Methodenartikel

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

DOI:

10.3791/52141

⸱

17 december 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, 2Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwarslaesie is een traumatische aandoening die ernstige morbiditeit en hoge sterfte veroorzaakt. In dit werk beschrijven we in detail een kneuzing model van dwarslaesie bij muizen, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruggenmergletsel is een verwoestende aandoening klinisch gekenmerkt door een complex van neurologische stoornissen. Diermodellen van ruggenmergletsel kan zowel de biologische reacties op letsel te onderzoeken en mogelijke therapieën te testen. Kneuzing of compressie verwonding geleverd aan het chirurgisch blootgestelde ruggenmerg zijn de meest gebruikte modellen van de pathologie. In dit rapport worden de experimentele kneuzing wordt uitgevoerd met behulp van de oneindige horizon (IH) Impactor apparaat, dat de oprichting van een reproduceerbare letsel diermodel doorlaat definitie van specifieke letsel parameters. Stamceltransplantatie wordt algemeen beschouwd als een potentieel bruikbare strategie voor de genezing van deze invaliderende aandoening. Talrijke studies hebben de effecten van transplanteren verschillende stamcellen geëvalueerd. Hier laten we een aangepaste methode voor ruggenmergletsels gevolgd door staartader injectie van cellen in CD1 muizen. Kortom, bieden wij de procedures voor: i) de cel etikettering wiste een vitale tracer, ii) pre-operatieve zorg van muizen, iii) uitvoering van een contusive dwarslaesie, en iv) intraveneuze toediening van post mortem neurale precursoren. Dit contusie model kan worden gebruikt om de werkzaamheid en veiligheid van stamceltransplantatie in een regeneratieve geneeskunde aanpak te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een dwarslaesie (SCI) is de meest voorkomende letsel veroorzaakt door hoge-energie-trauma zoals motorvoertuigen ongevallen, vallen, sport en geweld 1. In ernstige SCI, de schade kracht vernietigt of schade zenuwweefsel, waardoor plotseling verlies van neurologische functie. Traumatische SCI komt vaak voor bij jonge volwassenen tussen de 10 en 40 jaar oud. Het grote invloed op de patiënt mentale en fysieke conditie en veroorzaakt enorme economische impact op de samenleving 2. De benadering van de behandeling in de acute fase is vaak beperkt tot een hoge dosis corticosteroïden, chirurgische stabilisatie en decompressie om eventueel verzwakken verdere schade 3-4, maar de rollen van deze methoden op het bewegingsapparaat herstel na SCI zijn nog steeds controversieel. Naast acute weefselverlies, de traumatische verwonding en de activatie van secundaire mechanismen van degeneratie veroorzaakt demyelinisatie en dood van meerdere celtypen 5-6. De mate van herstel van de functie kan vantien worden gecorreleerd aan de mate van gespaard witte stof op het letsel plaats 7.

Diermodellen van SCI kan worden gebruikt zowel om de biologische responsen van het weefsel schade onderzoeken en mogelijke therapieën te testen. Bovendien is een nuttig dier model van een menselijk pathologie heeft niet alleen om een ​​aantal aspecten van die voorwaarde te reproduceren, maar moeten ook voordelen ten opzichte van directe klinische observatie en experiment bieden. De meest gebruikte modellen van dwarslaesie betrekken kneuzing of compressie letsel geleverd aan het chirurgisch blootgesteld ruggenmerg 8. De ontwikkeling van een gecontroleerde gewicht neerzetten contusieletsel vertegenwoordigt een belangrijke mijlpaal in de geschiedenis van SCI onderzoek. The Ohio State University ruggenmerg onderzoekscentrum heeft de technologische uitdaging van een inrichting die kan worden gebruikt om een bepaalde samendrukking van het ruggenmerg met parameters van invloed komputergestuurde 9 induceren nagestreefd. Dit werd oorspronkelijk ontworpen voor gebruik with ratten; werd later aangepast toepassen richting muizen 10. De voordelen van een dergelijke benadering zijn dat de biomechanica schade meer kan worden bestudeerd en de parameters van de schade kan een vollediger wijze gedefinieerd om een ​​reproduceerbaar experimenteel model te verkrijgen, waardoor deze nauwkeuriger beoordeling van de effecten van geteste behandelingen op het functioneel herstel proces.

