Een nieuwe techniek voor de kwantitatieve analyse van haaruitval in Muizen met behulp van grijstinten Analyse

Samenvatting

Alopecia is een veelvoorkomende vorm van haarverlies die kan optreden in veel verschillende omstandigheden, inclusief als een bijwerking van chemotherapie. We hebben een methode ontwikkeld om haarverlies bij muizen te kwantificeren, waarbij we een standaard gel imager gebruiken om een grijswaardenanalyse uit te voeren, om de studie van veelbelovende nieuwe alopecia-therapieën te vergemakkelijken.

Samenvatting

Alopecia is een veel voorkomende vorm van haaruitval die kan optreden in veel verschillende omstandigheden, met inbegrip van mannelijke kaalheid, polycysteus ovarium syndroom, en alopecia areata. Alopecia kan ook optreden als bijwerking van chemotherapie bij kankerpatiënten. In deze studie, ons doel was om een ​​consistente en betrouwbare methode voor haaruitval bij muizen, waarmee onderzoekers nauwkeurig vast en nieuwe therapeutische benaderingen voor deze verschillende vormen van alopecia vergelijken kwantificeren ontwikkelen. De werkwijze gebruikt een standaard gel imager verkrijgen en verwerken afbeeldingen muizen meten van de lichtabsorptie, die optreedt in ruwe verhouding tot de hoeveelheid zwart (of grijs) haar op de muis. Gegevens die zijn gekwantificeerd op deze manier kunnen vervolgens worden geanalyseerd met behulp van standaard statistische technieken (dat wil zeggen, ANOVA, T-test). Deze methode werd getest in muismodellen van chemotherapie-geïnduceerde alopecia, alopecia areata en alopecia van waxen. In dit rapport, het gedetailleerd protocol is presteerde voor het uitvoeren van deze metingen, waaronder de goedkeuring gegevens van C57BL / 6 en C3H / HeJ stammen van muizen. Deze nieuwe techniek biedt een aantal voordelen, waaronder relatieve eenvoud van toepassing, afhankelijkheid van apparatuur die gemakkelijk beschikbaar in de meeste laboratoria en toepassing van een objectief, kwantitatieve beoordeling die is robuuster dan subjectieve beoordelingen. Verbeteringen in de kwantificering van de haargroei bij muizen zal studie van alopecia modellen te verbeteren en de evaluatie van veelbelovende nieuwe therapieën te vergemakkelijken in preklinische studies.

Inleiding

Alopecia (haaruitval) kan een psychologisch en emotioneel belastend evenement met meerdere oorzaken zijn. Mannelijke kaalheid is de meest voorkomende oorzaak van alopecia, die ongeveer tweederde van de mannen van 35 jaar ^1. Een vergelijkbaar patroon van haarverlies kan worden waargenomen bij vrouwen met polycysteus ovarium syndroom. In beide van deze aandoeningen, is de haaruitval androgeen bemiddeld. Alopecia kan ook optreden als een auto-immuunziekte, alopecia areata, die 1,7% van de bevolking treft ^2. Alopecia kan optreden als een neveneffect van sommige medische behandelingen, zoals chemotherapie ^3. Een hoog percentage (65-85%) van de chemotherapie patiënten ervaren een zekere mate van alopecia ^4,5. De psychologische gevolgen van haaruitval zijn goed bestudeerd in de chemotherapie setting. Chemotherapie geïnduceerde alopecia kan leiden tot angst, depressie, een negatief lichaamsbeeld, verminderd zelfrespect en een verminderd gevoel van welzijn ^6,7. Een hoge percentage (47-58%) van de vrouwelijke kankerpatiënten verhelpen haaruitval de meest traumatische aspect van chemotherapie, en tot 8% daling behandeling van angst haaruitval ^4,6. Er zijn ook aanwijzingen in alopecia androgenetica om therapie om psychologische en zelfs medische gevolgen van haaruitval ^8,9 verminderen ondersteunen. Evenzo is alopecia areata gemeld ernstige psychologische gevolgen ² hebben, en de fragmentarische aard van de haaruitval kan leiden tot een onaangename cosmetisch resultaat dan de meeste andere oorzaken van haarverlies.

Hoewel geneesmiddelen met milde anti-androgene effecten (effecten, spironolacton) werd gebruikt met beperkt succes als therapie voor alopecia, de eerste effectieve medicatie voor alopecia was minoxidil ^10. Deze antihypertensieve heeft een waargenomen bijwerking veroorzaken haargroei en wordt nu gebruikt als topische therapie voor vele vormen van alopecia. Echter, de reacties zijn vaak onvolledig, met een aantal onderwerpen waarin slechts langzaaming van haar verlies in plaats van werkelijke hergroei ^10. Finasteride is een competitieve antagonist II 5α-reductase type welk blokken omzetting van testosteron in dihydrotestosteron, wat resulteert in verbetering van androgene alopecia ten koste van gedeeltelijke systemische androgeen blokkade. Respons met lange termijn (10 jaar) therapie zijn ongeveer 50% ^11. Kortom, ondanks aanzienlijke onderzoek op dit gebied, is er nog geen adequate behandeling voor haarverlies.

