Hier beschrijven we een eenvoudige test voor de kwantificering van de voedingsrespons in hydra geïnduceerd door de gereduceerde vorm van glutathion. Deze test berust op het meten van de afstand tussen het apicale uiteinde van de tentakel en de mond van de hydra.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hydra behoort tot de meest primitieve organismen met een zenuwstelsel en chemosensatie voor het detecteren van gereduceerd glutathion (GSH) voor het vangen van prooien. De beweging van prooidieren veroorzaakt een mechanosensorische ontlading van de brandende cellen, nematocysten genaamd, van de hydra, die in het prooi worden ingebracht. De voedingsrespons bij hydra, die het krullen van de tentakels om de prooi naar de mond te brengen, het openen van de mond en het vervolgens inslikken van de prooi omvat, wordt geactiveerd door GSH dat aanwezig is in de vloeistof die vrijkomt van het gewonde prooi. Om het moleculaire mechanisme van de voedingsrespons bij hydra, dat tot op heden onbekend is, te kunnen identificeren, is het noodzakelijk een test op te zetten om de voedingsrespons te meten. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de kwantificering van de voedingsrespons waarbij de afstand tussen het apicale uiteinde van de tentakel en de mond van de hydra wordt gemeten en de verhouding van die afstand vóór en na de toevoeging van GSH wordt bepaald. De verhouding, de relatieve tentakelspreiding genaamd, bleek een maatstaf voor de voedingsrespons te geven. Deze test werd gevalideerd met behulp van een hongermodel waarin uitgehongerde hydra een verbeterde voedingsrespons vertonen in vergelijking met dagelijks gevoede hydra.
Inleiding
Hydra is het meest primitieve organisme dat een zenuwstelsel en chemosensatie bezit om gereduceerd glutathion (GSH) te detecteren voor het vangen van de prooi1. Het voedt zich met een verscheidenheid aan dieren zoals nematoden, schaaldieren, insectenlarven, kikkervisjes en pas uitgekomen vissen1. De beweging van deze prooidieren veroorzaakt een mechanosensorische ontlading van de prikblaasjes, genaamd nematocysten, uit de hydra, die in de prooi worden geïnjecteerd2. GSH dat aanwezig is in de vloeistof die vrijkomt uit de gewonde prooi activeert vervolgens de voedingsreactie in de hydra, die het krullen van de tentakels om de prooi naar de mond te brengen, het openen van de mond en het daaropvolgende verzwelgen van de prooi omvat. Meerdere moleculen, zoals dopamine3, glutamaat4, GABA, glycine5, NMDA-receptoren6 en allatotropine7, zijn aangetoond betrokken te zijn bij de voedingsreactie in de hydra. Er is ook aangetoond dat de chemosensorische reactie geïnduceerd door GSH wordt gemoduleerd door de voedingsstatus van het dier, zodat uitgehongerde hydra een verbeterde voedingsreactie vertoont1. Een dergelijke toename in de gevoeligheid voor GSH is biologisch relevant omdat hydra onder honger zijn prooi met een hogere gevoeligheid moet vinden.
Hoewel de voedingsreactie geïnduceerd door GSH duidelijk onder de microscoop kan worden waargenomen, zijn de methoden die gewoonlijk worden gebruikt voor het meten van de waarnemingen van de voedingsreactie niet-kwantitatief. In de meeste gevallen werd de tijd gedurende welke de mond van de hydra open bleef, genomen als een maatstaf voor de voedingsreactie8,9; terwijl in een ander geval, de kwantificering was gebaseerd op het aantal hydra uit een populatie dat de voedingsreactie vertoonde10. Het observeren van de tijd van mondopening van de hydra poliepen is echter lastig en onderhevig aan variatie veroorzaakt door onbeheersbare parameters zoals de richting van de mondoriëntatie tijdens waarnemingen. Evenzo zijn populatiegebaseerde benaderingen, aangezien de voedingsreactie een kwantitatief parameter is, onderhevig aan variaties/fouten veroorzaakt door de mening of observationele vooringenomenheid van de individuele waarnemer. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een methode ontwikkeld voor de relatieve kwantificering van de voedingsreactie in hydra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) op basis van de afstand van het apicale uiteinde van de tentakel vanaf de mond van de hydra poliep.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Hydra Cultuur en waardering van de Feeding Response
- Handhaaf hydra poliepen in kweek door ze dagelijks met artemia en bewaar ze in een medium (1 mM Tris-HCl buffer, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,1 mM KCl en 0,1 mM MgSO4) in een glazen schaal bij 18 ° C onder 12 uur licht 12 uur donker cycli zoals eerder 12 beschreven.
- Voor het meten van de voedingsreactie transfer een volwassen hydra poliep met 5-6 tentakels een enkel putje van een 24-wells plaat. Verwijder de resten van het medium uit de put door het kantelen van het, en dan meteen voeg 500 ul van vers medium.
- Bereid 9 uM glutathion oplossing in hydra medium. Aangezien de glutathion oplossing is gevoelig voor oxidatie, gebruik altijd vers bereide glutathion oplossing voor elk experiment.
- Breng de plaat aan de imaging platform van een microscoop met voorzieningen voor het opnemen van beelden. Gebruik een donkere achtergrond zodanig dat het gedrag of hydra poliep kan duidelijk worden afgebeeld tegen de contrasterende achtergrond.
- De ruimte wordt gebruikt voor het observeren en beeldvorming van het gedrag van de hydra vrij van lichten van wisselende intensiteit, luchtstromen en lawaai. Dergelijke verstoringen kunnen ook leiden tot de hydra poliep contractie van de tentakels tonen - zelfs bij afwezigheid van glutathion.