Vele studies hebben de effecten transplantatie van diverse stamcellen in SCI modellen 11 geëvalueerd. We hebben onlangs geïsoleerd volwassen neurale stamcellen uit de Sub-ventriculaire zone (SVZ) enkele uren na de dood van de muis donor 12-13. Deze procedure voorziet in een populatie van neurale stamcellen, de zogenaamde post-mortem neurale precursors (PM-NPC), die lijken voordelig in een regeneratieve geneeskunde aanpak voor het genezen van SCI te zijn. In dit artikel zullen we laten zien: i) het protocol voor mobiele etikettering met de vitale tracer PKH26, ii) de surgsche procedure uit te voeren op traumatische SCI, en iii) de intraveneuze (iv) toediening van gemerkte cellen. Bovendien is in dit werk tonen we aan dat getransplanteerde cellen migreren ruggenmerg laesie plaatsen en differentiëren meestal in microtubule geassocieerd proteïne (MAP) 2 positieve cellen. Bovendien is de differentiatie gepaard met de bevordering van een stabiele herstel van achterste ledematen functie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle procedures werden goedgekeurd door de Commissie van Toezicht van de Universiteit van Milaan en ontmoette de Italiaanse Richtlijnen voor Proefdieren in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van november 1986 (86/609 / EEG).

1. Bereiding van Cellen voor Transplantatie

OPMERKING: Gebruik neurale stamcellen tussen de 5e en de 9e passage in de cultuur van deze experimenten; Test de kweken proliferatie en differentiatie vermogen alvorens gelabeld voor transplantatie. Bepaal de mate van differentiatie door immuuncytochemie 12.

  1. Resuspendeer cellen tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen / 150 ul (transplantaat 1 x 10 6 cellen per muis). Maak minstens 1,2 x 10 6 cellen per muis omdat een overmaat van cellen vereist voor spuit topflap.
  2. Was de cellen 3 maal met neurale stamcel medium 13 in een 10 ml conische flacon. In elkwasstap precipitaat cellen door centrifugatie (500 xg gedurende 5 min, kamertemperatuur).
  3. Tel de cellen voor de laatste draai.
  4. Centrifugeer de cellen (500 xg gedurende 5 minuten) en zuig de supernatant voorzichtig alle cellen niet te verwijderen maar waarbij niet meer dan 25 pl supernatant.
  5. Bereid 2x celsuspensie door toevoeging van 1 ml Diluent C aan de cel pellet en resuspendeer met zachte pipetteren.
  6. Onmiddellijk voor kleuring, stelt een 2x Dye Solution (4 x 10-6 M) in Diluent C door 4 pl van de PKH26 ethanol kleurstofoplossing 1 ml Diluent C in een buis en meng goed te dispergeren.
  7. Snel voeg 1 ml 2x celsuspensie 1 ml 2x Dye Solution en het monster onmiddellijk meng door pipetteren (uiteindelijke celdichtheid wordt 1,2 x 10 7 cellen / ml en 2 x 10-6 M PKH26).
  8. Incubeer de cel / kleurstof suspensie voor 1-5 min.
  9. Stop de kleuring door toevoeging van een gelijk volume (2ml) van 1% BSA-oplossing in HBSS en incubeer gedurende 1 min.
  10. Centrifuge cellen (500 g gedurende 10 min) en verwijder voorzichtig het supernatant.
  11. Resuspendeer celpellet in 10 ml HBSS en gecentrifugeerd (500 xg gedurende 5 minuten).
  12. Was de celpellet nog 2 maal met 10 ml compleet medium aan verwijdering van ongebonden kleurstof te verzekeren.
  13. Resuspendeer de celpellet in 10 ml compleet medium voor evaluatie cel herstel cellevensvatbaarheid en fluorescentie intensiteit. Wanneer cellen nodig voor transplantatie, wassen en resuspendeer ze in een steriele fysiologische oplossing bij een concentratie van 3,3 x 10 5 cellen / 50 ul.

