Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro

Summary

Deze methode toont een techniek voor het beoordelen van de functie van granulocyten door gelijktijdig de fagocytose van bacteriën en oxidatieve burst te meten. Beeldgebaseerde flowcytometrie maakte het mogelijk om drie verschillende subsets van geactiveerde granulocyten te identificeren die allemaal verschilden in hun relatieve functionele capaciteit.

Abstract

Granulocyten spelen een sleutelrol in de aangeboren immuunrespons van het lichaam op bacteriële en virale infecties. Hoewel er methoden bestaan om de functie van granulocyten te meten, zijn deze in het algemeen beperkt in de informatie die ze kunnen verstrekken. De meeste bestaande tests geven bijvoorbeeld slechts een percentage van hoeveel granulocyten geactiveerd zijn na een enkele, vaste incubatietijd. Complicaties ontstaan doordat de meeste tests zich vanwege beperkingen in detectietechnologie op slechts één aspect van de functie richten. Dit rapport demonstreert een techniek voor gelijktijdige meting van fagocytose van bacteriën en oxidatieve burst door granulocyten. Door beide functies tegelijkertijd te meten, werden drie unieke fenotypes van geactiveerde granulocyten geïdentificeerd: 1) Lage activering (minimale fagocytose, geen oxidatieve burst), 2) Matige activering (matige fagocytose, enige oxidatieve burst, maar geen co-lokalisatie van de twee functionele gebeurtenissen) en 3) Hoge activering (hoge fagocytose, hoge oxidatieve burst, co-lokalisatie van fagocytose en oxidatieve burst). Er werd ook een vierde populatie geïdentificeerd die uit inactieve granulocyten bestond. Met behulp van testincubaties van 10, 20 en 40 minuten werd het effect van de duur van de testincubatie op de herverdeling van de fenotypes van geactiveerde granulocyten beoordeeld. Een vierde incubatie werd voltooid op ijs als controle. Door seriële tijdincubaties te gebruiken, kan de test mogelijk detecteren hoe een behandeling de functie van granulocyten ruimtelijk beïnvloedt. Alle monsters werden gemeten met behulp van een op beeld gebaseerde flowcytometer uitgerust met een kwantitatieve beeldvormingsoptie (QI), autosampler en meerdere lasers (488, 642 en 785 nm).

Introduction

Granulocyten vormen een onderdeel van het lichaam het aangeboren immuunsysteem, die de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende antigenen biedt. Vorige methoden voor de beoordeling van granulocyten functie gericht op fagocytosecapaciteit of oxidatieve burst het gebruik van afzonderlijke methoden, waardoor het moeilijk is om gezamenlijk na te gaan hoe granulocyten zijn veranderd ^1-4. Vooruitgang op het gebied van flowcytometrie hebben geleid tot de productie van stationaire apparaten voor het hoge-resolutie, multi-color beeldvorming van cellen in een high throughput wijze ^5. De mogelijkheid om beeldvorming te combineren met traditionele flowcytometrie vertegenwoordigt een vooruitgang dat de technologische platform nodig om te innoveren binnen bestaande flowcytometrie methoden en pak nieuwe informatie over het immuunsysteem zorgt.

In de afgelopen tien jaar heeft ons laboratorium, onder anderen, is scherp gericht op het effect van verschillende voedings- en oefening behandelingen patterns op aangeboren immuunsysteem ^6-9. De werkwijze aangetoond in dit manuscript heeft praktische implicaties op het gebied van klinische immunologie. De huidige methode maakt gebruik van de kracht van beeld-gebaseerde flowcytometrie om gelijktijdig meten van fagocytose van bacteriële deeltjes en oxidatieve burst. Met deze aanpak, is men in staat om geactiveerde granulocyten gebruik van variabelen die door de beeld-gebaseerde deel van de analyse te scheiden. Deze subgroepen waren slechts herkenbaar na de beoordeling van de beelden van de cel op het individu granulocyten. Verdere analyse incubatietijd beïnvloed de overgang tussen de drie activatie subsets ^10. Aldus is het aannemelijk dat het gebruik van meerdere incubatietijd mag een methode om de verandering in granulocyten functie na een bepaalde experimentele behandeling getest. Het doel van dit manuscript was om een ​​methode voor het beoordelen van granulocyten functie aan te tonen met behulp van image-based flowcytometrie om gelijktijdig meten van fagocytose met oxidative barsten.