- Laat de poliep te ontspannen voor 5 min.
- Zorg ervoor dat de poliep is gelegen langs het centrale gebied van de bron, zodat de werking duidelijk kan worden afgebeeld. Als de poliep is aan de rand van de put, brengen naar het centrum van spoelen het medium met een pipet en opnieuw laat het ontspannen.
- Maak een foto van Hydra in de ontspannen toestand. Dit zal de zero-tijdstip observatie zijn.
- Voeg snel 9 uM glutathion oplossing tot een eindconcentratie van 3 uM bereiken in de put. Afhankelijk van het doel van het experiment en de respons getoond door hydra, test een reeks van verschillende concentraties van glutathion en choose de juiste concentratie vereist.
- Start de timer onmiddellijk na het toevoegen van glutathion oplossing en foto's maken na elke 15-30 sec voor 4-5 min. Laat de vergroting instellingen niet aanpassen tijdens de time-lapse imaging veranderen.
- Voeg de glutathion oplossing voorzichtig en uniforme stroming zodat de positie van het dier in de put minimaal zou worden verstoord in het gezichtsveld van de microscoop. Echter, als de poliep beweegt uitgebreid na het toevoegen van glutathion oplossing om de plaat heel voorzichtig om de poliep in het gezichtsveld voor het vastleggen van beelden te brengen.
- In het controle-experiment gebruikt medium zonder glutathion terwijl alle andere parameters gelijk.
- Zorg ervoor dat al het bovenstaande experimentele stappen uit te voeren tijdens de eerste helft van de dag - voor 13:00 naar de mogelijke invloed van de circadiane ritme van de mate van het voeden reactie te voorkomen.
- Open elk van de gemaakte foto's met behulp van de GNU Image Manipulation Program (GIMP).
- Gebruik de "Measure" tool die beschikbaar zijn vanaf Menu> Extra> Meet de afstand tussen de apicale einde van elk van de tentakels en hypostoom bepalen. Indien de mondopening waargenomen in elk van de beelden, bepalen de afstand tussen het middelpunt van de geopende mond en het apicale uiteinde van de tentakel. Raadpleeg deze afstand als de tentakel spread.
- Bereken de gemiddelde tentakel verspreid voor elke poliep vóór en na blootstelling glutathion. Bereken de verhouding van gemiddelde tentakel spread op nul tijdstip dat bij elk van de volgende tijdstippen. Deze verhouding zal worden genoemd relatieve tentakel spread.
- Herhaal metingen minimaal 20 poliepen.
2. Methode Validatie met behulp van deVerhongering Model
- Voor honger, overdragen enkele hydra poliepen om een aparte glazen kom en laat ze niet te voeden gedurende 5 dagen. Voer de controle groep van een paar poliepen dagelijks met artemia in een vergelijkbare omvang kom. Verander het medium van zowel experimentele kommen dagelijks om schimmelgroei in het medium te voorkomen.
- Op de dag van het experiment, voeden de controlegroep van hydra met Artemia 1 uur en deze gebruiken hydra de volgende experimenten na verwijderen van alle niet opgegeten en dode Artemia van het medium.
- Meet de voedingsreactie van de uitgehongerde hydra ten opzichte van de hydra van controlegroep door de eerder in stap 1 beschreven Om vertekening te voorkomen toegepast gezien waarnemingstijd, wisselen de metingen van elk van de uitgehongerd en controle hydra poliepen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Glutathion veroorzaakt hydra tot krullen van de tentakels vertonen op de bek ten behoeve van overspoelt de prooi. Dergelijke curling tentakels brengt apicale uiteinden van de tentakels dichter bij de hypostoom. Dit resulteert in afname van de tentakel spread of de lineaire afstand tussen apicale uiteinde van de tentakel en hypostoom (figuur 1). De relatieve tentakel spread of de verhouding van gemiddelde tentakel voor verspreiden en na het toevoegen van glutathion, gemiddeld over meerdere poliepen vermi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voedingsgedrag in hydra is een van de meest voorouderlijke chemosensory systemen in de Metazoa. Hoewel de aanwezigheid van GSH in de schaaldieren vloeistof vrijgelaten na-nematocyst bijgestaan hun prooi vangen werd lang geleden ontdekt 1, hebben noch de GSHR eiwit, noch de vermeende coderende gen / s gekarakteriseerd van hydra-to-date. Weinig pogingen gedaan om karakteriseren GSH bindingseiwitten hydra 8, 14, 15. De identiteit van deze vermeende receptor eiwitten blijft onduidelijk en weinig ande...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen K. P. Madhu, Nita Beliappa en het personeel van het Media Centrum van het Indian Institute of Science Education and Research, Pune bedanken voor hun hulp bij de productie van de video. Het werk werd ondersteund door financiering onder het Centre of Excellence programma van het Department of Biotechnology, Government of India aan SG en een postdoctorale beurs door het Department of Science and Technology, Government of India aan RK.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Gekoelde Incubator | Panasonic | MIR-254-PE | |
| Microscoop | Leica | S8AP0 | |
| Camera voor de microscoop | Leica | EC3 | |
| Gereduceerd glutathion | Sigma | G4251 | Bewaar op 4 °C. Breng de fles naar kamertemperatuur voor het openen om oxidatie te voorkomen |
| Beeldbewerkingsprogramma | GIMP | Versie 2.8 |
Referenties
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