2. Voorbereiding voor Heelkunde

  1. Schoon en steriliseer chirurgie apparatuur.
  2. Bereid de operatie gebied schoon met een aseptische middel. Het opzetten van de IH Impactor apparaat.
  3. Bereid de anesthesie-apparatuur: de Active Gas Scavenger met VetScav Wegen van het apparaat, continue stroom inductie kamer, Oxygen Geneterbestuurder, Low Flow O 2 Meter voor Muizen. Reinig de inductie kamer en het masker tijdens chirurgie.
  4. Verdoven van dieren met 2,5% (v / v) isofluraan in zuurstof (1 L / min), en wacht 5 minuten na de stroom inductie voor de drug door te voeren. Controleer of de snorharen zijn spiertrekkingen of als er langzaam achterste ledematen terugtrekking in reactie op knijpen de voetzool. Tijdens de operatie, vermindering van de isofluraan concentratie 2,0% (v / v) isofluraan in zuurstof (1 l / min).

3. Voorbereiding van muizen voor Chirurgie en Transplantatie

  1. Houd de mannelijke volwassene CD1-muizen (25-30 g) gedurende ten minste 3 dagen voor de experimenten in standaard condities (22 ± 2 ° C, 65% vochtigheidsgraad en kunstlicht van 8:00-08:00).
    OPMERKING: De gehele procedure van chirurgische voorbereiding tot het hechten zal ongeveer 40 minuten duren.
    1. Om het dier te identificeren, markeren de staart met behulp van waterbestendig gekleurde inkt.
  2. Gebruik een elektric clipper aan de dorsale haren van de muis te snijden van de hals, over op T2-niveau, om de lumbale gebied.
  3. Steriliseer het bereide met een jodiumoplossing en ethanol (70% in steriel water).
  4. Behandel het dier met een sub-cutane (sc) injectie van 200 ui gentamycine (1 mg / ml in steriele zoutoplossing).
  5. Breng oogheelkundige smeermiddel zowel dierlijke ogen om uitdroging te voorkomen en buprenorfine injecteren (subcutaan, 0,03 mg / kg) om pijn te verlichten.

4. Laminectomie

  1. Plaats de muis op een dia warmer het probleem van onderkoeling tijdens de operatie te voorkomen. Plaats het dier met de dorsale zijde naar boven.
  2. Voeg een verticale insnijding met een scalpel op het gebied van belang van T7 tot T12.
  3. Houd de huid en oppervlakkige vet pad met behulp van standaard pincet (meestal te vinden in de ruimte tussen de 5 e en 6 e thoracale dorsale processen).
  4. Tel het proces in het kader van het schip als T6dan verhuizen naar T7.
  5. Leg een beetje lager onder de ventrale zijde van de muis om de kromming van de wervelkolom te verhogen. Immobiliseren het ruggenmerg door het blokkeren van het met de Graefe pincet.
  6. Snijd de paravertebrale spieren bilateraal uit T7 en T10 wervel niveau met behulp van de scalpel tot het dorsale oppervlak van de lamina contact op met de scalpel tip.
  7. Gebruik de scalpel om afvinken de kruising van T7 tot T10. Stop in de ruimte tussen T8 en T9 stekelige uitsteeksels. Snijd de weefsels tussen de T8-T9 en T9-T10 met de micro schaar.
    1. Gebruik de Rongeur aan het T9-proces te verwijderen. Expose de kruising door voorzichtig weg te schrapen de spierlaag met de micro schaar. Ga door tot het bot wordt blootgesteld.
  8. Gebruik de tang om de spieren van de lamina te verwijderen en open een kleine ruimte tussen de wervels. Steek voorzichtig de micro schaar onder het bot, snijd de lamina aan beide zijden en verwijder dit deel met een pincet.
  9. Verwijder de lamina met de forceps aan het snoer bloot. Zorg ervoor dat u geen gratis of gekartelde botfragmenten achter te laten; verwijder ze met de Rongeur.
  10. Gebruik de kleine tip tang om het periost alsmede alle botfragmenten of spieren die mogelijk in de buurt van de incisie te verwijderen.
  11. Verwijder de bovenste helft van de T9 dorsale proces en ga naar de IH aantikinrichting protocol.

