High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

Samenvatting

Het doel van fluorometrische analyse dienen als een efficiënte, rendabele, high throughput werkwijze voor het analyseren fagocytose en andere cellulaire processen. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van celtypen, zowel hechtende en niet-hechtende, om een ​​verscheidenheid van cellulaire eigenschappen onderzocht. Bij het bestuderen van fagocytose, fluorometrische technieken gebruikt fagocytische celtypes zoals macrofagen en fluorescent gelabelde geopsoniseerde deeltjes waarvan de fluorescentie gedoofd in aanwezigheid van trypan blauw. Na plating hechtende macrofagen in 96-well platen, fluorescerende deeltjes (groen of rood) toegediend en cellen mogen fagocyteren voor uiteenlopende hoeveelheden tijd. Na internalisering van fluorescerende deeltjes, worden de cellen gewassen met trypan blauw, die uitdoving van fluorescent signaal maakt van bacteriën die niet zijn geïnternaliseerd, of alleen hechten aan het celoppervlak. Na de trypan wassen worden de cellen gewassen met PBS, gefixeerd, eennd gekleurd met DAPI (nucleaire blauw fluorescent label), die dient om kernen van cellen te labelen. Door een simpele fluorometrisch kwantificering door plaat lezing van nucleaire (blauw) of een deeltje (rood / groen) fluorescentie kunnen we de verhouding van de relatieve fluorescentie-eenheden van groene onderzoeken: blauw en bepalen een fagocytische index indicatief bedrag van fluorescerende bacteriën geïnternaliseerd per cel. De duur van de test met behulp van een 96-well methode en multichannel pipetten voor het wassen, van eind tot eind fagocytose data acquisitie, minder dan 45 min. Flowcytometrie kan worden gebruikt op soortgelijke wijze maar het voordeel van fluorometrie is zijn hoge throughput, snelle beoordelingsmethode met minimale manipulatie van monsters en snelle kwantificering van fluorescentie-intensiteit per cel. Soortgelijke strategieën kunnen worden toegepast op niet hechtende cellen, levende gemerkte bacteriën, actine polymerisatie en wezen elke werkwijze waarbij fluorescentie. Daarom fluorometrie is een veelbelovende methode voor de lage kosten, hoge throughput-mogelijkheden in de studie van cellulaire processen.

Inleiding

Kwantificering van fluorescentiesignaal is op grote schaal gebruikt in een groot aantal wetenschappelijke methoden variërend van PCR, flowcytometrie, confocale microscopie en FRET analyse multiplexen ELISA. Fluorescentie beeldvorming en kwantificering heeft een brede toepassing en kan een geweldig hulpmiddel voor de kwantitatieve analyse van verschillende cellulaire processen zijn. Het gebruik van fluorescente merkers en het signaal is een revolutie in het afgelopen decennium ontstaan ​​van fluorescerende plaatlezers heeft de hoge doorvoer kwantificering van fluorescentie uitgezonden tijdens cellulaire processen vergemakkelijkt.

Fluorimetrische analyse kan dienen als een groot hulpmiddel kwantificering van fagocytose. Fagocytose is onderzocht sinds de ontdekking van fagocyten door Metchnikoff in 1800 ^1. Loop der jaren is een verscheidenheid van werkwijzen toegepast om deze belangrijke proces onderzoekt essentieel innate immune afweer tegen binnendringende bacteriën, virussen, schimmels en parasitaire pathogenen ^2-5. Vorige werkwijzen kwantificering gebruikte microscopie en stereological technieken om cellen die fagocytose, die vervolgens werden gekwantificeerd door het tellen van geïnternaliseerde deeltjes (handmatig of met behulp van software) ^6-8 visualiseren. Een aantal nadelen aan het gebruik van microscopie alleen voor de kwantitatieve analyse zijn dat handmatige telling van bacteriën is arbeidsintensief en meer vatbaar voor waarnemer vooringenomenheid. Een andere werkwijze die voor kwantificering van fagocytose is de microbiologische techniek uitplaten van bacteriën uit cellysaten (na fagocytose) van bacteriën kweekplaten, maar deze methode kan alleen verklaren bactericide mechanismen en aanwezigheid van gedeeltelijk geïnternaliseerde bacteriën. Deze methode is nog arbeidsintensiever vergelijking met microscopie en duurt enkele dagen te analyseren. Flowcytometrie lijkt de snelste, meest effectieve manier om fagocytose te kwantificeren zijn en is gebruikt door vele groepen ^9-11, maar de hoge kosten vaak geassocieerd met de instrument oog op de analyse maakt het de meest dure methode in vergelijking met de eerder genoemde assays.

