Ontwikkeling van een In vitro Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van Equus Caballus IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI

Samenvatting

De huidige studie beschrijft de ontwikkeling en toepassingen van een genetisch gemanipuleerd assaysysteem gebaseerd op de transfectie van rattenbasofiele leukemiecellen met het paarden FcεRIα-gen. Getransfecteerde cellen drukken een functioneel receptor uit waarbij de afgifte van mediatoren van de allergische respons kan worden geactiveerd door IgE en antigeen.

Samenvatting

De interactie van IgE met zijn hoog-affiniteit Fc-receptor (FcεRI) gevolgd door een antigeen uitdaging is de belangrijkste route in IgE-gemedieerde allergische reacties. Als gevolg van de hoge affiniteitsbinding tussen IgE en FcεRI, samen met de continue productie van IgE door B-cellen, blijven allergieën meestal levenslang bestaan, waarbij momenteel geen permanente remedie beschikbaar is. Paarden, vooral racepaarden, die vaak inteelt zijn, zijn een soort zoogdieren die zeer vatbaar zijn voor de ontwikkeling van overgevoeligheidsreacties, wat hun prestaties ernstig kan aantasten. Fysiologische reacties op allergische sensibilisatie bij paarden weerspiegelen die bij mensen en honden. In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een in situ assay systeem voor de kwantitatieve beoordeling van de afgifte van bemiddelaars van de allergische respons met betrekking tot het paardensysteem. Hiervoor werd het gen dat codeert voor het equiene FcεRIα getransfecteerd en tot expressie gebracht op het oppervlak van parentale Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cellen. Het genproduct van de getransfecteerde equiene α-keten vormde een functioneel receptorcomplex met de endogene rat β- en γ-ketens ¹. Het resulterende assay systeem maakte een beoordeling mogelijk van de hoeveelheid bemiddelaar afgescheiden vanuit equiene FcεRIα getransfecteerde RBL-2H3.1 cellen na sensibilisatie met equien IgE en antigeen uitdaging, waarbij β-hexosamine-dase afgifte als meetwaarde werd gebruikt ^{2, 3}. De afgifte van bemiddelaars bereikte een piek van 36,68% ± 4,88% bij 100 ng ml^-1 van antigeen. Deze assay werd aangepast van eerdere assays die werden gebruikt om menselijke en honden allergische reacties te bestuderen ^{4, 5}. We hebben ook aangetoond dat dit type assay systeem meerdere toepassingen heeft voor de ontwikkeling van diagnostische hulpmiddelen en de veiligheidsbeoordeling van potentiële therapeutische interventiestrategieën bij allergische ziekten ^{6, 2, 3}.

Inleiding

Allergie is gekend voor duizenden jaren. Een astma-behandeling werd beschreven in het Oude Egyptische medische tekst die bekend staat als de Ebers Papyrus (~ 1550 BCE) en besproken kruidenmiddelen om het ⁷ behandelen.

Vandaag allergie geclassificeerd als type I overgevoeligheidsreactie, waarbij de T-helpercel type 2 _(Th2) arm van het immuunsysteem stuurt de productie van immunoglobuline E (IgE) antilichamen in respons op omgevingsveranderingen antigenen genoemd allergenen. Dit zijn verschillende stoffen die gewoonlijk interactie met cellen in het immuunsysteem en stimuleert de synthese en secretie van pro-inflammatoire cytokines, zoals interleukine-4 en interleukine-13 ^{8, 9} als er deeltjes in sigarettenrook of dieseldeeltjes IgE synthese verbeteren ^10.

De stijging van allergische manifestaties industrielanden de afgelopen 50 jaar is toegeschreven aan een combinatie van het effect vanmilieuverontreinigende stoffen en een trend naar een meer hygiënische omgeving, die samen de immuunrespons tegen een profiel overheerst TH ₂ cytokines verschuiven, zoals de "Hygiene Hypothesis ^'11 voorgesteld.