5. IH aantikinrichting Protocol (contusie)

  1. Plaats de muis in het midden van het stabilisatieplatform van de IH Impactor apparaat.
  2. Blokkeren het dier met de twee tanden tang verbonden met de stabilisatie platform door twee gezamenlijke richtarmen (linkerarm voor de borstwervel, rechterarm voor halswervel).
  3. Gebruik de rostrale arm naar de zijrand van het rostrale wervellichaam (T8) grijpen.
  4. Manipuleren de caudale arm op dezelfde wijze als de T10 wervellichaam grijpen.
  5. Plaats de stabilisatie platform in het apparaat en laat de tip (diameter 0,75mm) zo dicht bij het koord mogelijk zonder raken.
  6. Til de tip drie hele slagen voor het starten van de impact.
  7. Voer de kneuzing met het instellen van een kracht van 60 kdyn leveren tegen 100 mm / sec impactor.

6. Hechtingen en Post-zorg

  1. Hecht de incisie met een 4/0 absorbeerbare hechtdraad. Bedek het blootliggende ruggenmerg op de plaats van verwijderd lamina; hechtdraad het weefsel aan de uiteinden van de snede door middel van een kleine naald. Plaats de twee steken onmiddellijk boven en onder de plaats van ruggenmerg blootstelling.
  2. Sluit de huid met behulp van twee of drie Reflex clips zonder knijpen van de onderliggende spieren.
  3. Hydrateren muis na chirurgie met 2 ml zoutoplossing subcutaan geïnjecteerd in de onderrug.
  4. Plaats de muis opnieuw in een voorverwarmde kooi onderkoeling tijdens chirurgische herstel te voorkomen. Plaats kooien op verwarming pads.
  5. Bewaken van de muizen in de acute fase na het letsel door het controleren van degrootte blaas, de hechting en het gewicht dier tweemaal per dag. Knijp voorzichtig in de blaas (twee keer per dag gedurende 7 dagen) om te voorkomen dat de urinewegen van infecties (urine troebel, bloederige of met enige neerslag zou kunnen zijn).
  6. Behandel muizen eenmaal per dag met een zoutoplossing injectie (2 ml gedurende twee dagen na de operatie sc injectie) en antibioticum (gentamycine 0,2 ml; sc injectie) gedurende vijf dagen na beschadiging.
  7. Behandel muizen post-operatieve analgesie met buprenorfine (0,1 mg / kg, tweemaal per dag) gedurende 3 dagen na beschadiging.

7. staartaderinjectie van Cellen

Opmerking: In de volgende stap van de procedure voor het injecteren van de cellen in de staartader wordt aangetoond. Cellen kunnen ook worden toegediend met een intraspinale transplantatie met een stereotaxisch frame 15-16, of in de cisterna magna 17. Het is belangrijk om te overwegen dat andere celtypen kunnen worden getransplanteerd met deze methode, zoals mesenchymale stromale cellen(Bijvoorbeeld beenmerg mesenchymale stamcellen, adipose afgeleide stamcellen, vruchtwater cellen). Bovendien kunnen andere behandelingen zoals nanodeeltjes worden geïnjecteerd via de staartader na ruggenmergletsel.

  1. Gebruik 70% ethanol en PBS om de naald voor gebruik reinigen. Behandel de naald en de spuit alleen met steriele handschoenen.
  2. Resuspendeer de cellen in de reageerbuis en de belasting 75 pi cellen in 0,3 ml injectiespuit (29 G naald en 0,33 cc spuit).
  3. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn binnen de celsuspensie zijn. Houd de spuit in een horizontale positie naar cel sedimentatie te voorkomen.
  4. Plaats de muis onder de warmtelamp aan de staart aderen te verwijden.
  5. Pak de muis en trek het voorzichtig in de muis weerhouder aan de laterale staartader als een smalle blauwe lijn te visualiseren.
  6. Reinig de staart met een alcoholdoekje. Zodra de ader wordt gevisualiseerd, pak de staart ader tussen de middelvinger en de duim van de linkerhand.
  7. Breng de naald aan het oppervlak in een hoek van 15 ° boven de horizon en zorg ervoor dat de schuine kant is up.
  8. Injecteer 50 pi cellen bij een snelheid van 0,33 pl / sec. Na de injectie, vertragen het terugtrekken van de naald 10 sec. Trek de naald langzaam en aandacht besteden aan de mogelijke uitstroom van celsuspensie.
  9. Reinig de spuit als in stap 7.1 tussen de verschillende vrachten.

