Methodenartikel

Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal In Vivo Beeldvorming van de Muis Spinal Cord

14.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52196

⸱

3 december 2014

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

In dit artikel

Samenvatting

In deze video, beschrijven we een werkwijze voor het implanteren van een chronische optische beeldvorming kamer via dorsale ruggenmerg van een levende muis. De kamer, chirurgische ingreep, en chronische beeldvorming worden beoordeeld en aangetoond.

Samenvatting

Studies in de neocortex van zoogdieren hebben een ongekende resolutie mogelijk gemaakt van corticale structuur, activiteit en respons op neurodegeneratieve aanvallen door herhaalde, time-lapse in vivo beeldvorming bij levende knaagdieren. Deze studies werden mogelijk gemaakt door eenvoudige chirurgische procedures, die optisch toegang mogelijk maakten voor een langere periode zonder herhaalde chirurgische procedures. In tegenstelling daarmee, waren analoge studies van het ruggenmerg eerder beperkt tot slechts een paar beeldvormingssessies, die elk een invasieve chirurgie vereisten. Zoals eerder beschreven, hebben we een ruggenmergkamer ontwikkeld die continue optische toegang mogelijk maakt voor maximaal 8 weken, de mechanische stabiliteit van de wervelkolom behoudt, gemakkelijk extern kan worden gestabiliseerd tijdens beeldvorming en slechts een enkele chirurgie vereist. Hier wordt het ontwerp van de ruggenmergkamer met de bijbehorende chirurgische implementa is beoordeeld en de chirurgische procedure wordt in detail gedemonstreerd. Kort gezegd, deze video zal de voorbereiding van het chirurgische gebied en de muis voor de operatie demonstreren, de blootstelling van de wervels en het juiste weefseldebridement, de levering van het implantaat en het klemmen van de wervels, de voltooiing van de kamer, de verwijdering van het leveringssysteem, het afdichten van de huid en tenslotte, postoperatieve zorg. De procedure voor chronische in vivo beeldvorming met behulp van niet-lineaire microscopie zal ook worden gedemonstreerd. Ten slotte worden de resultaten, beperkingen, typische variabiliteit en een handleiding voor het oplossen van problemen besproken.

Inleiding

Time-lapse in vivo microscopie in intacte organismen in staat stelt de directe visualisatie van complexe biologische processen die niet toegankelijk zijn voor de traditionele single-tijdstip analyse, zoals immunohistochemie. Specifiek, multi-photon microscopie (MPM) 1 maakt beeldvorming strooischijf weefsel, zoals knaagdieren neocortex, waar beeldvorming tot 2,3 en meer dan 4 1 mm is bereikt. In combinatie met chirurgische preparaten 5-7 waarin één procedure kan optische toegang tot de hersenen gedurende weken tot maanden, zijn deze microscopie benaderingen gebruikt om dynamische processen in de hersenen van gezonde en zieke toestanden 8-11 bestuderen. Daarnaast zijn protocollen ontwikkeld 12,13 die voor in vivo beeldvorming wakker (dwz niet verdoofde) dieren, waardoor cellulaire resolutie functionele beeldvorming tijdens behavioral tests. Deze protocollen zijn gebruikt voor comparisons van gecorreleerde neuronale activiteit 14, astrocyten calcium signalering 15 in verdoofde en wakkere dieren, de identificatie van taakspecifieke neuronale clusters 16, en het vermogen van neuronen om objectlocatie discrimineren op snorhaar stimulatie 17.

Gezien het potentieel van deze benadering helderen gezonde en pathologische mechanismen time-lapse in vivo beeldvorming werd op de muis ruggenmerg (SC), voor de identificatie van acute axonale degeneratie (AAD) als ziektemechanisme 18. Latere studies onderzochten effecten van perifere laesies op de dorsale wortel ganglia (DRG) axon regeneratie 19, de rol van bloedvaten in axon regeneratie 20, gliale chemotaxis in respons op letsel 21, T-celmigratie in experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) 22 activiteit van microglia en astrocyten 23,24 25 reactie op amyotrophic laterale sclerose (ALS), de rol van de STAT-3 in axonale kiemen na SC letsel (SCI) 26, en een mechanisme van axon verlies en herstel in EAE 27. Ondanks het succes van deze benaderingen werden al deze studies beperkt tot een enkele opnamesessie, waardoor studies beperkt tot kortetermijndynamiek of anders vereist herhaalde chirurgische openingen van het dier op elk tijdstip beeldvorming, beperken van het aantal tijdstippen toegankelijk en het vergroten van de kans op verstorende experimentele artefacten. Protocollen voor deze operaties zijn eerder 28,29 gepubliceerd.