Protocol

OPMERKING: Alle bloedafname procedures in deze methode beschreven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en de UNT Institutional Review Board (IRB) voor gebruik bij mensen goedgekeurd. Alle patiënten gaven toestemming voor bloedafname, die werd gebruikt in de onderhavige werkwijze zodat ze ogenschijnlijk gezond, normaal lichaamsgewicht en ziektevrij.

1. reagens Bron & Voorbereiding

1. Gebruik CD66b-APC (kloon # G10F5; DF = 1: 50) en CD45-APCeFluor780 (kloon # 2D1; DF = 1: 50) voor deze test.
   OPMERKING: Vóór het onderzoek CD45 en CD66b antilichamen werden getitreerd om de optimale verdunning te bepalen die duidelijk opgelost granulocyten (CD45 + / + 66b) van andere leukocyten (CD45 + / 66b-) ^11. Na toevoeging van de verdunde antilichaam voor het kleuren van de uiteindelijke verdunning in de buis was 875.
2. Kopen en ontdooien voorraad S. aureus bioparticles gelabeld met pHrodo rode kleurstof. Suspendeer in een concentratie van 1 mg bioparticles per ml in steriel PBS. Aliquot verdunde bioparticles en opslag bevroren bij -20 ° C tot gebruik in de assay.
3. Los dihydroethidium (DHE), dat wordt omgezet in fluorescerend ethidium bromide in aanwezigheid van zuurstof vrije radicalen (dwz de oxidatieve burst) in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 10 g / ml.
4. Mix N-ethylmaleïmide (van extra fagocytose na de gespecificeerde assay incubatieduur verhinderen) met steriele PBS in een 2 stap verdunning van 200 mg / ml en 17,5 mg / ml. In de test gebruikt een eindconcentratie van 15 mM. Bij ontdooien N-ethylmaleimide, gebruikt een 37 ° C warmteblok, zoals N-ethylmaleimide niet in oplossing blijven.
5. Na de laatste fixatie stap, gebruiken 7AAD om nucleair DNA vlek. Voorafgaand aan de toevoeging, verdunnen voorraad 7AAD 01:10 met steriele PBS.

2. Bloedmonster Collection

1. Ja onderwerpen komen het laboratorium na een O / N snel (> 8 uur) en abstentiop van lichamelijke activiteit (> 12 uur).
2. Na het reinigen van de huid met een alcohol prep pad, plaatst u een steriele bloedafname naald in een perifere ader in de arm.
3. Verzamel bloed in vacuümbuizen die commercieel zijn gevuld met natrium heparine.
4. Na het verzamelen, gelden een pleister op de arm van het onderwerp.
5. Omkeren bloed buizen tot 10 keer te mengen en vervolgens te plaatsen op een rocker tot analyse.

3. Fagocytose Assay Techniek

1. Ontdooi S.aureus bioparticles (RT), DHE (RT) en N-ethylmaleïmide (37 ° C).
2. Voeg 20 L van S. aureus bioparticles tot 4 individuele 1,2 ml buizen tijdens het werken in de steriele kap.
3. Voeg 40 L van DHE aan elke buis met het bioparticles.
4. Tik de buizen op de bank oppervlak om de reagentia te verzamelen op de bodem van de buis.
5. Voeg 100 L van gemengde volbloed aan elke buis die is gevuld met bioparticles en DHE.
6. Veeg de binnenkant van de buizen met een wattenstokje om eventuele verontreinigende bloed te verwijderen.
7. Meng het bloed en reagentia met een elektronische pipet op het bloed en reagentia meng gedurende drie cycli na toevoeging bloed.
8. Plaats test buizen in een ijsemmer en dekken ter bescherming tegen licht.
9. Incubeer testbuizen 10, 20 en 40 min. Begin met het 40 min buis zodat alle testbuizen eindigen tegelijk.
10. Ontdooi N-ethylmaleimide in 37 ° C bad kraal.
11. Pipetteer 15 L N-ethylmaleïmide (beschreven in 1.4) in elke proef buis, incubeer gedurende 30 minuten.
12. Pipet 10 L van CD66b-APC en 10 L van CD45-APCeFluor780 verdunde antilichamen (hierboven beschreven in 1.1), incubeer gedurende 60 min.
13. Pipet 750 L van WBC fix / RBC Lyse oplossing in elke test buis, incubeer gedurende 60 min.
14. Centrifuge (10 min bij 400 xg) testbuizen om de celpellet te verzamelen.
15. Vacuüm te zuigen de WBC Lyse / RBC fix oplossing, waardoor er een resterende fluid volume (100 L) boven de cel pellet.
16. Pipetteer 10 liter verdunde 7AAD oplossing (beschreven in 1.5) en 50 L PBS in elke testbuis.
17. Voeg een druppel kalibratie kralen (~ 25 L) om elke test buis, plaats caps op test buizen, wrap buizen in folie en plaats in de koelkast.
18. Laad het monster buis in de image-based stroomcytometer en het verzamelen van een minimum van 3.000 granulocyten gebeurtenissen met behulp van vooraf gedefinieerde parameters: Autosampler, blauw (488 nm; 60 mW), rood (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8.5 mW) lasers (figuur 1).