De fluorometrische werkwijze is een goed alternatief voor flowcytometrie analyse van deeltjes internalisatie omdat het biedt onpartijdige kwantificering van fluorescentie met apparatuur die niet zo onbetaalbaar. Andere extra voordelen van fluorometrie zijn hoge efficiency, en hoge doorvoer mogelijkheden voor het kwantificeren van fluorescentie uitgezonden door de gelabelde geïnternaliseerde deeltjes.

Voordelen van fluorometrie kan worden geëxtrapoleerd naar kwantificering van andere dan fagocytose processen. Zo kan fluorometrische analyse toegepast op elk proces dat leidt tot veranderingen in expressie van intracellulaire of membraangebonden receptoren, veranderingen in celdoorlaatbaarheid / levensvatbaarheid, transfectie efficiëntie en modulatie in actine polymerisatie bestuderen. Een nadeel van fluorometrische techniek is dat, afhankelijk van de gebruikte etiketten, kan er een hoogexperiment om variabiliteit die meestal kan worden opgelost door aan te tonen van gegevens door middel van relatieve kwantificatie, zoals voudige verandering of procent stijging van controle experimenteren.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt voor meerdere toepassingen zoals kwantificering van fagocytose en actine polymerisatie zoals toegepast in onze eerder gepubliceerde werk ^12. Het protocol leent zich voor verschillende wijzigingen, en tabel 1 staan ​​celtypes en deeltjes met succes gebruikt in eerdere studies. Standaard gebruik van dit protocol voor de kwantificering van fagocytose of actine polymerisatie wordt weergegeven in grafiek 1.

Diagram 1:. Schema van fluorometrische assay voor het kwantificeren van fagocytose en actine polymerisatie Nadat de cellen geplateerd, behandeld, en liet hechten, partikels gelabeld met groene fluorescentie (FITC) worden toegevoegd aan de cellen voor fagocytose. De reactie wordt gestopt door trypan of antibiotic wash (voor niet-geïnternaliseerde deeltjes te elimineren) en fixatie wordt uitgevoerd met 4% paraformaldehyde. De cellen worden vervolgens gekleurd met rode fluorescerende actine label (rodamine phalloidin) en blauw fluorescent label (DAPI). Indexen van de fagocytose en actine polymerisatie worden gekwantificeerd als een verhouding van relatieve fluorescentie-eenheden van groen / blauw (FITC / DAPI), of rood / blauw (rodamine / DAPI) fluorescentie.

1. Plating en behandelen van Cellen

LET OP: Voordat u begint, overweeg dan het uitvoeren van de behandelingen met minstens 4 technische herhalingen, en omvatten de volgende controles in de plaat lay-out: alleen cellen (ongekleurd, met DAPI alleen of rodamine alleen) alleen en deeltje.

1. Voer alle toevoeging van reagentia in stappen 1-4 in een steriele celkweek kap om de monsters te beschermen tegen vervuiling.
2. Plate macrofagen (muizen J774 cellijn) in een 96-putjes plaat bij 5/1 x 10 ⁴ cellen in 50 ul (per putje) van aangevuld voorverwarmde media. Ideaal platen voor deze methode zwarte 96-putjesplaten met heldere of zwarte bodems, afhankelijk lezer mogelijkheden.
   1. Voor aangevuld medium gebruikt 10% warmte geïnactiveerd FBS interferentie van complement cascade voorkomen, en 1% penicilline / streptomycine (wanneer geen levende bacteriën fagocytose). Bij gebruik van hechtende cellen staan ​​1-2 uur hechting, en voor niet-hechtende cellen, het afsluiten van de plaat met cellen gedurende 10 min bij 500 x g.
3. Voeg gewenste agonisten / antagonisten of het voertuig op 2x concentratie (opnieuw gesuspendeerd in PBS of met meer voorkeur, in aangevuld medium) in 50 ul van een eindvolume van 100 pl (1x) en incubeer gedurende een gewenste tijd. Meerkanaalspipet en reagentiareservoirs zal snelste verwerking te vergemakkelijken.