Onlangs publiceerde we een techniek 30 voor de implantatie van een chronische spinale kamer die time-lapse MPM beeldvorming in de muis SC gedurende meerdere weken ingeschakeld zonder herhaalde operaties. In het kort, deze chirurgische preparaat uitvoeren laminectomie in de onderste thoracale wervelkolom en de implantatie van een vierdelige kamer. De kamer opgenomendrie aangepaste-bewerkte onderdelen van roestvrij staal dat de wervels rond de laminectomie, en een glas dekglaasje geplaatst over de SC en vastgezet met siliconen elastomeer geklemd. Deze techniek toegestaan ​​voor routine beeldvorming uit tot meer dan 5 weken na de operatie in gezond en gewond staten zonder de noodzaak voor herhaalde operaties. Het aantal beeldvormende tijdstippen werd beperkt door de frequentie waarbij het dier anesthetische inductie kan verdragen. Imaging levensduur beperkt door de groei van een dichte vezelachtige weefsel over het oppervlak van de SC. Daarnaast hebben we vastgesteld dat de chirurgische implantaten op lange termijn geen effect op de motorische functie gehad.

Sinds onze eerste publicatie, hebben alternatieve benaderingen waarmee tevens de lange termijn beeldvorming in de SC elders 31-33 beschreven. Dit protocol toont onze procedure voor het implanteren van de spinale ruimte die we ontwikkeld.

Protocol

OPMERKING: De zorg en experimentele manipulatie van alle muizen in dit document werd goedgekeurd door de Cornell University Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Instellen voor Heelkunde

  1. Steriliseren van alle benodigde gereedschappen met behulp van een autoclaaf of goedgekeurd sterilisatie procedures. Op een minimum, onder andere een scalpel, schaar, vanna schaar, tang, schroevendraaier juwelier, wattenstaafjes, een set van retractors, het implantaat (Figuur 1A) en de levering systeem (figuur 1D, E).
  2. Vegen van alle oppervlakken, inclusief eventuele stereoscoop knoppen, met 70% ethanol en / of geschikte ontsmettingsmiddelen.
  3. Maak een steriele veld door overlappen de aangepaste stereotax (figuur 1D) en de omliggende tafelmodel met steriele doeken. Een verwarmingselement (bij voorkeur terugkoppeling geregeld) moet bovenop de stereotax en onder steriele doeken geplaatst.

2. Voorbereidingde Muis voor Heelkunde

  1. Verdoven een muis onder de 5% isofluraan / zuurstof in een inductie kamer totdat ademhaling vertraagt ​​tot ongeveer 1 adem / sec.
  2. Transfer muis om een ​​staging-ruimte weg van het steriele veld, met behulp van een neuskegel aan isofluraan blootstelling blijven. Verminder isofluraan tot 2%. Toepassing ogenzalf om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  3. Dien glycopyrrolaat (een anticholinergicum) bij 0,05 mg / 100 g muis intramusculair in de achterpoten met 29-30 G naalden en 10/3 cc spuit, goed voor ongeveer 50% van het injectievolume per ledemaat.
    OPMERKING: Glycopyrrolaat dient om vochtophoping voorkomen in de longen, terwijl de muis onder verdoving.
  4. Met elektrische tondeuse, scheren een gedeelte van het dorsale aspect van de muis ongeveer 3 cm lang en 2 cm breed en gecentreerd op de thoracale boog. Reinig elke geknipt haar goed uit de buurt van het geschoren gebied.
  5. Dien de volgende injectie subcutaan en distaal van de geschorenpatch met 29-30 G naalden en 10/3 cc spuiten: 1 ml / 100 g muis 5% glucose in zoutoplossing (hydratatie), 5 mg / kg muis ketoprofen (een NSAID voor analgesie), 0,2 mg / kg muis dexamethason ( een anti-inflammatoire steroïden om ontstekingen te verminderen).
  6. Met behulp van wattenstaafjes, voeren drie afwisselende wasbeurten van jodium en 70% ethanol, wacht 1 min tussen wasbeurten.
  7. Dien 100 pl 0,125% bupivacaïne (een perifere zenuwblokkade) subcutaan met 29-30 G naalden en 10/3 cc spuit aan het midden van de geschoren patch om pijn te verminderen op de incisieplaats.
  8. Transfer muis om de aangepaste stereotax (figuur 1D), plaatst rectale thermometer, en wacht ongeveer 10 min voor bupivicaine door te voeren.