Figuur 1. Verwerving Methode & Template. Monsters werden verworven op een beeld-gebaseerde stroomcytometer (A). Tijdens de overname werden puntdiagrammen van Bright Field Aspect Ratio versus CD66b-APC gegenereerd om gescheiden granulocyten uit spiked kalibratie kralen using INSPIRE v. 100.2.292.0 software (B). Een minimum van 5.000 granulocyten werden verworven voor elke monsters met behulp van een autosampler, blauw (488 nm; 60 mW), rood (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers. Houd er rekening mee dat een aantal histogrammen aanwezig tijdens overname laser instellingen en andere aspecten van het verzamelen van gegevens te controleren zijn. Al deze histogrammen zijn optioneel en alleen nodig als het laboratorium standaard operationele procedures vereist dat ze als kwaliteitscontrole. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

4. Steekproef Verwerving en Analyse

1. Gebruik het automatische software-compensatie-wizard van de ideeën software op een vergoeding matrix om Raw-afbeeldingsbestanden (RIF) en maak hiermee compenseren belichte bestanden (CIF).
2. Laad individuele CIF bestanden in IDEAS software en het genereren van de volgende percelen aan de granulocyten subgroepen te identificeren:
3. Vestigen initiële poorten naar de cellen die met behulp van een histogram voor heldere veldgradient RMS (Figuur 2A) werden geacht in de focus te identificeren. Maak deze bepaling voor elke patiënt monster met behulp van de gestimuleerde controle als referentie standaard.
4. Gebruik secundaire percelen te scheiden singlet cellen van puin en wambuizen met een dot plot van helder veld aspect ratio (verhouding van de cel hoogte versus breedte) vs. lichte veld gebied (Figuur 2B). Maak deze bepaling voor elke patiënt monster met behulp van de gestimuleerde controle als referentie standaard.
5. Zodra een schone populatie van cellen waren geïdentificeerd, stellen een dot plot van CD45 versus CD66b (figuur 2C) om positief granulocyten identificeren (CD45 + / 66b +). Maak een dochter perceel (figuur 3) van heldere details intensiteit voor S. aureus (x-as) versus lichte detail intensiteit oxidatieve burst (DHE, y-as) subsets van geactiveerde granulocyten identificeren. Verzamel brechts veld beelden in kanaal 1 en 9, bioparticles in Kanaal 2, DHE in Channel 4, 7AAD in Channel 5, CD66b in kanaal 11 en CD45 in het Kanaal 12.

Figuur 2. Analyse sjabloon. Dit cijfer de serie plots die zijn gegenereerd om cellen die in focus (A) waren identificeren enkelvoudige cellen (B), granulocyten (C). Extra percelen werden gebruikt om de drie subsets van geactiveerde granulocyten vs. inactief granulocyten identificeren. Alle analyse van verworven beeldbestanden werd ingevuld met behulp van IDEEËN v.6 software. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Results

Met behulp van image-based flowcytometrie liet ons toe om een homogene populatie van geactiveerde granulocyten scheiden in drie verschillende activering deelverzamelingen (figuur 3). In deze werkwijze de meest effectieve manier om de drie activatie subsets lossen is door het uitzetten helder detail intensiteit fagocytose (S. aureus) vs. oxidatieve burst (DHE) (Figuur 3; Figuur 4). Ook zal het gebruik van de co-lokalisatie tovenaar in IDEEËN software zorgen voor het kwantificeren van de aanwezigheid van gelijktijdige fagocytose en oxidatieve burst, dat is een kenmerk teken van zeer geactiveerde granulocyten.