2. opsonisatie van fluorescerende deeltjes

ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/>
Tabel 1: Getest celtypes en fluorescerende deeltjes in fluorometrische analyse van fagocytose en actine polymerisatie Tabel 1 illustreert combinaties van celtypen (cellijnen en primaire cellen) dat onze groep die via de fluorometrische methode.. Anders dan kijken fagocytose en actine polymerisatie door wild-type cellen, hebben we ook gebruikt sommige van deze deeltjes voor het onderzoek van fagocytose door getransfecteerde cellen die GFP (groen fluorescent eiwit). Fluorescentie van de cellen getransfecteerd met plasmiden die fluorescente reporters kan worden gebruikt als een cellulaire marker naast DAPI Tabel legende:. A - actine polymerisatie; P - fagocytose; PT - fagocytose door GFP gemerkte getransfecteerde cellen; OPDex - opsonized dextran kraal; HKOP - hitte gedood opsonized.

1. Zorg ervoor dat fluorescerende deeltjes en labels worden beschermd tegen het licht te allen tijde, during verwerking, wassen, evenals tijdens de incubatie om te voorkomen fotobleken
   1. Voor de droge deeltjes, wegen uit fluorescerende hitte gedood opsonized (HKOP) bacteriën (E2861: E. coli K-12 stam), met behulp van de specificaties van de fabrikant. Zorg ervoor dat de massa rekeningen is 10: 1 - 20: 1 bacteriën: celverhouding (of ten minste 10: 1 verhouding - gewoonlijk in kwantificering van fagocytose) ^13,14. Aantal deeltjes kunnen door de fabrikant of bepaald via couting seriële verdunningen van 1 mg / ml voorraadoplossing.
   2. Resuspendeer in 50 ul PBS en vortex gedurende 1 minuut op de hoogste instelling. Zorg voor een goede vortexen (hier en in het protocol) als de deeltjes de neiging te aggregeren die werkzaamheid van opsonisatie kunnen beïnvloeden.
   3. Voor deeltjes in suspensie zoals fluorescent gelabelde dextran kralen (DEX kralen), vortex de voorraadoplossing gedurende 1 min, neem 50 pl suspensie of afhankelijk van de kraal concentratie in het volume d1 kraal:: etermine mount van kralen om 10 te vergemakkelijken cel ratio.
2. Voeg een gelijk volume van het opsoniserende reagens aan de deeltjes en krachtig vortex nog een minuut.
3. Incubeer de deeltjes met opsoniserende reagens bij 37 ° C gedurende 1 uur.
4. Na de incubatie, centrifuge de deeltjes gedurende 5 min bij 500 xg en verwijder het supernatant die een overmaat opsoniserende reagens. Was de deeltjes door het toevoegen van 100 ul PBS, vortex de pellet en centrifugaat mengen gedurende 5 minuten bij 500 x g.
   1. Herhaal deze stappen twee keer om een ​​goede opsonisatie en verwijdering van ongebonden antilichaam te verzekeren.
5. De werkoplossing van opsonized deeltjes door resuspenderen in 5 ml medium (voldoende voor een 96-well plaat) en uit de buurt van licht tot toevoeging aan de cellen.

3. Fagocytose

1. Plaats de werkoplossing van deeltjes in een steriele reagensreservoir. Vanaf hier, voeg 5056; l opsonized deeltjes de volgens stap 1 (een eindconcentratie van 50 ng / ml) cellen en laat fagocytose optreedt bij standaard celkweekomstandigheden. Hieronder afgebeeld zijn twee methoden van fagocytose, die kan worden bepaald met behulp van deze methode (diagram 2).

Diagram 2. Vergelijking van versus continu synchroniseren fagocytose Continue fagocytose geeft continue internalisatie deeltjes tijd als ze langzaam de cellen op de bodem van de put bereikt. Een contrasterende synchronisatie stap (centrifugeren) dwingt de deeltjes bezinken, waarmee de deeltjes contact met de cel, en leiden tot onmiddellijke internalisatie door de cellen. Gesynchroniseerd fagocytose is een sneller proces dat sneller internaliseert deelicles vanwege de verhoogde cel: deeltje contact.