3. Expose en Reinig de Dorsale Lamellenpakketten van 3 Aangrenzend borstwervels

  1. Met behulp van de scalpel, het creëren van een kleine (5 mm of minder) incisie boven de wervels van belang (figuur 2A).
  2. Via zowel tang of door de tip van de chirurgische schaar en de handgrepen verspreiden, de grootte van de opening in de huid door stompe dissectie.
  3. Met behulp van een scalpel of chirurgische schaar, zacht dissociëren bindweefsel fascia tussen de huid en de onderliggende spieren.
  4. Gebruik retractors te leggen dat de huid, waardoor een zo groot werkgebied mogelijk (Figuur 2B). Zorg ervoor dat u de belasting op de borst te verhogen en zo de ademhaling belemmeren.
  5. Met een pincet, pak de rostrale meest wervel die wordt belicht door de bovenliggende spier. Met een scalpel uitgesneden weefsel afstand aan weerszijden van het dorsale proces van alle 3 wervels (figuur 2c).
  6. Met behulp van een combinatie van een scalpel, wattenstaafjes, en / of bot schraper, verwijder alle bovenliggende weefsel uit de dorsale laminaten (figuur 2D).
  7. Met chirurgische schaar, zorgvuldig pezen aan de wervels beide latera weggesnedenl randen van de wervelkolom (figuur 2E).
  8. Met de scalpel, verwijder voorzichtig zoveel weefsel van de zijranden van de wervelkolom mogelijk om een ​​schone klemmende oppervlak.
  9. Zachtjes debrideren de wervels van de overige zacht weefsel met behulp van een bot schraper en / of wattenstaafje. Trim elke ongerijmde weefsel elders gebruik chirurgische schaar (figuur 2F) afstand.
    Opmerking: Het is essentieel voor zowel klem- en uitvoeren van de dorsale laminectomie de wervels netjes worden blootgesteld. Een cauterizer kan nuttig zijn bij het beheersen volgende bloeden zijn.
  10. Shift oprolmechanismen te leggen dat het weefsel rondom de wervelkolom naast de huid (figuur 2F).
  11. Bevestig het implantaat side bars aan de pinnen van de levering berichten en laadt deze in de post-houders (zoals in figuur 1E).
  12. Klem de 3 wervels met behulp van de side bars, het toepassen van net genoeg druk om securel houdeny (figuur 2G, H). Gebruik een tang om te helpen zorgen voor een niveau klemming van het 3 wervels. Merk op dat verschillende pogingen nodig zijn. Zorg dat de kant bars zijn zowel niveau en parallel voorafgaand aan het uitvoeren van de laminectomie.
  13. Zorgvuldig schoon en droog het dorsale oppervlak van de ingeklemde wervels met behulp van wattenstaafjes.

4. Voer een dorsale Laminectomie

  1. Steek de uiteinden van de Vannas schaar in de epidurale ruimte van de mediale geklemde wervel en knijp de handgrepen licht; Als het bot droog is, moet scheur langs de lengte van de dorsale lamina. Herhaal deze procedure aan de contralaterale zijde van de lamina los.
  2. Zachtjes het vastgrijpen van de losse lamina door de dorsale proces met een pincet, zorgvuldig weggesneden elke bindweefsel in de rostrale en caudale uiteinden van de lamina en til het weg.
  3. Met behulp van 0,9% zoutoplossing en / of kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF), grondig wegspoelen geen bloed overlying het ruggenmerg. Gebruik wattenstaafjes om overtollig vocht te absorberen.
  4. Met Vannas schaar voorzichtig trim de zijranden van het bot naar de zijbalken van het implantaat. Nogmaals, weg te wassen en het bloeden onder controle met behulp van wattenstaafjes en zout / ACSF.
  5. In het geval dat een deel van het periost is vrijstaand en ligt over het ruggenmerg, verwijder voorzichtig dit weefsel met behulp van wattenstaafjes en / of een 29-30 G naald. Let er dan op het ruggenmerg verwonden in dit gedeelte van de procedure. Niet te verwarren met de losse periost met de stevig verpakt dura mater.
  6. Voorzichtig verzegel de resterende vrijliggende randen van het bot met een of beide van tandheelkundige acrylaat en cyanoacrylaat (figuur 2I). Wees extra voorzichtig niet om de lijm te laten stromen op het blootliggende ruggenmerg.