8. gedragstesten en Hind Limb Functie

  1. Plaats de muis in het open veld.
  2. Evalueer bewegingsapparaat functie en achterste ledematen herstel na kneuzing met het open veld wordt uitgevoerd overeenkomstig de Basso muis schaal (BMS) 18.
    OPMERKING: Neurologische functie moet periodiek worden geëvalueerd, vanaf dag 3 na een blessure voor 4 weken 18.

9. Perfusie

  1. Aan het eind van de experimentele periode, verdoven dieren door een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (65 mg / kg). Gebruik teen wringt om evaluate de anesthesie-niveau en ga pas na de muis niet reageert op de schadelijke stimuli.
  2. Zet het dier vast in liggende positie op een operatie vliegtuig.
  3. Dwars door de omhulling en buikwand net onder de ribbenkast. Scheid de membraan van de lever.
  4. Gebruik de schaar om het membraan gesneden om de borstholte bloot te leggen.
  5. Snij de zijkanten van de ribbenkast tot de sleutelbeenderen.
  6. Gebruik de arterieklem de zwaardvormig kraakbeen klem en plaats de hemostaat over het hoofd.
  7. Houd het onderste derde deel van het hart op een dwarsvlak met de tang. Steek de naald in de linker ventrikel.
  8. Gebruik een vaatklem naar het hart te klemmen. Dit stelt de naald en voorkomt lekkage.
  9. Gebruik de schaar om het rechteratrium snijden.
  10. Laat de PBS te pompen (18 ml / min) door het dier. Handhaaf deze druk over het gehele buffer infuus periode (3-4 min; wat overeenkomt met ongeveer 70 ml PBS). Ga door tot het hart is schoon.
  11. Schakel de kraan aan het fixeermiddel (4% paraformaldehyde in gedestilleerd water, 4% PFA) door de pomp toe. Laat de 4% PFA te pompen door het dier gedurende ongeveer 8-10 min (300 ml). Verhoog geleidelijk de druk tot maximaal 30 ml / min bereikt. Een geharde lever is de beste indicatie van een succesvolle perfusie.