1. 1. Voor de continue fagocytose methode (schema 2) waarmee cellen voortdurend fagocyteren opsonized bacteriën ze langzaam zinken naar de bodem en in contact komen met cellen, gebruik langere frames om de bacteriën aan de bodem van de put te bereiken en in raken met de cellen. Bij het uitvoeren van een tijdsverloop experiment bacteriën toe te voegen op verschillende tijdsintervallen en stop het gehele bord reacties tegelijkertijd de verwerkingssnelheid te vergroten.
   2. Voor de gesynchroniseerde fagocytose methode (schema 2) dat deeltjes verbetert: celcontact via centrifugatie, het afsluiten van de gehele plaat met cellen en deeltjes (5 min bij 500 xg) zodra de deeltjes toegevoegd, om synchronisatie van alle tijdstippen vergemakkelijken en celinteractie: om het deeltje te versnellen.
      1. Meet het tijdsverloop begint direct na de voltooiing van de Centrifugation stap. Bij het uitvoeren van een tijdsverloop experiment stop elk tijdstip onafhankelijk verschillende tijdsintervallen zoals hieronder beschreven.

OPMERKING: De gesynchroniseerde fagocytose methode iets omslachtiger dan de vorige, maar geeft hogere fagocytose index in een kortere tijd.

4. Stoppen Fagocytose

1. Voor hechtende cellen, verwijder het supernatant en voeg 50 pl verdund trypan blauw met PBS (1: 2 verdunning), teneinde fluorescentie van niet-geïnternaliseerde bacteriën blussen.
2. Voor niet-hechtende cellen, spin down de plaat en verwijder supernatant. Voeg 50 ul van de verwaterde trypaanblauw. Controleer aan de plaat (5-10 min bij 500 xg) tussen elke wassing gecentrifugeerd om de cel te minimaliseren en mogelijk voldoende wassen.
3. Na trypan incubatie, wassen cellen tweemaal met PBS om resten trypan verwijderen (tot de PBS uit de put verwijderd wordt helder). Trypan is aangetoond ^15,16 fluorescentie van niet-geïnternaliseerde fluorescent gemerkte, hitte gedode, bacteriële deeltjes doven, maar niet levende bacteriën of OPDex kralen. Voor levende bacteriën, zijn voorzien van een wasbeurt met antibiotica zoals penicilline, streptomycine, of gentamicine in plaats van de trypaan wassen om verstorende effecten van de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde deeltjes te voorkomen.
4. Bevestig cellen met 100 pl 4% paraformaldehyde, en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, daarna wassen met PBS (100 ul per putje per wasbeurt). Bij deze stap sparen de cellen bij 4 ° C gedurende maximaal een week, of direct doorgaan naar kleuring en kwantificering.
   OPMERKING: Alle volgende stappen vormen dit punt voorwoord kan buiten de celkweek kap worden gedaan.
5. Verwijder alle vloeibare en voeg 50 ul van DAPI bij 5 ng / ml gereconstitueerd in PBS. Laat 5 min voor het kleuren, en dan twee keer wassen met PBS. Na de wasstap, voeg 50 ul van PBS aan elk putje en opnemen fagocytose.

5. actinekleuring

OPMERKING: Naast fagocytose zullen fluorometrische wijze kwantificeren actine polymerisatie mogelijk door het meten van de intensiteit van actine, die in remming van lamellipodia, pseudopodiae verminderd en membraan plooien als gevolg van een behandeling met een remmer (figuur 1A). Deze stap is optioneel indien geïnteresseerd in kwantificering van actine polymerisatie naast fagocytose. Als actine polymerisatie is het uiteindelijke doel, met fluorescerende deeltjes voor fagocytose is optioneel.

