We beschrijven een manier om snel en eenvoudig de long diffusiecapaciteit bij muizen te meten en laten zien dat het voldoende gevoelig is voor fenotypeveranderingen in meerdere veelvoorkomende longpathologieën. Deze metriek brengt dus directe translationele relevantie voor de muismodellen, aangezien diffusiecapaciteit ook gemakkelijk bij mensen kan worden gemeten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fenotypering Mouse Longfunctie In Vivo Met de Lung diffusiecapaciteit
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De muis is nu de primaire dierlijke gemodelleerd om verschillende longziekten. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan een dergelijke pathologieën te bestuderen, zijn fenotypische methoden nodig dat de pathologische veranderingen kunnen kwantificeren. Bovendien translationeel relevantie voor de muismodellen, mag dergelijke metingen tests die gemakkelijk kan worden gedaan in zowel mensen en muizen. Helaas, in de huidige literatuur enkele fenotypische metingen van longfunctie rechtstreeks op mens. Een uitzondering is de diffusiecapaciteit voor koolmonoxide, een meting die routinematig wordt gedaan bij de mens. In dit rapport beschrijven we een middel om dit diffusiecapaciteit bij muizen snel en eenvoudig te meten. Deze procedure houdt korte longinflatie met tracer gassen in een verdoofde muis, gevolgd door 1 min gas analysetijd. We hebben het vermogen van deze methode om verschillende long ziekten, met inbegrip van emfyseem, fibrose, acute longbeschadiging, en influenza en detecteren getestschimmel longinfecties, evenals bewaking longrijping bij jonge pups. De resultaten tonen significante dalingen in de longen pathologieën, evenals een verhoging van de verstrooiende capaciteit longrijping. Deze meting long diffusiecapaciteit verschaft aldus een longfunctie test die brede toepassing van haar vermogen om fenotypische structurele veranderingen met de meeste bestaande pathologische longmodellen detecteren haalt.
Inleiding
De muis is nu de primaire dierlijke gemodelleerd om verschillende longziekten. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan een dergelijke pathologieën te bestuderen, zijn fenotypische methoden nodig die kunnen kwantificeren is de pathologische veranderingen. Hoewel er veel muizenstudies geventileerde mechanica gemeten, deze metingen algemeen los van de standaardbeoordelingen longfunctie normaal gedaan bij de mens. Dit is jammer, aangezien de mogelijkheid om equivalente metingen in muizen en menselijke proefpersonen voeren kan de omzetting van de resultaten in muismodellen voor humane ziekten vergemakkelijken.
Een van de meest voorkomende en gemakkelijk gemaakt metingen bij mensen is het diffusiecapaciteit voor koolmonoxide (DLCO) 1,2, maar deze meting slechts zelden gedaan in muismodellen. In die onderzoeken waar het is gemeld 3-7, zijn er geen follow-up studies geweest, deels omdat de procedures zijn vaak omslachtig of kan aanvruire complexe apparatuur. Een andere benadering is om een CO rebreathing methode in een stabiele toestand, dat het voordeel dat CO diffusie meten bewuste muizen. Deze methode is echter zeer omslachtig en resultaten kunnen variëren met het niveau van de ventilatie van de muis en O2 en CO2 concentraties 8,9. Deze problemen lijken te zijn uitgesloten routinematig gebruik van diffusiecapaciteit long pathologieën bij muizen te detecteren, ondanks de verschillende voordelen.
Om de problemen met bepaling van diffusiecapaciteit bij muizen omzeilen, details van een eenvoudige middelen te meten bij muizen zijn recent gerapporteerd 10. De procedure elimineert het moeilijke probleem van het bemonsteren van niet-verontreinigd alveolaire gas door snel het bemonsteren van een hoeveelheid die gelijk is aan het gehele geïnspireerde gas. Deze procedure resulteert in een zeer reproduceerbare meting zogenaamde diffusie factor voor koolmonoxide (DFCO), dat gevoelig is voor een groot aantal pathologic veranderingen in de longen fenotype. De DFCO wordt dus berekend als 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), waarbij het c en 9 subscripts betrekking op concentraties van de kalibratie gassen geïnjecteerd en de afgevoerde gassen na 9 seconden adem wachttijd, respectievelijk. DFCO is een dimensieloze variabele, die varieert tussen 0 en 1, met 1 als gevolg van volledige opname van alle CO, en 0 geeft het geen opname van CO.
In deze presentatie laten we zien hoe deze diffunderende capaciteitsmeting maken en hoe het kan worden gebruikt om veranderingen in bijna alle bestaande muizenlong ziektemodellen, zoals emfyseem, fibrose, acute longbeschadiging en virale en schimmelinfecties documenteren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite.
1. Dierlijke Voorbereiding
- Bereid 6 C57BL / 6 controlemuizen voor DFCO meting, door verdoven ze met ketamine en xylazine zoals beschreven in stap 2.3.
- Bereid alle andere muizen met verschillende long pathologieën getoond in Tabel 1 door dezelfde procedure als bij de controles. Bijzonderheden moest elk van deze modellen vastgesteld worden in de relevante referenties. Controlemuizen en die in de andere pathologische cohorten zijn 6-12 weken.
2. Meting van Diffusion Factor voor koolmonoxide (DFCO)
- Het opzetten van de bij de machine geleverd om pieken voor stikstof, zuurstof, neon, en koolmonoxide te meten gaschromatograaf module. Voor deze toepassing gebruik alleen de neon en CO gegevens.
