Compleet thymectomie bij volwassen ratten met niet-invasieve Luchtpijpintubatie

Samenvatting

Thymectomie bij knaagdieren is een waardevolle techniek in immunologisch onderzoek. Hier wordt een protocol voor volledige thymectomie bij volwassen ratten beschreven, waarbij een mini-sternotomie wordt gebruikt, samen met niet-invasieve intubatie en beademing met positieve druk om de perioperatieve morbiditeit en mortaliteit te minimaliseren.

Samenvatting

Thymectomie in neonatale knaagdieren is een gevestigde en betrouwbare werkwijze voor immunologische studies. Echter, bij volwassen ratten, complicaties van bloeding en pneumothorax van pleurale verstoring kunnen leiden tot een aanzienlijke mortaliteit. Dit protocol is een eenvoudige methode rat thymectomie een mini-sternotomie en endotracheale intubatie gebruikt. Intubatie wordt bij een niet-invasieve en gemakkelijk reproduceerbare werkwijze en maakt beademing pneumothorax te voorkomen en een gecontroleerd luchtweg voldoende tijd voor zorgvuldige thymus dissectie pleurale verstoring te minimaliseren maakt. Een 1,5 cm borstbeen incisie vermindert het contact met mediastinale schepen en borstvlies, maar met behoud van volledige visualisatie van de thymus. Na blootstelling van het mediastinum, wordt de thymus verwijderd door stompe dissectie onder vergroting. De pleurale ruimte wordt vervolgens afgedicht door hechtdraad sluiting van de pre-tracheale spieren gevolgd door het aanbrengen van chirurgische lijm. Dethorax wordt vervolgens gesloten door hechting sluiting van het borstbeen, gevolgd door hechting sluiten van de huid. Alle thymectomies waren voltooid blijkens immunohistochemische (IHC) kleuring van mediastinale weefsel, en afwezigheid van naïeve T-cellen door flowcytometrie en de procedure had een 96% overlevingspercentage. Deze methode is geschikt voor het compleet thymectomie met minimale complicaties is gewenst voor verdere immunologische studies in athymic volwassen ratten.

Inleiding

Sinds de vroege jaren 1960, is de thymus is erkend voor zijn cruciale rol in de ontwikkeling van het centrale immunologische tolerantie. Knaagdier thymectomie blijkt een essentiële procedure definiëren van de rol van de thymus lymfocyten differentiatie, zelf-tolerantie en immuuntolerantie in de omgeving van allograft transplantatie en tumor metastase. Verwijdering van de thymus rat zorgt voor studies met T-cel depletie of de adoptieve overdracht van bepaalde T-cel populatie zonder dat de hernieuwde opkomst van inheemse naïeve T-cellen.

Thymectomies in neonatale knaagdieren kan worden bewerkstelligd met behulp van een zuigtechniek met betrouwbare resultaten ^1. Bij volwassen ratten, wordt deze techniek gepaard met een geschatte 20% sterfte en vaak resulteert in een incomplete thymectomie ^2. Om consequent te bereiken volledige thymectomie bij volwassen ratten, wordt geopend blootstelling van het mediastinum via een mediane sternotomie vereist. Echterprocedure is geassocieerd met complicaties tracheale letsel, bloedingen en pneumothorax leidt tot een algemene mortaliteit van 1,5 omvatten - 6% ^{2- 4.}

In de afgelopen twee decennia verbeteringen in thymectomie technieken perioperatieve complicaties zijn gedaald en zijn overlevingskansen verbeterd. Luchtpijpintubatie waardoor voor positieve druk ventilatie heeft pneumothorax tarieven ⁵ verminderd. Methoden van intubatie eerder beschreven bereik van open blootstelling aan de luchtpijp naar minder invasieve methoden met behulp van directe stembanden visualisatie. Complicaties in verband met de intubatie procedure onder tracheale verwonding, stembanden breuk, onbedoelde oesofageale intubatie en bloedingen als gevolg van cardiale punctie of scheuring van de vena cava superior. Bovendien kan nabijheid van de onderste thymus lobben aan de pleurale voering gevolg pneumothorax.

