of bij -20 ° C gedurende enkele dagen tot weken.

4. Gel Setup en Apparatus Run

OPMERKING: Gedetailleerde informatie over de manier waarop de sequencing gel apparaat wordt gemonteerd, wordt de gel voorbereid en hoe de gel wordt gerund kan worden gevonden in de fabrikant protocol.

1. Voorbereidingen
   1. Bereid 10x TBE overeenkomstig tabel 4.
   2. Op de dag van de gel run bereiden 1 liter 1x TBE buffer met ultrapuur DDH ₂ O.
   3. Bereid 10% (w / v) APS. Opmerking: Kan worden opgeslagen in 200 gl aliquots bij -20 ° C gedurende verscheidene maanden, maar de activiteit kan afnemen in de tijd <./ Li>
2. Vergadering van gel gieten kamer
   1. Vermijd stof en vuil tussen de glasplaten. Daarom grondig schoon werken oppervlakken met behulp van vochtige doekjes.
   2. Reinig een paar 25 cm glasplaten met wegwerp papieren handdoeken en gedestilleerd water aan beide zijden en isopropanol voor de binnenzijde van de glasplaten.
   3. Plaats 0,25 mm spacers op de achterste glasplaat en laat de schuine glazen bovenplaat (figuur 3).
   4. Bevestig de gel rails aan beide zijden van de glazen platen met de inkeping en de intrede rail piloten naar boven en draai knoppen licht.

Figuur 3. explosieaanzicht van de gelelektroforese glasplaten. Glasplaten dient directioneel gebruikt. Zorg ervoor dat de binnenzijde van de glasplaten naar binnen en het buitenvlakkant naar buiten.

Figuur 4. Weergave van een samengestelde gel inrichting. Na de toediening van de geloplossing, de zak afstandhouder wordt geplaatst in de oplossing tussen de glasplaten. De casting plaat wordt vervolgens gleed tussen de voorste glasplaat en de gel rails en beveiligd door de bevestiging van de rail knoppen.

3. Het gieten van de gel
   OPMERKING: niet gepolymeriseerde acrylamide is neurotoxisch! Lees de Material Safety Data Sheets en te gebruiken met een passende bescherming !!!
   1. Voeg de in tabel 5 opgesomde verbindingen in een beker en meng met een roerstaaf en een magneetroerder.
   2. Onmiddellijk na het toevoegen van APS en TEMED, het nemen van de gel-oplossing in een spuit van 50 ml en plaats een 0,45 nm filter op het puntje.
   3. Ofwel houdt u de bovenste rand van de glazen plaat met een hand of plaats de sandwich in een gel gieten staan ​​om een ​​helling schuin 10 te creëren - 20 °.
   4. Langzaam afzien de geloplossing tussen de glasplaten onder voortdurend bewegen van de spuit van de ene zijde naar de andere en stoppen zodra de geloplossing aan de onderkant.
   5. Verplaatsen naar de zijkant of volledig te verwijderen enig gevormd bellen met behulp van een zeepbel haak.
   6. Schuif de gel pocket afstandhouder (0,25 mm) tussen de glasplaten aan de inkeping, onderdompelen in de geloplossing en bevestig door aan het gieten plaat.
   7. Bouten bovenste rail lichtjes (Zie Figuur 4 voor een volledig geassembleerde toestellen).
   8. Laat gel set voor 1-2 uur.
   9. Verwijder de casting plaat en pocket spacer en reinig de zak van zout en gel resten.
   10. Spoelen met DDH ₂ O en veeg overtollige oplossing met papieren zakdoekjes.
4. Hardlopen en het visualiseren van de gel
   OPMERKING: De sequentiegels worden direct onderworpen aan elektroforese in de gel imager, terwijlde fluorescentie gelijktijdig gedetecteerd door een laser microscoop. In tegenstelling tot conventionele gelelektroforese, waarbij de gel eerst wordt uitgevoerd en daarna gekleurd en gevisualiseerd, wordt de detectie-eenheid vast en scant de banden in real time als ze passeren de laser. Onderstaand een procedure voor de ImagIR Dataverzameling software op OS / 2 is geschetst, die aan meer recente versies kunnen worden aangenomen. Voor meer informatie zie de handleiding.
   1. Schuif de buffertank houder in de gel rails aan de voorzijde glasplaten en draai de knoppen.
   2. Plaats gel in de onderste gel tank van de geautomatiseerde gel imager tegen de verwarming plaat en bevestig door te schuiven het spoor toegang piloot in het toestel beugels.
   3. Vul 1x TBE buffer in de onderste en bovenste gelbuffer kamers, sluit de lagere buffer kamer en sluit de bovenste bufferruimte om de stroom met het netsnoer.
   4. Indien aanwezig, het reinigen van de gel zak van zout-residu's door herhaaldelijk pipetteren buffer in de pocket.
   5. Sluit de bovenste buffertank kamer met behulp van de bovenste buffer deksel.
   6. Sluit de deur van de automaat en schakel de imager en de computer en start de Base ImagIR Dataverzameling software.
   7. Maak een nieuw project bestand (Bestand> Nieuw ...), voert een project bestandsnaam, selecteer de juiste laser ranges (700 of 800 nm) en bevestig met OK.
   8. Selecteer Opties> Auto gain ... uit het beeld menu bovenaan, klik op Automatisch om de automatische gain meting te starten en de instellingen te accepteren door op OK te klikken.
   9. De focus van de laser door het selecteren van opties-> Focus ... van de scanner controle menu te klikken op de knop Auto en het accepteren van de instellingen door te klikken op OK.
   10. Herhaal de automatische versterking procedure aan te passen aan de nieuwe aangescherpte regio.
   11. Setup de scanner controle volgens deze instellingen: 2000 V, 35 mA, 45 W, 45 ° C, Scan filter: 3, Scan snelheid: 3.
   12. Voorloop de lege gel gedurende 20 minuten (select spanning op en druk op ).
   13. Ondertussen verwarm de sequentie ladder en de primerverlengingsproducten in een PCR machine gedurende 2 min tot 90 ° C, vervolgens afgekoeld op ijs.
   14. Stop de elektroforese, opent u de geautomatiseerde gel sequencer en verwijder de bovenste buffertank deksel.
   15. Steek de haaientand-kam in tussen de glasplaten en iets doorboren de gel met de haaientanden (zie figuur 5).