OPMERKING: Dit instrument maakt gebruik van een moleculaire sieve kolom met helium als draaggas, met een 12,00 um film, 320.00 um ID en 10 m lengte. De kolomchromatografie heeft een volume van 0,8 ml, maar we gebruikten 2 ml voldoende clearing van de verbindende buis met het monster te verzekeren. - Aan het begin van elke experimentele dag, alvorens metingen van de monsters van de muizen, rechtstreeks een 2 ml monster van een gasmengsel zak met ongeveer 0,5% Ne, 0,5% CO en balans lucht en gebruik dit monster te kalibreren de gaschromatograaf.
- Verdoven muizen met ketamine (90 mg / kg) en xylazine (15 mg / kg), en bevestig verdoofd door de afwezigheid van reflex beweging. Breng veterinaire zalf op de ogen tot droog voorkomen. Tracheostomize de muizen met een stomp naaldcanule (18 G bij volwassenen of 20 G bij zeer jonge muizen).
OPMERKING: De DFCO is in minder dan 10 minuten na anesthesie voltooid en voorafgaand aan mechanische ventilatie of andere procedures. - Bij muizen meer dan 6 weken oud, gebruikt een 3 ml spuit to trekken 0,8 ml van gas uit het gasmengsel zak. Sluit de spuit aan de tracheacanule en snel op te blazen de long. Met behulp van een metronoom, tel 9 sec, en dan snel terug te trekken van de 0,8 ml (uitgeademde lucht).
- Verdun deze ingetrokken 0,8 ml uitgeademde lucht tot 2 ml met lucht in de ruimte, laat het rusten voor ten minste 15 sec. Injecteren dan is het hele monster in de gaschromatograaf voor analyse.
- Tijdens het analyseren deze eerste DFCO monster opblazen van de muis long met een tweede 0,8 ml van het gasmengsel zak, en verwerk dit voorbeeld identiek aan de eerste monster. Het gemiddelde van de twee DFCO metingen.
OPMERKING: Voor metingen bij muizen zo jong als 2 weken oud gebruikt een volume van 0,4 ml, 0,8 ml aangezien te grote hoeveelheid metingen maken longen van jonge muizen. Het is beter om het volume 0,8 ml muizen ouder dan 6 weken gebruikt, en dat als de 0,4 ml volume nodig voor sommige muizen is consistent moet worden gebruikt voor alle muizen in het cohort bestudeerd. - Bereken DFCOals 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), waarbij c en 9 indices hebben betrekking op concentraties van de kalibratie gassen geïnjecteerd en de gassen verwijderd na een 9 sec adem wachttijd, respectievelijk.
- Analyseren en vergelijken verschillen met een eenzijdige ANOVA en het significantieniveau van Tukey correctie voor meervoudige vergelijkingen in de cohort muizen te beoordelen. Overweeg p <0,05 als significant waarde.
OPMERKING: Alle van de muizen die hier gebruikt maakten deel uit van experimentele studies met meerdere opeenvolgende metingen van longventilatie, mechanica, longlavage of histologie, die hier niet worden vermeld. Bovendien, omdat de werkwijze is hetzelfde in alle experimentele modellen zoals hierboven uitgevoerd in de controle muizen, alleen de resultaten van de verschillende pathologische modellen gepresenteerd. Nadere informatie over deze modellen wordt gepresenteerd in de aanvullende tabel. - Euthanaseren van de dieren door de diepe anesthetic overdosis gevolgd door cervicale dislocatie of onthoofding. Waar nodig, verwijderen van de long cellen en / of weefsels van de dode muizen verdere biologische of histologische verwerking en analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont de DFCO metingen van de volwassen muizen in groepen A, B, C, D, E en F. Er waren significante daling van zowel de Aspergillus en influenza-infecties, en significante daling van het fibrotische, emfysemateuze en acute longbeschadiging modellen. Figuur 2 toont de groep G ontwikkelingsveranderingen in DFCO tijd als de muizen leeftijd 2-6 weken. Er was een lichte, maar significante stijging met longontwikkeling gedurende deze tijdsduur. Het effect van het gebruik van een klei...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In het huidige werk, hebben we een nieuwe metriek om het gas te wisselen vermogen van de muis long kwantificeren gedefinieerd. Deze statistiek is analoog aan de diffusiecapaciteit, gemeenschappelijke klinische meting dat de primaire functie van de longen gemeten, dat wil zeggen het vermogen om gasuitwisseling. De diffusiecapaciteit Alleen long functionele metingen die gemakkelijk en snel kan worden gedaan in zowel muizen als mensen. Voor de detectie van longziekte bij muizen, een belangrijke doelstelling veranderingen i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten, en niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH HL-10342
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent maakt een vergelijkbaar model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Meerdere andere mogelijke leveranciers | |
| 3 ml plastic spuit | Becton Dickenson | Meerdere andere mogelijke leveranciers | |
| Polypropyleen gasmonsterzakken | SKC | 1 of 2 L capaciteit werkt goed | Andere gasdichte zakken zullen goed werken |
| Gastank, 0,3% Ne, 0,3% CO, balans lucht; (maat ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | Dit is het standaard mengsel dat wordt gebruikt voor DLCO bij mensen |
| 25 TCID50/muis van influenzavirus A/PR8 verdund in fosfaatgebufferd zoutoplossing. | |||
| Porcine pancreaselastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5,4 U | |
| Bleomycine | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0,25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g lichaamsgewicht; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolaat Af293) conidiën werden verzameld uit volwassen kolonies gekweekt op aardappeldextrose-agar. |
Referenties
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299(2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