Zoals hierboven vermeld, mensen niet de enige zoogdieren getroffen door allergie. Met name paarden en honden kunnen ook klassieke allergische reacties ontwikkelen en een studie met ¹² blijkt dat, bij mensen, paarden allergie wordt toegeschreven aan genetische en omgevingsfactoren. Bijgevolg dienen deze dieren goed model voor het bestuderen van de interactie tussen genetische en oorzaken van allergie, de progressie van sensibilisatie voor ziekte, en mogelijke interventiestrategieën nadat klinische verschijnselen worden in

In 1887, Stömmer was de eerste persoon die de gelijkenis tussen mensen en paarden astma ¹³ beschrijven, het effect van histamine op de paarden cardiovasculaire systeem isvergelijkbaar met die van mensen ^14. Paarden zijn ook de hoeksteen van de paardenrennen, dat is een waarde van US $ 72000000000 met een betting omzet van US $ 115.000.000.000 per jaar ^15.

De meeste hedendaagse renpaarden zijn afstammelingen van het kleine aantal Arabische paarden gefokt door Lady Anne Blunt van 1878 en later. Moderne renpaarden worden vaak inteelt te selecteren voor de prestaties vaardigheden. Ze zijn gevoelig voor genetische aandoeningen, waarvan hun gevoeligheid voor allergische reacties monteren. Ze hebben ook 1000 maal hoger serum IgE-gehaltes dan zelfs de meest zwaar allergische mensen ^16. Paard allergische reacties zijn meestal manifesteert als insectenbeet overgevoeligheid (IBH) ^{17, 18.} IBH resultaten in dermatitis als gevolg van beten vormen insecten in het geslacht Culicoides. Een andere vorm van paardachtigen allergische ziekte terugkerende luchtweg obstructies (RAO) Dit manifesteert zich in de longen en luchtwegen. Het wordt gekenmerkt door een piepende ademhaling en labORed ademhaling. RAO zich vaker voordoet in reactie op sporen vormen en hoge allergeen-specifieke IgE niveaus zijn opgenomen in paarden met RAO in een studie ¹⁹ hoewel andere onderzoek niet heeft bevestigd ^20.

Studies over paarden allergie stond de poging tot controle en neutraliseren paarden IgE door de ontwikkeling van anti-paarden IgE monoklonale antilichamen (mAbs) ^{21 22.} Verder is de studie van ²³ beschrijft de productie van de extracellulaire domeinen van α paarden hoge affiniteit Fc receptor chain (FceRIa) receptor in een poging het detecteren en kwantificeren equine serum IgE. Een verwante studie van Ledin ²⁴ bespreekt een nieuwe aanpak gericht op het neutraliseren van serum IgE door priming het immuunsysteem met behulp van een zelf / niet-zelf immunogeen. Al deze studies echter miste een effectieve test om de veiligheid en werkzaamheid van de testprotocollen. In dit artikel hebben we nu zo'n assay sys presenterenteem voor het bestuderen van diagnostische en therapeutische strategieën om de paarden systeem, waarbij β-hexosaminidase afgifte, als een indicator van cel mediator degranulatie werd beoordeeld op RBL-cellen die 2H3.1 paarden FceRIa relevant. Dit protocol is gebaseerd op eerdere publicaties ^{25, 4, 5, 2, 3} beschrijft de constructie van RBL-cellen getransfecteerd met het gen dat codeert voor het IgE bindende domein van de receptor met hoge affiniteit voor IgE van verschillende species. Het protocol wordt uitgelegd hoe een β-hexosaminidase afgifte assay uitgevoerd, waarvan de resultaten worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaardafwijking van drievoudige experimenten.

De release assay werd voor het eerst ontwikkeld door Siraganian en Haak ²⁵ tot mens allergie te bestuderen. Het lab groep onder leiding van Dr. Reuben Siraganian ontwikkelde ook het RBL cellijn. Deze RBL cellen werden ontwikkeld om de menselijke FcsRIa uiten en het protocol dat werd gepubliceerd door ^4. Het laatste stukjevan de test kwam met de ontwikkeling van het plasmide pSV in het artikel van Neuberger ²⁶ die de productie van IgE-antilichamen beschreven door kloneren zijn zware keten gen stroomafwaarts van een muis gen voor een variabel gebied IgE dat het hapteen 4-hydroxy-3 richt nitro-phenacetyl (NP), het resulterende chimere antilichaam volledig functioneel. De mogelijkheid om een ​​IgE ontwikkelen zij hetzelfde hapteen, maar ook klonen zijn receptor op het oppervlak van RBL-cellen resulteerde in de standaardisatie van de test waardoor het een bruikbaar protocol voor de degranulatie van basofiele cellen te meten.

