Lokalisatie, identificatie, en Excisie van Muriene Adipose Depots

Samenvatting

Als gevolg van de drastische en negatieve verband tussen obesitas en andere comorbiditeiten, onderzoek naar de rol vetweefsel speelt bij de ziekte en de algehele gezondheid gerechtvaardigd is. We presenteren een protocol voor isolatie en excisie van vet depots waardoor de studie van adipose gebruik in situ en in vitro methoden.

Samenvatting

Obesitas is de afgelopen decennia dramatisch toegenomen en treft meer dan een derde van de volwassen Amerikaanse bevolking. Het economische effect van obesitas bereikte in 2005 een verbluffende som van $190,2 miljard aan directe medische kosten alleen al. Obesitas is een belangrijk risicofactor voor een groot aantal ziekten. Historisch gezien was er weinig bekend over vetweefsel en zijn belangrijke en essentiële functies in het lichaam. Bruin en wit vet zijn de twee hoofdtypen vetweefsel, maar de huidige literatuur heeft een nieuw type vet geïdentificeerd, brite of beige vet genoemd. Onderzoek heeft aangetoond dat vetafzettingen specifieke metabole profielen hebben en dat bepaalde afzettingen een neiging tot obesitas en andere gerelateerde aandoeningen mogelijk maken. Het doel van dit protocol is om onderzoekers de mogelijkheid te bieden om vetafzettingen te identificeren en te verwijderen die de analyse van verschillende factoriële effecten op vetweefsel mogelijk maken; evenals de gunstige of schadelijke rol die vetweefsel speelt bij ziekten en de algehele gezondheid. Isolatie en verwijdering van vetafzettingen stelt onderzoekers in staat om zowel grove morfologische veranderingen als histologische veranderingen te bekijken. Het geïsoleerde vet kan ook worden gebruikt voor moleculaire studies om transcriptionele en translationele veranderingen te evalueren of voor in vitro experimenten om doelwitten van belang en werkingsmechanismen te ontdekken. Deze techniek is superieur aan andere gepubliceerde technieken vanwege het ontwerp dat het mogelijk maakt om meerdere depots met eenvoud en minimale besmetting te isoleren.

Inleiding

Vet maakte een opvallende verschijning in de media-aandacht, als gevolg van obesitas dramatische stijging in de laatste decennia van de 20e eeuw. Obesitas treft momenteel meer dan een derde van de volwassenen en 17% van de kinderen en adolescenten in de Verenigde Staten (VS) ^1. Verspreid over alle etnische groepen, heeft statistisch onderzoek rond de obesitas-epidemie aangetoond dat niet-Spaanse zwarten hebben de hoogste leeftijd gecorrigeerde snelheid van obesitas (49,5%) in vergelijking met de Mexicaanse Amerikanen (40,4%), alle Iberiërs (39,1%), en niet- Spaanse blanken (34,3%) ^2. Het economische effect van obesitas is ook een groeiende zorg voor de gezondheidszorg. In 2012 werd geschat dat de jaarlijkse medische kosten van de zorg voor obesitas in de VS in 2005 was $ 190.200.000.000, bijna 21% van de totale medische uitgaven begroting. Helaas, werd obesitas bij kinderen naar schatting verantwoordelijk voor $ 14000000000 in directe medische kosten om alleen te zijn. Statistisch werd vastgesteld dat de gemiddelde medische kostenpersonen met obesitas was $ 2741 hoger per jaar dan die zonder deze morbiditeit ^3-5.

Obesitas is een belangrijke risicofactor voor een verscheidenheid van aandoeningen zoals: type 2 diabetes, dyslipidemie, hart- en vaatziekten, kanker, spier- skelet aandoeningen en chronische ontsteking. Obesitas is sterk verbonden met de pathogenese van metabool syndroom en andere chronische ziekten ^6-8. Met zulke drastische en negatieve verbindingen tussen obesitas en andere comorbiditeiten, heeft wetenschappelijk onderzoek aandacht aan beter inzicht in de huidige epidemie en de diverse en cruciale rol gespeeld door vetweefsel.

Historisch, werd vetweefsel onbelangrijk beschouwd en werd alleen gezien als een eenvoudige vulling weefsel. Momenteel is vet is aangetoond dat vele essentiële rol spelen in de functie van het lichaam in: stofwisseling, hormoonhuishouding, ontstekingen, bescherming en isolatie ^9. Vetweefsel is voornamelijk samengesteld uitadipocyten maar bevat ook pericyten, endotheelcellen, monocyten, macrofagen en pluripotente stamcellen ^8. Vetweefsel wordt verspreid door het hele lichaam in verschillende depots. De belangrijkste depots kan subdermaal worden gevonden, subcutaan, intramusculair, en viscerally ^10. Adipose depots is aangetoond depot specifieke metabolische profielen daarvan, die een depot specifiek gevoeligheid voor obesitas en verwante aandoeningen ⁸ hebben.