Figuur 3. Identificatie van Activated Granulocyt subsets. Na de identificatie van granulocyten behulp celoppervlak merkers (CD45 + / 66b +), een dochter perceel is gegenereerd met heldere details Intensity voor fagocytose vs. lichte detail intensiteit voor oxidatieve burst. Met deze aanpak, het percentage inactieve (paars), low-actief (rood, A), matige-actief (blauw, B), en high-actief (geel, C) granulocyten werd bepaald. Deze gating techniek werd ook gebruikt om het effect van test incubatietijd op de relatieve abundantie van de verschillende geactiveerde granulocyten subsets evalueren. Het hoogste percentage "hoogactief" granulocyten aanwezig was na 40 min incubatie. Alle analyse van verworven beeldbestanden werd ingevuld met behulp van IDEEËN v.6 software. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Naast het aantonen van drie verschillende subsets van geactiveerde granulocyten werd aangetoond dat de test incubatietijd invloed op de relatieve abundantie van iedere geactiveerde granulocyten deelverzameling. Specifiek, de 40 min incubation resulteerde in de grootste percentage "hoogactief" granulocyten. Door ten minste drie assay incuberen tijdsduren het mogelijk is te bepalen hoe een bepaalde klinische behandeling verandert de temporele activeringsstatus van granulocyten. Dit is de eerste gepubliceerde werkwijze met beeldgebaseerde doorstroomcytometrie verschillende geactiveerde granulocyten subgroepen te identificeren als een functie van gelijktijdige metingen van fagocytose en oxidatieve burst.

Figuur 4. Vertegenwoordiger afbeeldingen van Cellular Markers. Een fotogalerij van cellen geclassificeerd als hoog-actieve (A), matig-actieve (B), en een laag-actieve (C) wordt gepresenteerd in deze figuur. S. aureus bioparticles zijn in CH03 , oxidatieve burst is in CH04, 7AAD voor de kern is in CH05, zijwaartse verstrooiing is in CH06, CD66b is inCH11, en CD45 is in Ch12. Ook is een co-gelokaliseerde merge beeld van fagocytose (CH03) vs. oxidatieve burst (CH04) weergegeven. Gebieden van geel in beeld samenvoegen duiden dat fagocytose en oxidatieve burst zich voordoen in dezelfde anatomische ruimte op hetzelfde moment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

De huidige werkwijze is een verfijning van bestaande methoden voor de beoordeling van granulocyten functie met behulp van flowcytometrie ^1,3,4,12-14. De kritische stappen van deze test vaak gerelateerd goede menging van het bloedmonster met de bioparticles en DHE. Onvolledige menging zal leiden tot onnauwkeurige resultaten. Terwijl volledige menging kritisch moet de mengmethode zachte aard zijn. Voorgesteld wordt mengen worden bereikt met een elektronische pipet met een mengfunctie plaats van een vortex mixer. Een kritische stap bij de bepaling is om altijd zorgen dat er geen bloed besmetting van de bovenste helft van de testbuis. Dit resterende bloed kan worden verwijderd met behulp van een steriel wattenstaafje. Volledige verwijdering is belangrijk, omdat het niet om dit te doen kan de test voorbereiding met-un gelyseerde rode bloedcellen besmetten.

Voorafgaand aan het gebruik van deze methode een passende compensatie controles moeten worden toegevoegd om te controleren voor spectral overlap tussen de reagentia gebruikt om de verschillende aspecten van granulocyten functie identificeren. Voor deze methode compensatie controles omvatten verzamelen bloedmonsters die zijn voorgesteld de 40 min incubatie assay en vervolgens labelen met een marker (bijv E. coli, DHE, etc.). Na etikettering, worden enkele positieve gebeurtenissen verzameld en een vergoeding matrix wordt gegenereerd met behulp van een geautomatiseerd tovenaar in de IDEAS analyse software. Het is cruciaal dat als deze test wordt gebruikt, geschikte compensatie controles worden voltooid om goede test prestaties.