Hier beschrijven we een techniekthymectomie via een minimaal invasieve 2 cm incisie in de huid na een eenvoudige methode van endotracheale intubatie met behulp van een afgestompte-end angiocatheter en transcutane tracheale verlichting. De thymectomie omvat een 1,5 cm sternotomie en een drielaags sluiting met chirurgische lijm aanbrengen op het mediastinum verzegelen en het minimaliseren van de incidentie van bloeding en ademhalingsproblemen. Deze werkwijze methode stelselmatig volledige thymectomie zoals blijkt uit het verdwijnen van CD4 ⁺ en CD8 ⁺ naïeve T-cellen na thymectomie en het ontbreken van thymusweefsel op IHC kleuring. Operatieve tijden en peri-procedurele mortaliteit worden tot een minimum beperkt.

Protocol

OPMERKING: Alle experimentele procedures die het gebruik van ratten werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Animal Care en gebruik Comite van Duke University goedgekeurd.

1. Voorbereiding van de tracheale intubatie canule

1. Snijd de naald einde van een 2 inch 14 G angiocathether naald met kniptang.
2. Knijp het lumen van de naald gesloten met naald-nosed tang.
3. Snijd de kneep gedeelte neer aan de rand van het open lumen gedeelte met kniptang, en snijd de randen aan beide zijden van het andere uiteinde op 30 - 45 ° hoek met de naald rand.
4. Plaats de bodem 3 - 4 mm van de canule in de open ruimte van rechte schuifdeuren tang en omhoog trekken tot een lichte opwaartse curve is gevormd aan het einde.
   Opmerking: Dit vergemakkelijkt het richten van de katheter in de luchtpijp (figuur 1).
5. Gebruik fijn schuurpapier gladstrijken van de randen aan het uiteinde van de canule.
6. Zet de afgestompte instrument in de angiocatheter slang. Zorg ervoor dat de slang is iets korter dan de botte naald.

2. Pre-chirurgische ingrepen

1. Het opzetten van de site voor de procedure door het plaatsen van een operationele microscoop set 10x vergroting boven het werkgebied.
2. Plaats een warming pad op het werkgebied en dek af met een schone absorberende pad.
3. Het opzetten van een hartslag en bloedoxygenatie monitor in de buurt van de chirurgische veld.
4. Weeg de rat voor gewicht gebaseerde dosering medicatie (bv postoperatieve pijnstilling, antibiotica, of lymfocyt afbrekende antilichaam).
   OPMERKING: Typische volwassen ratten wegen tussen de 350-450 g.
5. Bezadigde de rat met verdampte 3% isofluraan-O ₂ (3 l / min) met behulp van een inductie kamer afgevoerd naar een verspilling narcosegas opvangsysteem; met actieve kool. Laat 5 min voor anesthesie inductie tot diepe narcose nodig is voor endotracheale intubatie te voorzien.
6. Dien Carprofen of Meloxicane (4,4 mg / kg) subcutaan aan de rat voordat u verdergaat met intubatie en chirurgie.
7. Gebruik elektrische tondeuse aan de hals en de borst van de verdoofde ratten voorafgaand aan intubatie scheren.