Traditioneel is het vetweefsel is ingedeeld in twee hoofdtypen: wit vetweefsel (WAT) en bruin vetweefsel (BBT); hoewel de recente literatuur geeft aan dat de aanwezigheid van een derde groep gedoopt Brite of beige vet ^11. Vetweefsel is aangetoond dat verschillende kleuren, morfologieën, metabolische functies, biochemische eigenschappen en genetische expressiepatronen ¹⁰ hebben. Adipocyten in Wat hebben een enkele, grote lipide druppel en variabele hoeveelheden mitochondria. WATis dominant in subcutane en viscerale plaatsen van het lichaam. WAT functioneert voornamelijk als gebied van energie-opslag en bescherming orgel. Adipocyten in BAT hebben een multiloculaire morfologie en overvloedige mitochondriën. BAT ligt voornamelijk in de nek en grote bloedvaten van de thorax, en de scapulae ^12. BAT voornamelijk functies in-energie besteden gedrag dat thermogenese ⁷ reguleren. Brite of beige vet is aangetoond dat een analoge morfologie en expressie BAT delen maar bleek te zijn ontstaan ​​uit witte adipocyten ^11.

De beschreven chirurgische methode in dit manuscript geeft onderzoekers het vermogen om verschillende effecten die factoren als analyse: milieu, farmaceutica en genetica hebben op vet; alsmede de positieve of negatieve rol speelt adipose ziekte en de algehele gezondheid. Ook biedt een manier te identificeren en te isoleren verschillende vetweefsel tebeter zorgen voor begrip van de biochemische relaties en verschillen tussen de depots. Dit kan helpen bij het bepalen van de relatie tussen locatie, functie en soorten vet in het lichaam. Deze methode doet dit door het verschaffen van middelen voor het grove visualisatie, analyse van genexpressie, eiwitexpressie analyse, histologisch onderzoek, en isolatie van primaire cellijnen in vitro studies. Momenteel zijn er vele artikelen die inzicht in de metabolische gedrag van verschillende vet depots, evenals hun anatomische locaties verschaffen; maar voorzien niet in een diepgaande methode over hoe om specifiek te lokaliseren, te identificeren en isoleren van deze depots. Deze chirurgische methode een nauwkeurige techniek maakt isolatie van meerdere depots met een minimale hoeveelheid dissectie en verontreiniging in vergelijking met andere werkwijzen ontwikkeld voor het isoleren van één of twee depots ^13-14.

Het doel van dit protocol is te voorzieneen nauwkeurige werkwijze voor de identificatie en isolatie van verschillende vetdepots van verschillende anatomische locaties.

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Cincinnati en in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH-publicatie nr . 85-23, herzien in 1996).

1. Euthanaseren en steriliseer de muis

1. Plaats de muis in een dropbox met een supratheraputic dosis isofluraan en laten inhaleren van kracht. Zodra de muis wordt gedood, te verwijderen uit de doos.
2. Cervicaal ontwrichten als een tweede middel van euthanasie.
3. Steriliseer het buitenoppervlak van de muis door het reinigen van het dier met 70% ethanol.