1. Volgende paraformaldehyde fixatie (stap 4.3), was de plaat tweemaal met PBS bij 100 ul per putje voor elke wasbeurt. Voeg 50 pl 0,1% Triton X-100 in PBS permeabilisatie en incubeer gedurende -5 minuten bij kamertemperatuur.
2. Spoel 0,1% Triton X-100 2 maal met PBS (zoals hierboven), en blok met 1% runderserumalbumine (BSA) gedurende 20 min niet-specifieke binding van de labe te vermijdenl.
3. Naar aanleiding van het blokkeren, verwijdert u de BSA-oplossing en voeg onmiddellijk rodamine phalloidin. De werkende oplossing van rhodamine vlek bereiden, gebruik 100 ul methaanzuur oplossing (geleverd door de fabrikant) in 5 ml PBS (voldoende voor één plaat). Uit de werkoplossing voeg 50 ul per putje en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: De stappen wassen en DAPI kleuring als in stap 4.4 cellen zal klaar zijn voor kwantificering zijn.

6. Kwantificering

1. Om de fagocytose met behulp van een fluorescerende plaat lezer, opnemen groene fluorescentie behulp excitatiefilter bij λ = 488 nm en emissie-filter te kwantificeren bij λ = 518 nm, en een blauwe fluorescentie behulp excitatiefilter bij λ = 355 nm en emissie filter bij λ = 460 nm.
2. Aan de actine polymerisatie met behulp van een fluorescerende plaat lezer, opnemen blauwe fluorescentie te kwantificeren via λ = 355 nm en λ = 460 nm (zoals hierboven), en rode grieporescence via excitatiefilter bij λ = 584 nm en emissie filter λ = 620 nm.
   OPMERKING: Orbital of centrale detectie is aanvaardbaar voor opname. Sommige celtypen verzamelen meer naar de rand van de put dan het midden, waarbij orbitale registratie van voordeel zijn. In het bijzonder zou gemiddeld drie punten rond de baan ook gebruikt worden om nauwkeurigere resultaten te verkrijgen.
3. Verdeel het totale RFU van groene of rode fluorescentie met blauwe fluorescentie uitlezing (van DAPI), afhankelijk van het deeltje etiket of fagocytische versus actine kwantificering (Figuur 1). Vanwege de hoge plate-to-plate variantie Gebruik relatieve indexen (bijvoorbeeld ten opzichte van t = 0 control), optimaal illustreren tendensen en trouwbaarheid vergemakkelijken.

Resultaten

Twee belangrijke manieren kwantificeren fagocytose en de daaropvolgende actine polymerisatie door het gebruik van dit protocol is het continue of gesynchroniseerde fagocytose observeren.

Microscopische analyse (Figuur 1B) illustreert fluorescerende beelden vergelijkbaar met wat de fluorometer opneemt (zie ook grafiek 1). In figuur 1B zijn rode fluorescentie van actine, groen 268 fluorescentie van FITC etiketten HKOP E. coli, nucleai...

Discussie

Belangrijke beperkingen van de fluorometrische technieken zijn variantie en celverlies geassocieerd met uitgebreid wassen en gebruik van niet-hechtende cellen.

Variantie is grotendeels waargenomen als gevolg van de variatie in de fluorescente deeltjes wegen en pipetteren tijdens de bereiding van de voorraadoplossing geen exacte manier die hetzelfde aantal deeltjes uit experiment experimenteren. Om het probleem van de variantie tussen de experimenten aan te pakken, kunnen de gegevens worden u...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 μm geel-groene fluorescente Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combineer 50μl met 50μl opsoniserend reagens gedurende 30 min bij 37oC vóór gebruik
Verhit dode E. coli BioParticles fluoresceïnekonjugaat	Molecular Probes	E2861	reconstitueer (5 mg) in 50 μl PBS en combineer met 50 μl opsoniserend reagens gedurende 30 min bij 37 °C vóór gebruik
Opsoniserend reagens	Molecular Probes	E2870
Rodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blauw	Gibco	15250-061
De onderstaande items zijn verkrijgbaar bij veel merken, maar de items die we in dit onderzoek hebben gebruikt, zijn van de volgende fabrikanten:
RPMI Celgroeimedia	Gibco		Aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine; opwarmen in 37 °C vóór gebruik
Fluorescente platenlezer - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	verdun tot 4% vóór gebruik
96-wells platen	Greiner	655097	helder of zwart of helder bodem - zwarte platen
Multikanaals pipet (8 - 12 kanalen)
Reagens reservoirs
1x PBS
Microfuge buizen (0,6 ml)
Conicles (10 ml)