Figuur 5. Close-up bekijken van gel met haaientand kam. Steekproef (paars) wordt toegepast tussen de haaientanden.

16. Pipette ofwel 1-2 pl van de primerextensieproducten of sequencing ladder reacties in elkaar gel pocket (gevormd door de haaientanden).
17. Als niet alle zakken nodig zijn, vul lege zakken met laadkleurstof om te voorkomen dat inconsistente loopgedrag.
18. Sluit de buffertank en de deur van de gel sequencer.
19. Start elektroforese en zet laser (Select spanning op en Laser ON en druk op ).
20. Stop elektroforese eenmaal regio van belang de laser is gepasseerd.

Resultaten

Zoals weergegeven in figuur 6, kan een primer extensie reactie worden gebruikt om de transcriptionele startpunten van transcripten van belang te bepalen en kan helpen om promotergebieden afleiden (gewoonlijk aangeduid met -10 en -35 elementen). De bovenste (langste) cDNA fragment representeert het uiteinde van het mRNA 5 en kan dus gemakkelijk worden toegewezen in vergelijking met de sequentie ladder.

Discussie

Fluorescerende primer extensie is een eenvoudige en snelle werkwijze voor het bepalen uiteinden van de RNA 5 ', zowel voor TSP- of secundaire RNA processing identificatie. Door het gebruik van fluorescente primers, kan de reactie worden opgezet en uitgevoerd zonder extra veiligheidsmaatregelen (anders dan bij radioactief gemerkte primers). De monsters worden gedetecteerd door fluorescentie, kunnen ze worden afgebeeld terwijl de elektroforese wordt uitgevoerd die een snelle analyse mogelijk maakt in vergelijking met ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl)	NEB / Roche	NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free)	Ambion (life technologies)	AM2222
FastPrep-24 Instrument	MPBio	116004500
Fluorescently labeled primers	Biomers	n/a	5’ DY-681 modificatie van “gewone” DNA oligonucleotiden. Compatibele kleurstoffen zoals de LICOR IRDye 700/800 zijn ook verkrijgbaar bij andere leveranciers zoals IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software	Li-Cor		Product stopgezet
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Nuclease free water	Ambion (life technologies)	AM9915G
Plasmid mini preparation kit	QIAGEN	12125
RapidGel-XL-40% Concentrate	USB	US75863
RNA STORAGE BUFFER	Ambion (life technologies)	AM7000
Roti-Aqua-P/C/I	Carl Roth	X985.3	Alternatief: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)” van Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor	Ambion (life technologies)	AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP	GE Healthcare	RPN2538
TRIzol reagent	life technologies	15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm	BioSpec	11079101z