Al decennia lang hebben wetenschappers en clinici meetmethoden hoofdhuid haargroei in klinische studies onderzocht. Met de ontwikkeling van geneesmiddelen die de behandeling van alopecia, is er een grotere behoefte aan betrouwbare, economische en minimaal invasieve wijze meten haargroei en specifiek respons op therapie geweest. Beeldanalyse technologie voor een nauwkeurige kwantificering van haardichtheid bij patiënten met haaruitval aandoeningen leverde consistente en betrouwbare resultaten in het verleden met verschillende techniques, inclusief analyse van de gedigitaliseerde beelden ^12, beeldanalyse van individuele haren en huidletsels ^13, en microscopische scannen naar haar massa te kwantificeren in een bepaald hoofdhuid regio ^14.

Helaas, terwijl de bovenstaande methodieken betere beoordeling van de werkzaamheid hebben geleverd voor de haargroei bevorderende interventies in klinische studies, deze methoden niet zijn toegepast om knaagdieren studies in preklinische onderzoeken. Ons doel is om een ​​consistente en betrouwbare methode om haaruitval bij muizen, waardoor de onderzoekers om nauwkeuriger te beoordelen en nieuwe therapeutische benaderingen voor verschillende vormen van alopecia vergelijken kwantificeren ontwikkelen. We hebben een methode met behulp van apparatuur direct beschikbaar in de meeste laboratoria die een snelle en betrouwbare kwantificering van haardichtheid bij muizen met bruin of zwart haar zal toestaan ​​ontwikkeld. Deze methode is getest in muismodellen van chemotherapie-geïnduceerde alopecia, alopecia areata en alopecia uit waxing. Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor het uitvoeren van deze metingen, waaronder de goedkeuring gegevens van C57BL / 6 en C3H / HeJ stammen van muizen. Omdat deze techniek berust op het opsporen lichtabsorptie van pigmenten in de haarschacht, kan het niet worden gebruikt om de haargroei te detecteren in witte muizen of albino muizen.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle studies met dieren moeten door de IACUC van de instelling worden goedgekeurd (voor de gegevens die volgt, werden protocollen goedgekeurd door de Montefiore IACUC, protocol # 11-6-240 en # 13-7-100). Dieren worden voorzien lichte verdoving zoals geïndiceerd voor enig doel waardoor ze nog tijdens het fotograferen, er geen pijnlijke procedures vereist voor dit protocol.

1. Verwerving van Foto

1. Stel focus en gezichtsveld voor gel imager gebruik van papier met gedrukte tekst. Controleer uniformiteit van de lichtbron heel gefotografeerd regio. Om ervoor te zorgen uniformiteit, gebruik dan een gel imager met een ingebouwde lichtbron voor reflectieve fotografie. Heeft een transillumination lichtbron niet gebruiken, omdat dit een silhouet van het dier, die niet geschikt is voor verdere grijstinten analyse zou maken.
   OPMERKING: Dit zal de muis te plaatsen enigszins onscherp, die optische middeling biedt in de hele regio van belang (ROI) en zalhelpen verminderen quantale fouten voor zeer kleine (dwz <10 pixel) regio's van belang. Grotere gebieden van belang zal niet worden beïnvloed door deze minor focussen aanpassing, noch zullen zij worden beïnvloed door verschillen in de grootte van het dier.
2. Verdoven dieren met ketamine (100 mg / ml) / xylazine (20 mg / ml) (2: 1), daar dit een snelle verdoving effect en snel herstel en optimaal is voor het fotograferen van meerdere dieren.
   OPMERKING: Anesthesie wordt bevestigd wanneer het dier is nog steeds genoeg om fotografie mogelijk te maken. Zoals dieren meestal herstellen van deze lichte verdoving binnen 10-15 minuten, heeft de dierenarts niet aanbevolen gebruik van oogzalven.
3. Plaats verdoofde dieren op gel imager in verticale uitlijning (zo dicht mogelijk parallel).
   1. Voor dorsale foto's, plaatst u de dieren in buikligging met ledematen verlengd.
   2. Voor ventrale foto's, plaatst dieren in rugligging, zorg dat de dieren niet zijdelings gedraaid.
4. Plaats grijstinten standaard in gefotografeerd regio.
5. Sluiten toegangsdeur. Belangrijk: Ambient licht kan verschillen in de blootstelling te introduceren.
6. Set F-stop aan een vordering die de regio van belang plaatst binnen het lineaire bereik van de overname (lezen F-stop).
   LET OP: De meeste systemen wordt weergegeven waar het beeld is verzadigd.
7. Neem foto.
8. Verandering F-stop naar een andere belichtingsinstelling die de regio van belang plaatst binnen het lineaire bereik door het verhogen of verlagen van de F-stop door 1, zodanig dat zowel de standaard en de regio van belang blijven in een lineaire reeks van acquisitie (referentie F- stop).
9. Neem foto.
10. Zodra fotografie is voltooid, plaatst dieren op een opwarming tafel en bewaken totdat ze borstligging kan handhaven. Terug dieren hun kooien. De terugkeer van de groep dieren aan de vivarium zodra alle dieren zijn volledig hersteld.