5. Seal de Kamer

  1. Plaats de bovenplaat zorgvuldig, zodat de 4 slots line-up met de 4 gaten aan de zijkant bars en de opening ligt over de blootgestelde spin-al koord (Figuur 1B en 2J).
  2. Met behulp van een schroevendraaier van de juwelier, voorzichtig beginnen de eerste schroef, het stabiliseren van de schacht van de schroevendraaier met een ander paar pincetten. Draai de schroef in dit stadium, maar plaatst het zo dat de eerste paar draden worden betrokken. Herhaal dit proces voor de andere 3 schroeven.
    LET OP: Het is nuttig om titanium of andere niet magnetiseer- tang gebruiken om de positie te helpen de schroeven in dit stadium.
  3. Met alle 4 schroeven op zijn plaats, draai elke schroef afwisselend met hetzelfde bedrag in kleine stappen, totdat de schroeven stevig zijn vastgezet (figuur 2K). Merk op dat het niet ongebruikelijk dat de bovenplaat buigen tijdens dit proces. Zorg ervoor dat u de schroeven te veel, als de schroef hoofd kan breken en overmatige neerwaartse druk zal de klem los te maken en / of resulteren in een dwarslaesie.
  4. Gebruik een siliconenelastomeer om de ruimte tussen het ruggenmerg en het glasraam vullen. Omdat het does niet produceren azijnzuur tijdens het uitharden, gebruiken KwikSil merk elastomeer en mengtips. Breng een royale portie van de siliconen om de blootgestelde ruggenmerg. Zorg om zich te ontdoen van een siliconen bevatten luchtbelletjes uit de mengtip vóór toepassing van het ruggenmerg te krijgen.
  5. Snel te werken, drukt u voorzichtig op een 5 mm # 0 dekglaasje in de inzet in de bovenste plaat. Breng voldoende druk geleidelijk knijp de vloeistof elastomeer aan het ruggenmerg, maar niet tot ruggenmergcompressie (Figuur 2L). Instellen van de tijd voor het elastomeer is ongeveer 90 sec, dus zorg ervoor dat het dekglaasje wordt snel toegepast.
  6. In het geval van een mislukte afdichting, wachten tot het elastomeer heeft ingesteld, verwijdert u deze voorzichtig uit het implantaat met een pincet, en herhaal 5,4-5,5.
  7. Bedek de randen van afgescheiden elastomeer met tandheelkundige acrylaat / cyanoacrylaat en zich aan het omringende bot zoveel mogelijk te voorkomen dat het elastomeer schuiven over het oppervlak van het ruggenmerg.
  8. Verwijder retractors en trek de huid rond de rand van het implantaat. Met cyanoacrylaat, hechten de huid aan de randen van het implantaat (Figuur 2 M, N).
  9. Plaats # 0-80 - 1/4 "set schroeven in de vleugels van de bovenste plaat (figuur 1C en 2 O).
  10. Met behulp van tandheelkundige acryl, verzegelen eventuele lacunes in de schroef sleuven van de bovenste plaat (figuur 2P).

6. postoperatieve zorg

  1. Verwijder dier uit narcose en plaats in een grote schone kooi. Zorg ervoor dat de kooi is voldoende groot dat de kamer niet haken op iets (zoals de v-vormige dip voor een waterfles en / of voedsel) tijdens normale voortbeweging hele kooi.
    OPMERKING: Een standaard kooi rat is ideaal.
  2. Plaats de kooi op een verhit oppervlak terwijl het dier herstelt. Gebruik de muis niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld.
  3. Controleer dier behaVior binnen 1-2 uur postoperation op tekenen van pijn of ongemak en implantaat integriteit.
    OPMERKING: Onder normale omstandigheden, moet het dier in staat zijn om ambulate met een bescheiden storingen aan beweging.
  4. Blijf dier controleren elke 8-12 uur voor de eerste 72 uur, het meten van het gewicht en het toezicht gedrag. Controleer dat de dieren actief en mobiel tijdens de nacht zijn. Nat voer in de vorm van grond chow vermengd met water of voedingsstoffen gels, voer pellets, en het drinken van water moet worden geleverd op de begane grond. Extra hydratatie door subcutane of intraperiotoneal injecties moeten worden verstrekt als dat nodig is.
  5. Dien 5 mg / kg muis ketoprofen en 0,2 mg / kg dexamethason subcutaan muis 24 en 48 uur tijdstippen postoperatief. Bovendien moet 0,005-0,010 mg / 100 g muis worden toegediend om de 8 uur subcutaan gedurende 72 uur.