Analyse wordt uitgevoerd met behulp van de functie finder en co-lokalisatie wizards te identificeren die heldere details intensiteit is de beste variabele aan de bevolking te scheiden en ook bepalen hoe veel overlap bestaat tussen oxidatieve burst en fagocytose signalen. Met name het gebruik van beeldgebaseerde cytometrie ontvangen het vermogen geactiveerde granulocyten scheiden in drie deelverzamelingen. Tzijn opsplitsing deelverzameling werd bepaald met behulp van heldere details intensiteit van fagocytose vs. oxidatieve burst. Naast het onderzoek van deze bijzondere celfuncties, werden cellen die beide gebeurtenissen vertoonden tegelijk in dezelfde anatomische plaats (co-lokalisatie) geïdentificeerd. Granulocyten dat viel in de "high-actief" deelverzameling waren de enige fenotype die consistent zijn co-localisatie tussen fagocytose en oxidatieve burst aangetoond. Deze identificatie van geactiveerde granulocyten subsets is het grootste gebied waar problemen nodig. Het is zeer belangrijk voor een nieuwe gebruiker tijd om het monster procesworkflow in IDEEËN begrijpen en de mechanica van gating de celpopulaties met de beeldvormende component begrijpen. Andere wijzigingen die een gebruiker kunnen proberen te maken onder andere de selectie van alternatieve of aanvullende test incubatietijd. De huidige methode suggereert het gebruik van een duur van 10-40 minuten; echter, afhankelijk van het experimentele model waarbij deze werkwijzete gebruiken, kan het nodig langere looptijden assay selecteren zijn. Een dergelijke wijziging zou moeten worden beoordeeld op individuele basis.

Verder werd vastgesteld dat de duur van de test incubatie heeft een significant effect op het uiterlijk van de drie geactiveerde subsets. De in dit rapport beschreven aanpak betekent een uitbreiding van de informatie die voorheen niet konden worden verkregen met betrekking tot granulocyten functie ^3,4,13,15. Andere laboratoria hebben het belang van de beoordeling van veranderingen in de granulocyten functie als onderdeel van een uitgebreide beoordeling van de immuniteit en de ziekte van ^15-17 aangetoond. Ondanks het potentieel van deze test is niet zonder beperkingen. Een van de belangrijkste beperkingen kosteneffectief en tijd vraag geassocieerd met veel monsters worden verwerkt. Bij een studie ontwerp vereist een groot aantal monsters in een bepaalde dag, kan dit moeilijk te verwerken. Verwerking wordt gestroomlijnd door het gebruik van elektronische pipetten en dispensers,maar deze hebben de neiging duur te zijn en zijn per definitie niet beschikbaar in elk laboratorium.

Ons gebied van onderzoek richt zich op een studie van hoe lichaamsbeweging en eetgewoonten beïnvloeden het immuunsysteem gezondheid en functioneren ^{6,8-10,18-20.} Dergelijke doelstellingen hebben belangrijke praktische gevolgen voor verschillende gebieden van de menselijke gezondheid. Voorbij de studie bewegen en nutritionele effecten de fagocytose methode aangetoond in dit manuscript bruikbaar in andere gebieden van klinische immunologie kunnen zijn bij het opmaken van fagocytose functie is kritisch voor behandelingsresultaten. De onderhavige bepalingsmethode is de eerste van vele die immunologische assays met mogelijk opnieuw uitgevonden door middel voordelen van de unieke imaging informatie van een beeldgebaseerde flowcytometer kan worden kan.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainers	BD Life Sciences		gebruikt voor bloedopname
WBC Fixatiemiddel / RBC Lysis oplossing	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	eBioscience	clone G10F5
CD45-APCeFluor780	eBioscience	clone 2D1
S. aureus bioparticles	Life Technologies	A10010
dihydroethidium	Sigma-Aldrich	D7008
N-ethylmalemide	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Millipore
Hematologie Analyzer	Mindray	BC-3200
96-kanaals pipet	Integra Biosciences	ViaFlo
Bead Bath Incubator	LabArmour	BeadBath
Imaging Flow Cytometer	EMD Millipore	Amnis FlowSight
INSPIRE Software	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS Software	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Piercable Plate Sealer	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision Workstation	Dell Computers	Various	Gebruikt voor IDEAS analyse