2. Kwantificering van lichtabsorptie

1. Mark regio's van de rente op de beelden van de dieren met behulp van meegeleverde software voor gel imager.
   1. Voor gehele dier dorsaal aanzicht, gebruikt een rechthoekig of ovaal beeld uitstrekt vanaf de bovenste ledematen van de onderste ledematen, zich zijdelings zoveel mogelijk zodanig dat geen deel van de doos voorbij de achterzijde van het dier zoals weergegeven in figuur 1A.
      OPMERKING: Men kan ook markeren het gebied van belang met behulp van een vrije hand tekengereedschap.
   2. Voor hele dier ventrale uitzicht, gebruik 2 rechthoeken: één voor het bekken en een voor de borst zoals weergegeven in figuur 1B.
   3. Voor een kleinere regio van belang, dat wil zeggen, de plaats van toediening van het geneesmiddel, merk naargelang het geval.
2. Mark regio ('s) van de rente op grijstinten absorptie standaard.
3. Neem absorptie van elk van de gemarkeerde gebieden van belang.

3. Analyse

Absorptie niveaus obtained voor de gebieden van belang moet worden genormaliseerd om de achtergrond standaard voor vergelijking van foto's. De relatie van de blootstelling aan de absorptie is log-log (dat wil zeggen, de relatie is lineair tussen log (blootstelling) en log (absorptie)). Met deze verhouding, kan de absorptie van het interessegebied genormaliseerd op een standaard achtergrondwaarde, waardoor absorpties rechtstreeks tussen verschillende foto, ook degene die op verschillende tijdstippen (bijv seriële metingen binnen een protocol) vergeleken worden. De procedure voor het uitvoeren van deze correcties wordt gedetailleerd beschreven in optionele stappen 3.1 en 3.2.

1. (Optioneel) Plot curve van log (exposure) vs. log (absorptie) met waarden verkregen uit grijstinten absorptie standaard.
2. (Optioneel) Pas variaties in de kwaliteit van elke foto als volgt:
   1. Selecteer F-stop voor het lezen (zoals bepaald in stap 1.6) en F-stop voor de referentie (zoals bepaald in sTEP 1.8).
   2. Bereken de gemiddelde absorptie van de standaard in alle foto's op het lezen van F-stop. Dit gemiddelde is de Reference Standard Value (RSV).
   3. Bereken het verschil in absorptie tussen het lezen en referentie F-stop instellingen in elke foto voor de standaard (delta-S) en voor elke toegezegd ROI (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. Bereken de gecorrigeerde absorptie voor elke ROI als volgt: Gecorrigeerde absorptie (ROI-X) = Absorptie (ROI-X) bij het lezen van F-stop + (RSV - absorptie van standaard bij het lezen van F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
3. Compileren experimentele data en data-analyses uit te voeren met behulp van standaard statistische technieken voor continue variabelen (dat wil zeggen, ANOVA, T-test).

Resultaten

Deze techniek werd gevalideerd met C3H / HeJ geënt muizen, de muis-model van alopecia areata ^16. Deze dieren ontwikkelen wereldwijde haaruitval die vordert geleidelijk in de tijd. Echter, de haaruitval optreedt in patches, en kan variëren van een muis naar het volgende, de invoering van aanzienlijke variabiliteit en het verhinderen van kwalitatieve beoordelingen. Dit model bood de gelegenheid om correlaties tussen de metingen van de optische dichtheid te testen op verschillende locaties op de muis als een beo...

Discussie

In dit rapport wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van een nieuwe techniek voor het kwantificeren van haarverlies bij knaagdieren. Deze techniek maakt gebruik van een gel imager voor het verwerven en analyseren, apparatuur die gemakkelijk beschikbaar in de meeste laboratoria. De metingen hebben aangetoond robuust kleine variaties in de techniek (figuren 4-5) zijn, en zijn goed gecorreleerd aan de mate van visuele haarverlies bij behandelingsvormen (figuur 6). Deze technieken z...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		Gel-imager voor het verkrijgen en analyseren van foto's, moet beschikken over een ingebouwde lichtbron voor reflectiefotografie.
The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale	Imatest		Grijschaalstandaard
C57BL/6J muizen	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Muizen voor representatieve studie
C3H/HeJ geentgrafte muis	Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine		Muizen voor representatieve studie