10. Weefsel en -verwerking, histologie en Iimmunohistochemistry

  1. Ontleden ruggenmerg van T5 naar L1. Dan na vast weefsel in 6 ml in 4% PFA (O / N bij 4 ° C).
  2. Doe hetzelfde weefsel in een oplossing met 30% sucrose gedurende 72 uur bij 4 ° C om cryo beschermen en de vorming van kristallen tijdens het invriezen te voorkomen.
  3. Snel vriezen het snoer met behulp van droogijs en op te slaan bij -80 ° C.
  4. Sectie door een cryostaat met 15 urn dikte en secties verzamelen op glasplaatjes en blijven voor immunocytochemie.
  5. Spoel secties met 200 ui PBS per Wlide (3 maal; 5 minuten elk, RT).
  6. Permeabilize elk glaasje met 200 ui 10% NGS en 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij KT.
  7. Spoel secties met 200 ui PBS per dia (3 keer, 5 minuten elk, kamertemperatuur).
  8. Blokkeer niet-specifieke plaatsen met 200 ui blokkerende oplossing slede (5% NGS 0,1% Triton X-100 in PBS) gedurende 30 min (RT).
  9. Incubeer elk glaasje met 200 ui primaire antilichamen O / N bij 4 ° C (verdund antilichaam in 5% NGS 0,1% Triton X-100 in PBS).
  10. Was secties met 200 ui PBS per dia (3 keer, ieder 5 min; RT).
  11. Incubeer met geschikte secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij KT.
  12. Was secties met 200 ui PBS per dia (3 keer, ieder 5 min; RT).
  13. Stain kernen met 200 ui 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml eindconcentratie, 10 min bij kamertemperatuur).
  14. Monteer met behulp van de FluorSave reagens en analyseren door confocale microscopie.
    LET OP: Incontrolebepalingen, primaire antilichamen worden weggelaten en vervangen door equivalente concentraties van onafhankelijke IgG van dezelfde subklasse. Microtubulus geassocieerd eiwit 2 primair antilichaam werd gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het totaal aantal getransplanteerde cellen 1 x 10 6 cellen en is verdeeld in drie opeenvolgende injecties in de staartader. Wij toegediend 3,3 x 10 5 cellen in 50 ui fosfaatbuffer (PBS). De eerste injectie werd de tweede 6 uur later uitgevoerd binnen 30 minuten na een blessure, en de laatste 18 uur na het letsel. De keuze van een termijn van 18 uur na SCI voor toediening PM-NPC werd bepaald door de optimale permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière momenteel 14. Om het effect van stamce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel beschrijven we een methode om een ​​reproduceerbaar model van traumatisch ruggenmergletsel te verkrijgen met behulp van een oneindige horizon Impactor bij een kracht van 70 Kdyne (ernstige). Met een grotere kracht paradigma (80 Kdyne), kunnen we een ernstiger letsel dat nog wordt geassocieerd met een hogere mortaliteit muizen. Om dit probleem te vermijden, kiezen we gewoonlijk een matige kracht paradigma (70 Kdyne) die is gekoppeld aan een herhaalbare laesie met een geleidelijk herstel van functie en lage...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen de economische steun van FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), de “Neurogel-en-Marche” Foundation (Frankrijk), Fondazione “La Colonna”.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PKH26GL-1KT Sigma091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device Precision Systems and Instrumentation, LLCModel 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/mlEurocloneECM0011B1 mg/ml in steriele zoutoplossing
Isoflurane-Vet 250 mlMerialB142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer2Biological InstrumentsHB101-sm-402
Scalpel, maat 10Lance Paragon26920
Kleine Graefe-tang2Biological Instruments11023-14
RongeurMedicon Instruments07 60 07
Micro schaar2Biological Instruments15000-00
Absorbeerbare hechtdraad (4/0)Safil QuickC0046203
Hemostat2Biological Instruments13014-14
Reflex 7 wondclip applicator2Biological Instruments12031-07
7 mm Reflex wondclips2Biological Instruments12032-07
NGSEurocloneECS0200D
Triton X 100Merck Millipore1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2MilliporeAB5622
Alexa Fluor 488InvitrogenA11008
FluorSave Reagent Calbiochem345789
Neurale stamcellen mediumDMEM-F12 medium (Euroclone) bevattend 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0,6% glucose (Sigma-Aldrich), 9,6 g/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6,3 ng/ml progesteron (Sigma-Aldrich), 5,2 ng/ml natriumseleniet (Sigma-Aldrich), 0,025 mg/ml insuline (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml transferrine (Sigma-Aldrich), en 2 μg/ml heparin (natriumzout, graad II; Sigma-Aldrich), bFGF (menselijke recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) en EGF (menselijke recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) 
DMEM-F12EurocloneASM5002
l-glutamineEurocloneECB3000D
glucoseSigma-AldrichG8270-100G
putrescineSigma-AldrichP5780-25G
progesteronSigma-AldrichP6149-1MG
NatriumselenietSigma-AldrichS9133-1MG
transferrineSigma-AldrichT 5391
InsulineSigma-AldrichI1882
Heparine natrium-zoutSigma-AldrichH0200000
bFGFLife TechnologyPHG0024
h-EGFLife TechnologyPHG6045
Spuit 0,33 cc 29 GTerumoMYJECTOR 
buprenorfineSchering Plough SpATEMGESIC
ooggelBausch & LombLIPOSIC

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
  2. Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6(2012).
  3. Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
  4. Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
  5. Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
  6. Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
  7. Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
  8. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  9. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  10. Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
  11. Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
  12. Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
  13. Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
  14. Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
  15. Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
  16. Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963(2014).
  17. Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
  18. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  19. Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
  20. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
  21. Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

neurale stamcellencontusiemodelInfinite Horizon ImpactorstaartveneinjectiecelmarkeringPKH 26 tracerpostmortale neurale precursorenmuizenchirurgiefunctie van de achterpoten

Gerelateerde artikelen