7. In vivo beeldvorming

  1. Verdoven een muis onder5% isofluraan / zuurstof in een inductie kamer totdat ademhaling vertraagt ​​tot ongeveer 1 adem / sec.
  2. Transfer muis om de aangepaste stereotax (figuur 1D) met feedback gecontroleerde verwarming pad en steek rectale thermometer. Verminder isofluraan tot 2%.
  3. Dien glycopyrrolate 0.05 mg / 100 g muis intramusculair in de achterpoten met 29-30 G naalden en 10/3 cc spuit, goed voor ongeveer 50% van het injectievolume per ledemaat.
  4. Dien 1 ml / 100 g muis 5% glucose (hydratatie) subcutaan in zoutoplossing eenmaal per uur.
  5. Steek de schroefdraad houders kamer in het post-houders gebruikt voor de operatie (Figuur 1F). Stel de hoogte en draai de berichten op de stelschroeven in de bovenplaat.
  6. Met aangehechte beide houders, verheffen de houders in de post-houders totdat de borst vrij kan breiden op inspiratie.
    OPMERKING: Zowel de stevige bevestiging van de houders en de vrije uitzetting van de borstkas significanTLY bewegingsartefacten te verminderen als gevolg van de ademhaling.
  7. Voeren beeldvorming zoals gewenst.
  8. Wanneer beeldvorming is voltooid, lager berichten, afdraaien houders kamer, verwijder rectale thermometer, en plaats de muis op een verwarmd oppervlak te herstellen. Gebruik de muis niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld.

Resultaten

Door de bovenstaande procedure, moet elke fase van de operatie de resultaten bootsen voor elke fase van de operatie die in figuur 2. Bijzondere voorzichtigheid is geboden bij de toepassing van de silicone elastomeer luchtbellen onder glas elimineren of ten minste voor dat zij zich aan de rand van het interessegebied (Figuur 2L). Voor een ervaren chirurg, chirurgische complicaties die euthanasie, hetzij tijdens de operatie of binnen de eerste 24 uur postsurgery treden bij ongeveer 20% van de operaties. Deze complicaties vaakst ontstaan ​​door overmatig zacht weefsel bloedingen of het niet in de kamer veilig op de wervelkolom.

In succesvol geïmplanteerd kamers, het venster blijft typisch optisch transparant voor meerdere weken (figuur 3). Ondanks inspanningen, een ondoorzichtig, vezelig, neoplastische groei vormt vaak binnen enkele dagen, wat resulteert in gedeeltelijke obscuring van het venster (Figuur 3C - F, zwarte stippellijn). TL-structuren zijn moeilijk te zien met behulp van 2PEF microscopie onder dit vezelig weefsel. We vinden een bimodale verdeling van resultaten, met ongeveer 50% van met succes geïmplanteerd vensters resterende duidelijk langer dan 5 weken na de operatie, en ongeveer 50% raken versluierd binnen 1-3 weken. Voor ramen die duidelijk, de meeste plaatsen binnen het kijkvenster ervaring slechts een bescheiden mate van neovascularisatie in of boven de dura (Figuur 3D - F, groene sterretjes) blijven, die 2PEF beeldvorming niet belemmert. Onze vorige studie 30 toonde een toename van microglia maar niet astrocyten dichtheid onder het raam en de aangrenzende wervels, met vermelding van een lichte ontsteking analoog aan die gezien in craniale venster voorbereidingen 5.