3. intubatie

1. Bereid de intubatie ingesteld door wrijven een kleine hoeveelheid smeermiddel (bijv KY gel) aan het uiteinde van de canule intubatie. Zet de ventilator om de stroom van isofluraan gas beginnen door het aansluitbuizensysteem.
2. Breng de rat aan de intubatie apparatuur en de rat op de metalen staaf op te schorten door de bovenste snijtanden (Figuur 2A).
   OPMERKING: Bepaalde intubatie apparaten kunnen online worden gekocht. De hier getoonde model is zelfgemaakt met behulp van een acryl plaat gegoten rond secties van een 2 x 4 inch lumbale stuk met behulp van een butaan fakkel, en versterkingen zijn bevestigd met chloroform. De bar (of metalen draad) wordt bevestigd door het boren van gaten in afplakband geplaatst op de side van de acryl te splinteren of barsten te verhinderen.
3. Trans-verlichten nek van de rat door het plaatsen van een flexibele hoge intensiteit lichtbron 1-2 cm van het ventrale oppervlak van de hals (figuur 2B).
4. Gebruik een paar student standaardpatroon tang om de tong zachtjes naar boven en aan de zijkant van de onderste tanden trekken. Pak de tong tussen de duim en wijsvinger van één hand terwijl het plaatsen van het vlakke binnenoppervlak van een zijde van de tang tegen het onderste uiteinde van de tong. Druk ventraal aan de epiglottis en opening van het strottenhoofd (figuur 2C) bloot.
5. Visualiseer de stembanden en begeleiden de omgekeerde, afgestompte einde van de intubatiecanule voren door de open glottis in de luchtpijp tot aan de naaf van de angiocatheter raakt de snijtanden.
6. Verwijder de metalen stylet, en bevestig de anesthesie slang aan op de angiocatheter opening naar ventilatie beginnen met isofluraan.
   OPMERKING: De typische zuurstof flow tarief voor de ventilator is 3 l / min met 3% isofluraan.
   1. Stel de ventilator met een snelheid van 60 ademhalingen / min in een volume gecontroleerde ventilator modus die een druk van ~ 12 bereikt - 14 mmHg. Gebruik een positieve eind-expiratoire druk (PEEP) van 3 cm H ₂ O.
7. Let bilaterale borstwand expansie synchroon met de ventilator om juiste plaatsing van de endotracheale tube te waarborgen.
8. Solliciteer-dierenarts aanbevolen oogzalf voor de ogen van de rat tot droog te voorkomen, terwijl onder narcose.
9. Solliciteer dierenarts zalf op de ogen van de rat tot droog te voorkomen, terwijl onder narcose.
10. Bevestig de endotracheale tube aan het hoofd van de rat met een strook doek tape. Zorgen voor een stevige verbinding tussen de endotracheale buis en de verdoving instroom slang.
11. Bevestig de bloedoxygenatie en hartslagmeter aan de voet van de rat en beginnen monitoring. Bevestig de juiste verdoving door te bevestigen is er geen reactie op tee-snuifje.

4. Thoracotomie en thymectomie

1. Volg standaard aseptische techniek voor het geheel van de procedure.
   1. Reinig het werkgebied en de operatietafel en te desinfecteren met een 70% ethanol oplossing.
   2. Gebruik steriele chirurgische handschoenen tijdens de procedure, en autoclaaf alle instrumenten en materialen die worden gebruikt tijdens de procedure.
   3. Solliciteer providon-jodium om de hele borst en laat ze drogen. Reinig het oppervlak van de huid met 70% ethanol op gaas. Bedek de rat met doorzichtige plastic wrap snijden van een gat om de steriele operationele veld bloot.
2. Identificeer de suprasternal inkeping in de bovenste thoracale regio. Maak een 2 cm middellijn incisie door de huid begint 2-3 mm boven de suprasternal notch en uitbreiding van distaal middellijn langs het borstbeen met behulp van stompe getipt Shea schaar.
3. Voer een 1,5 cm mediane sternotomie uit de suprasternal inkeping opnieuw met stompe getipt Shea schaar. Keep de onderrand van de schaar net onder het borstbeen en verder langzaam.
4. Steek een kleine Alm oprolmechanisme net onder het gescheiden borstbeen en open naar de pre-tracheale riem spieren (sternohyoid en sternothyroid spieren) te onthullen. Scheid de pre-tracheale riem spieren met behulp van stompe Graefe pincet. OPMERKING: Op dit punt, de luchtpijp te zien, en de intubatiebuis worden gevisualiseerd in de luchtpijp.
5. Plaats de tanden van de kleine Alm oprolmechanisme onder de gescheiden riem spieren en borstbeen. Open de retractor de superieure aspect van de thymus bloot.
6. Gebruik fijne Dumont tang om de zijkanten van de thymus weefsel los te maken en bloot de lagere thymus lobben.
7. Trek de zwezerik zachtjes superieur in de open incisie site, zorg ervoor dat het contact met de vena cava superior, subclavia en de halsslagader schepen te voorkomen, en om verstoring van de delicate pleura voering tussen de thymus en de longen te minimaliseren.
8. Als thij thymus schepen worden ontleed en onthulde, gebruik van micro-schaar om ze te verdelen. Gebruik een wattenstaafje om de druk te houden op de schepen voor hemostase indien nodig.
9. Lever de onderste thymus lobben in de incisie en dan scherp lyseren de achterste bijlagen. Verwijder de intacte thymus en zorgvuldig te inspecteren de verwijderde thymus voor eventuele ontbrekende onderdelen.
   OPMERKING: Kleine thoracale lymfklieren worden gevisualiseerd rond de thymus en zijn vaak moeilijk te onderscheiden van thymusweefsel. Dit zullen discrete ronde knopen met een gelijkaardige verschijning aan thymusweefsel maar zal niet in continuïteit met de thymus.
10. Verwijder de Alm oprolmechanisme en sluit de sternohyoid en sternothyoid spieren met twee onderbroken 5-0 Maxon hechtingen.
11. Breng 2 druppels van chirurgische kwaliteit cyanoacrylaat weefsel lijm over de hechtingen aan het mediastinum onder positieve druk ventilatie af te dichten.
    LET OP: Dit zal de incidentie van pneumothorax en hematoom verlagen.
12. Sluit de sternum met twee onderbroken 4-0 zijde hechtingen op een scherpe naald. Steek de naald door openingen tussen de ribben, en zorg dat de naald te begeleiden net onder het borstbeen aan de onderliggende spierlaag voorkomen.
13. Sluit de huidlaag met een lopende 4-0 Nylon hechtdraad. Staak de isofluraan op dit punt aan de postoperatieve anesthesie herstelperiode te verkorten.
14. Reinig de incisie en de omliggende huid met zoutoplossing bevochtigd gaas.
15. Breng enkele druppels bupivicaine (0,25%) voor plaatselijke verdoving, gevolgd door 1-2 druppels cyanoacrylaatlijm de incisie aan de incisie dichten.
16. Blijven ventileren totdat de rat toont tekenen van onafhankelijke inspanning luchtwegen en begint aan zijn ledematen bewegen. Extuberen de rat en laten herstellen in observatie in een kooi geplaatst op een warming pad.
17. Dien Buprenorfine (0,01-0,05 mg / kg) subcutaan aan de ratten onmiddellijk na operatie en herhaal elke 8-12 uur gedurende 48 uur post-operatief (normaal 5 totale doses). Op 24 en 48 uur na de operatie, beheren Carprofen of Meloxicane (4,4 mg / kg) subcutaan (3 totale dosis inclusief de pre-operatieve dosis).
18. Blijf controleren totdat de rat bewegen van de kooi. Bij tekenen van ademnood uitvoeren re-intubatie en opnieuw verkenning van de borst.
    1. Heeft een dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging behouden.
    2. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
19. Verwijder de huidlaag hechtingen 1 week na de operatie.