2. Identificatie en isolatie van Drie Verschillende Adipose Depots

1. Bruin vetweefsel (BAT) Isolatie:
   1. Zorg ervoor dat de vacht is nat van de alcohol reiniging om te helpen bij het doorsnijden van de epidermale en dermale Layers.
   2. Plaats de muis in een liggende positie met de rug tegen de tafel.
   3. Pak de huid net onder het middenrif met een pincet, een lift en incisie met een schaar.
   4. Snijd dwars over de omtrek van de muis om het buikvlies bloot.
   5. Onthullen de vlindervormige BAT depot door degloving de bovenste helft van de muis. Houd de onderste aanhangsels en buik in de ene hand en tot het trekken van de huid in de richting van het hoofd.
   6. Richt de muis, zodat deze gevoelig op de tafel is geplaatst. Wees voorzichtig niet om de blootgestelde depot besmetten met haar.
   7. Schoon chirurgische instrumenten en verandering naar een vers paar handschoenen.
   8. Zoek de schouderbladen en de bijbehorende depot. Verwijder zorgvuldig de oppervlakkige wit vetweefsel boven op de vlinder en vervolgens ontleden de vlinder van interscapular bruin vet. Wees voorzichtig om de spier nauw verbonden met het bruine vet te vermijden.
      Opmerking: Het gebruik van een dissectie microscoop wordt aanbevolen voor het verwijderen van het white vet, alsmede de scheiding van het bruine vetweefsel van het schouderblad.
   9. Verwijder vet depot en naar een 2 ml microcentrifugebuis.
   10. Indien RNA of eiwit te extraheren invriezen weefsel door onderdompeling in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Bevriezen van het monster in een keer om degradatie te voorkomen. Als kweken, bedek het weefsel in DMEF-12 en ingesteld op ijs totdat alle monsters worden verzameld voor cultuur (aanvullende informatie).
2. Isolatie van subcutane VetWeefsel (SQ), een wit vetweefsel Depot (WAT):
   1. Zet op een vers paar handschoenen om niet cross-besmetten tussen vet depots.
   2. Onthullen de lies, driehoekige SQ depots door De handschoenen in de onderste helft van de muis. Houd de bovenste aanhangsels en thorax in de ene hand en het trekken van de huid naar beneden in de richting van de voeten met de andere hand.
   3. Richt de muis in een rugligging terwijl ze voorzichtig niet om de blootgestelde depot met haar besmetten.
   4. Schoon surgical instrumenten en verandering naar een vers paar handschoenen.
   5. Ontleden zorgvuldig de driehoeken van SQ vet. Pas op dat u het monster besmetten met spier, naburig vet, melkklieren of op welke schepen snijden en vervuilen het monster met bloed.
      LET OP: Het gebruik van een dissectie microscoop wordt aanbevolen als de grenzen niet duidelijk zijn omschreven.
   6. Verwijder vet depots en transfer naar 2 ml microcentrifugebuizen.
   7. Indien RNA of eiwit te extraheren invriezen weefsel door onderdompeling in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Bevriezen van het monster in een keer om degradatie te voorkomen.
   8. Voor het kleuren, herstellen of te verankeren in oktober Als kweken, bedek het weefsel in DMEF-12 en ingesteld op ijs totdat alle monsters worden verzameld voor cultuur (aanvullende informatie).
3. Isolatie van Gonadale Vet een Visceral VetWeefsel (BTW) en wit vetweefsel (WAT) Depot:
   1. Zet op een vers paar handschoenen om niet cross-besmetten tussen vet depots.
   2. Met scissors, snijd het buikvlies dwars, direct onder het middenrif. Snijd het buikvlies van het middenrif tot het rectum midden coronaalwaarts aan buikorganen bloot.
   3. Zoek de testes of ovaria en identificeren van de bijgevoegde wit vetweefsel, bekend als de epididymis vet bij mannen of gonadale adipose bij vrouwen.
   4. Schoon chirurgische instrumenten en verandering naar een vers paar handschoenen
   5. Ontleden zorgvuldig zowel epididymaal vet depots van de testes, epididymis, en zaadleiders. Of als vrouwelijke, zorgvuldig ontleden zowel gonadale vetkussentjes van de eierstokken.
   6. Verwijder vet depots en overbrengen naar 2 ml microcentrifugebuisjes.
   7. Indien RNA of eiwit te extraheren invriezen weefsel door onderdompeling in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Bevriezen van het monster in een keer om degradatie te voorkomen.
   8. Voor het kleuren, herstellen of te verankeren in oktober Als kweken, bedek het weefsel in DMEF-12 en ingesteld op ijs totdat alle monsters worden verzameld voor cultuur (aanvullende informatie).