In transgene muizen die geel fluorescerend eiwit (YFP) in een subset van dorsale wortel Ganglbis (DRG) neuronen (YFPH lijn; Jackson Labs), axonen waren duidelijk onderscheiden weken na operatie (figuur 4A en B) en zo lang als vier maanden één dier (gegevens niet getoond). Bloedvaten (figuur 4A en B) werden zichtbaar gemaakt door retro-orbitaal injecteren fluorescent Texas rood gemerkte dextraan in het bloedplasma. Microglia werden ook gevisualiseerd in muizen die GFP in een CX3CR1 knock-in muis (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) gekruist met de YFPH lijn (figuur 4C). Contrast en resolutie verslechterd bescheiden tijd (Figuur 4C) door de vorming van een vezelachtig begroeiing eerder 30 beschreven. We routinematig afgebeeld gedurende 3 uur in een enkele sessie zonder sterfte en zo vaak als elke 12 uur. Sessie duur en de frequentie wordt beperkt door de tolerantie van het dier voor de verdoving inductie, gelijktijdig met de ethische overwegingen bij pijn en angst te proefdieren.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> figure-results-1
Figuur 1. Een aangepaste operatiekamer vergemakkelijkt kamer levering tijdens implantatie en stabiliseert de kamer tijdens latere beeldvorming sessies. Tweezijdig-balken en een bovenplaat (A) worden gemonteerd (B) met kleine schroeven in de spinale ruimte (C). Een chirurgische tafel met uitschuifbare posten (D) zorgt voor de levering en klemmen van de zij balken aan de wervels met bevestigingspennen (E). Daaropvolgende beeldvorming sessies te gebruiken in plaats van inwendige schroefdraad berichten te hechten aan de kamer via de stelschroeven op de vleugels van het implantaat (F). Panel b van dit cijfer is gewijzigd van Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 met toestemming van Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Een dorsale laminectomie wordt uitgevoerd en een chronische beeldvorming kamer geïmplanteerd optische toegang tot het ruggenmerg verschaffen. De procedure wordt beschreven in montage. Ten eerste, de huid (panelen A, B; protocol secties 3,1-3,4) en spieren (C; 3,5) worden teruggetrokken naar de drie onderliggende wervels bloot. Het weefsel bovenliggende deze drie wervels verwijderd (D, E, F; 3,6-3,10) en de laterale processen worden afgeschraapt voordat ze vastgeklemd aan beide zijden (G, H, 3.12). Voorzichtig, de dorsale lamina van de centrale wervel is verwijderd en de randen van het bot afgedichte (I ; 4. 6). Een bovenste plaat wordt toegepast (J; 5.1) en schroeven vastgezet in de juiste positie (K; 5.3) om de kamer te beveiligen voordat het afdichten van de kamer met silicone elastomeer en dekking van glas (L; 5.5). Na de bevalling pinnen worden verwijderd (M; 5.8), wordt de huid gelijmd aan de zijkanten van de kamer (M, N, 5,8) en de stelschroeven zijn in de vleugels (O; 5.9) ingebracht. Ten slotte worden de schroef slots afgedicht met tandheelkundige acryl (P; 5.10). En de muis wordt geplaatst in een schone kooi te herstellen Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3

Figuur 3. Een chronische spinale kamer blijft optisch transparant over meerdere weken. Wit lichtbeelden van het ruggenmerg, variërend van enkele minuten (A) tot drie weken na de operatie (F). Vasculaire monumenten zijn herkenbaar op alle tijdstippen (gele pijlen). Weinig verandering wordt gezien bij één dag postsurgery (B). Dichte vezelige overgroei (C - F, begrensd door stippellijn op rechtsonder) aanwezig is zo vroeg drie dagen en resulteert in een gedeeltelijke verduistering van het beeldgebied. Milde neovascularisatie (D, E, F, groene sterretjes) is ook aanwezig, maar niet verdoezelen de originele vaatstelsel in wit licht of 2PEF beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4

Figuur 4. Een chronische spinale kamer maakt herhaalde multi-foton beeldvorming zonder herhaalde operaties. repeterend afbeelden van transgene muizen die YFP in een subset van DRG axons (groen) in de dorsale Funiculi van de spinale snoer en vasculatuur (rood) gemerkt door intravasculaire injectie kleurstof (A, B). De activiteit van microglia (mauve) kan ook worden gevolgd in de tijd Thy1-YFP / CX3CR1-GFP dubbel transgene muizen (C). Terwijl axonen en microglia zichtbaar blijven, contrast en resolutie daling bescheiden na verloop van tijd (C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

De techniek hier gedemonstreerd maakt herhaalde, time-lapse, in vivo beeldvorming van de dorsale muis SC uitgevoerd met vele weken na de operatie zonder verdere chirurgische procedures. Deze procedure betekent een aanzienlijke verbetering ten opzichte van repeat-operatie imaging studies of boven portmortem histologische benaderingen, waar informatie over cellulaire dynamiek verloren gaat. We hebben eerder aangetoond dat 30 de waarde van deze techniek voor het bestuderen SCI pathologie in vivo.