Resultaten

Deze procedure werd uitgevoerd op volwassen Lewis-ratten (n = 26). De gemiddelde operatietijd was 15 ± 3 min. Er was geen intra-operatieve mortaliteit. De gemiddelde intubatie tijd - van de plaatsing van de rat op de intubatie apparaat voor de vestiging van de ventilatie - was 45 ± 5 sec. 24 ratten hadden een volledig herstel van de operatie met geen bewijs van ademhalingsmoeilijkheden of bloeding door postoperatieve dag (POD) 14. Een rat ontwikkeld ademhalingsmoeilijkheden op POD 4 en onderging re-operatie om het media...

Discussie

Het huidige protocol voor volledige thymectomie biedt een minimaal invasieve benadering met een drie lagen incisie sluiting met chirurgische lijm applicatie ontworpen om complicaties te beperken. Volledige verwijdering van de thymus werd aangetoond door het verlies van naïeve T-cellen en door IHC kleuring van mediastinale lymfoïde weefsel voor cytokeratine.

De procedure van volwassen ratten thymectomie wordt bemoeilijkt door sterfte variërend 1,5-20% door peri-operatieve complicaties, waarva...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2 inch 14 G angiocatheter
Operatiemicroscoop	Zeiss
Verwarmingspad
Hartslag- en bloedzuurstofmonitor voor knaagdieren met voetzenkers	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat voetzenker)
Intubatietussenstuk (plastic met metalen staaf aan de bovenkant)			Zie Figuur 2
Anesthesiesysteem voor kleine dieren met inductiebox, isofluraankleg en O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Klein dier ventilator met slang	CWE	12-02000 (ventilator) en 12-04000 (externe klepsamenstelling voor muizen/ratten)
Hoog intensiteit lichtgeleider	Dolan Jenner	EEG 2823M
Standaard forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fijne rechte schaar	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tip Shea schaar	Fine Science Tools	14105-12
Kleine Alm retractor (voor borstbeen)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fijne Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon hechtdraad	Ethicon
4-0 Zijde hechtdraad (met snijdende naald)	Ethicon
6-0 Nylon hechtdraad	Ethicon
Cyanoacrylaatlijm (Endermil)
Smeringsgel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35