3. Isolatie van Perivasculaire VetWeefsel (PVAT)

1. Isolatie van het Hart:
   1. Leg de muis in een liggende positie met de bovenste en onderste aanhangsels naar buiten verlengd.
   2. Beveiligde appendages met behulp van chirurgische tape.
   3. Na het plaatsen van de muis, zoals hierboven vermeld, maakt de spanning door het op te tillen de zwaardvormig proces met een pincet. Snijd horizontaal door het membraan, waardoor de onderste gedeelte van de borstholte.
   4. Met behoud spanning, verheffende de processus xiphoideus, dwars door de ribbenkast craniaal naar de kop, om de zijde van het borstbeen.
   5. Pak de ribbenkast gewoon inferieur aan het sleutelbeen en snijd langs de onderste lengte van het sleutelbeen uit naar de oksel in beide richtingen. De borstholte en de inhoud (hart, longen, etc.) moet nu duidelijk zichtbaar.
   6. Reinig de borstholte van vreemde bloed en vocht door steriele gaUze om de vloeistof te absorberen. Als het verzamelen van organen of schepen er zeker van te overvloedig (aanvullende informatie).
   7. Zodra het gebied is vrijgemaakt van vloeistof, snijd de bronchiën en bevestigen van schepen naar de longen te verwijderen, waardoor een betere belichting van het hart.
2. Lokalisatie en Excisie van Aorta Perivasculaire VetWeefsel (PVAT):
   1. Verwijder de volgende organen aan de inferieure gedeelten van de aorta beter identificeren: lever, maag, milt, pancreas, darmen en colon.
   2. Begin eerst met identificatie van de maag en de slokdarm. Snij de slokdarm in de maag-slokdarm overgang naar de maag uit het lichaam bevrijden.
   3. Vervolgens bepalen de darmen en de omringende mesenterium. Snijd oppervlakkig door mesenterium, want het ligt zeer dicht tegen de renale deel van de aorta, dan "lopen de darm."
   4. Snijd de colon vrij zo dicht bij het rectum mogelijk. Aldus vrijmaken van de maag, darm en colon van de muis.
   5. Reverplaats de maag, darm, dikke darm, alvleesklier en milt door snijden door het bevestigen mesenterium en vaten. De pancreas en milt moet vrij komen met de maag, darm en colon.
   6. Verwijder de lever door snijden door de levervenen en bevestigen mesenterium, verwijder alle lobben.
   7. Knip de viscerale laag en vet rondom de nieren. Laat de nieren aan de aorta in vivo te dienen als geografische merkers voor verschillende segmenten van de aorta.
   8. Spoel het gebied met steriele 1x PBS en verwijder alle vloeistof door absorptie met een steriel gaasje.
   9. Met behulp van micro-schaar en micro-tang, scheid de aorta van de dorsale gehechtheid aan de wervelkolom en de ventrale gehechtheid aan de slokdarm.
   10. Isoleer de aorta door het volgen en losmaken van de aorta de lengte van de aorta descendens uit de oorsprong in het hart naar de vertakking van de iliacale regio.
   11. Identificeren en de subclavia schepen te isoleren. Deze schepen te isolerenvan de nek naar de aorta wortel naar de aorta knooppunt en wortel in het hart beter bloot.
   12. Verwijder de thymus knip de brachycefale slagader, de linker gemeenschappelijke halsslagader en de linker subclavia, waardoor beweging van het hart.
   13. Met de hulp van een dissectie microscoop, bekijk de perivasculair vetweefsel (PVAT) laag rond de aorta.
   14. Het nemen van grote zorg om niet knijpen of knijp de PVAT, trek de PVAT weg van de aorta met micro-tang. Voorzichtig snijden de bevestiging van de PVAT de aorta met micro-schaar vanaf de thorax alleen superieur aan waar het diafragma bevindt.
       OPMERKING: Een dissectie microscoop wordt aanbevolen.
   15. Herhaal dit proces de gehele lengte van de aorta, eindigend bij de infrarenale aorta gebied, dat zich net boven de iliacale bifurcatie van de aorta vat.
   16. Als aortaboog PVAT gewenst is, gebruikt dezelfde methode om de PVAT uit de mindere c verwijderenurvature van de boog.
   17. Plaats PVAT monsters in 2 ml microcentrifugebuis (s).
   18. Indien RNA of eiwit te extraheren invriezen weefsel door onderdompeling in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C. Bevriezen van het monster in een keer om degradatie te voorkomen. Als kweken, bedek het weefsel in DMEF-12 en ingesteld op ijs totdat alle monsters worden verzameld voor cultuur (aanvullende informatie).
       LET OP: Extra vet depots te overwegen of geïnteresseerd zijn in een uitgebreide vet depot analyse zijn: retroperitoneale, mesenteriale, omental, pericardiale en knieholte.

Resultaten

Identificatie en lokalisatie van lies subcutaan vetweefsel, interscapular bruin vetweefsel, viscerale epididymale adipose (figuur 1), alsook de aortaboog perivasculaire vet, thoracale aorta vetweefsel, bijnieren aorta vet en de infrarenale aorta adipose (figuur 2) werd met succes gebruikt beschreven chirurgische methode. Histologisch onderzoek en differentiatie tussen BAT en WAT monsters werden positief beoordeeld met hematoxyline en eosine (H & E) kleuring (figuur 3).

Discussie

Obesitas kan leiden tot een groot scala aan morbiditeit en het volledige begrip van de rol die vet speelt is niet helemaal duidelijk; daarom voortgezet onderzoek op het gebied van vet is noodzakelijk. Diermodellen, in het bijzonder murine modellen ideaal voor eerste onderzoek in de progressie van de ziekte en het testen van potentiële farmaceutische behandelingen. Bij gebruik van deze modellen nauwkeurige isolatie en excisie van vet depots is een uiterst belangrijk en noodzakelijk hulpmiddel in de studie van de patholog...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isofluraan	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	Verwarm in waterbad voordat u het op weefsel aanbrengt.
2 ml Microcentrifugebuisjes	Midsci	MCT-200-C-S
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma Aldrich	P5368-10PAK