De maximale langsuitstrekking van beeldvorming werd bepaald door de groei van een dichte vezelachtige weefsel over het dorsale oppervlak van de SC. Mettertijd groei tot het verlies van beeldcontrast en resolutie. Deze groei is ook gezien in alternatieve chirurgische preparaten 31. Anecdotally hebben waargenomen dat deze groei kan worden geminimaliseerd door voorzichtig wassen van de dorsale SC oppervlak bloedproducten te verwijderen, verzegelen het oppervlak vande snede bot met cyanoacrylaat, afdichtranden van de kamer goed met siliconen elastomeer, en het minimaliseren van de interstitiële ruimte tussen de dorsale SC en de dekking van glas.

Onlangs heeft een andere benadering vergelijkbaar met onze eigen gebruik van een polycarbonaat kamer aangetoond 32. Het gebruik van polycarbonaat is voordelig omdat het compatibel is met röntgen en akoestische beeldvormingsmodaliteiten, wat niet het geval is voor onze roestvrij stalen onderdelen. Echter, met de nu alomtegenwoordige technologie van 3D printers kamerdelen kunnen worden vervaardigd uit een grote verscheidenheid van materialen voor specifieke behoeften. We hebben onlangs afgedrukt al onze onderdelen in een duidelijke fotopolymeer.

Een belangrijk nadeel van een gesloten kamer is het onvermogen om herhaalde doseringen van geneesmiddelen of exogene kleurstoffen geschikt voor SC beeldvorming 34 beheren. Echter, door te profiteren van de mechanische stabiliteit van ons huidige systeem, we hebben al gebruik gemaakt van onze huidige kamer om succesvolly verankeren een intrathecale katheter aangesloten op een subcutaan geïmplanteerde injectie-poort, die zelfs in een gesloten kamer systeem (ongepubliceerd werk) toegestaan ​​voor de afgifte van geneesmiddelen op verschillende tijdstippen. Verder komt door de modulaire aard van de bovenplaat toekomstige versies van dit preparaat omvat een afsluitbare kamer om voor herhaalde toepassing van zowel therapeutische middelen en fluorescente labels. Het is ook mogelijk kopplaten met mounts voorstellen voor het opnemen van elektroden, optische inserts en poorten voor geneesmiddelafgifte. Zulke toevoegingen zouden waarschijnlijk moeilijker te implementeren met behulp van de meer minimalistische systeem van Fenrich et al. 31. Concluderend onze kamer kan gateway platform waarop verschillende experimenten kan worden gebaseerd.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen en geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Joseph R. Fetcho voor zijn input gedurende de ontwikkeling van de procedure.We willen de financiering erkennen van de US National Institutes of Health (R01 EB002019 aan C.B.S en DP OD006411 aan Joseph R. Fetcho) en de National Science and Research Council of Canada (aan M.J.F.) voor de financiële ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Vannas scissorsFine Science Tools15000-04
forceps, scissors, scalpel, etc.Fine Science Toolsmultiple 
retractor kit -magnetic fixatorFine Science Tools18200-02
retractor kit -retractorFine Science Tools18200-09andere retractoren kunnen ook worden gebruikt
retractor kit -elastomerFine Science Tools18200-07
feedback controlled heating blanketCWE Inc.Model: TC-1000 Mouse              Part No. 08-13000
stereotaxzie Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamberzie Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
spinal chamber holderszie Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)
Cyanoacrylate glueLoctiteLoctite 495multiple suppliers
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)TeetsMfg. Part: 8101multiple suppliers
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)TeetsMfg. Part: 8501multiple suppliers
GlycopyrrolateMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG5767
BupivacaineMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 029841 (Hospira 116301)
KetoprofenMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
DexamethasoneMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil ElastomerWorld Precision Inc.KWIK-SIL
KwikSil Mixing TipsWorld Precision Inc.KWIKMIX

Referenties

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459(2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910(2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227(2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760(2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081(2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826(2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

Herprints en machtigingen

Tags

Implantatie van rugkamerchirurgische proceduremultifotonmicroscopiewervelklemmendorsale laminectomiesiliconen elastomer afdichtingchronische beeldvormingpostoperatieve zorg
Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal In Vivo Beeldvorming van de Muis Spinal Cord
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.