De test heeft wel voor- en nadelen. De voordelen van de test is de aanpasbaarheid te gebruiken in zoogdiercelsystemen, ons lab is dus gebruikt om te testen op de degranulatie van de mens, honden en paarden systemen, en dit kan worden bereikt door eenvoudig synthetiseren IgE het organisme en klonen zijn receptor op het oppervlak van de RBL-cellen.

Anderzijds,de nadelen van de test is dat de RBL-cellen zeer gevoelig zijn voor thermische, mechanische en PH veranderingen, waardoor ze een variatie van degranulatie niveaus in dezelfde test. Het wordt dus sterk aangeraden dat de assays altijd worden herhaald in drievoud en vervolgens een gemiddelde wordt genomen van hen. Bovendien is de RBL cellen neigen te verschuiven naar een niet lossend fenotype als ze nog in weefselkweek langere tijden (> 10 weken) ^27, waardoor het onderhoud omslachtig. Zij zijn ook gevoelig voor infecties door mycoplasma bacteriën, die onzichtbaar zijn van een lichtmicroscoop en kan de morfologie van de cel niet gewijzigd, maar zouden hun degranulatie niveaus drastisch veranderen. Dus regelmatig mycoplasma tests nodig.

Protocol

1) Voorbereiding van de Cell Line:

1. Het ontwikkelen van de RBL-2H3.1 cellijn die paarden FceRI α:
   1. Met behulp van elementaire weefselkweek technieken voor monolaag cellijnen, transfecteren ouderlijke RBL-2H3.1 cellen met behulp van de pEE6 plasmide, het dragen van de paarden FcsRIa gen (GenBank: Y18204.1) ^28. Voeg 2 ul ^-1 ug van het plasmide DNA 0,8 ml van cellen bij een dichtheid van 1,2 x 10 ⁷ cellen ^ml-1. Electroporate de cellen bij 250 uF 960 V met een 0,4 cm electrocuvette onmiddellijk incubeer op ijs gedurende 10 min.
   2. Selecteer de getransformeerde cellen met medium dat 0,4 g geneticine G418 sulfaat, vervolgens sorteren de overblijvende levende cellen door FACS door taggen met een fluorescerende IgE antilichaam. Gebruik de resulterende RBL-2H3.1 uiten equine FcsRIa cellijn voor het onderzoek ^{2, 3.}
2. Pre-test antilichaam sensibilisatie:
   1. Oogst de RBL-2H3.1 uiten paarden FcsRIa cellen van een samenvloeiing petrischaal. Wassen dan resuspendeer de cellen in kweekmedium tot een celdichtheid van 5x10 ⁵ cellen ^ml-1.
   2. Voeg de IgE van belang de gesuspendeerde cellen tot een eindconcentratie van 1 ng ml ^-1, dan plaat 100 ul cellen op een 96 puts plaat bij kolommen 1-6 en incubeer bij 37 ° C + 5% _CO2 + 90% relatieve vochtigheid gedurende 16 uur. Na de incubatietijd, en voor het uitvoeren van de release assay, controleer dan de putten onder een microscoop voor goed confluentie en cel therapietrouw.

2) afgifte test:

1. Het wassen van de cellen:
   1. Warm afgifte buffer (25 mM PIPES, 120 mM natriumchloride, 5 mM kaliumchloride, 0,04 mM magnesiumchloride en 1 mM calciumchloride) bij 37 ° C om voor zacht wassen van de cellen.
   2. Was de cellen in door de plaat naar cel media verwijderen en toevoegen van 100 ul warm, 37 ° C, vrijlating buffer. Tweemaal herhalen.
2. Antigen uitdaging:
   1. Bereid een seriële verdunning van het antigeen (NIP-HSA of DNP-HSA) van 0 ng ml ^-1, 0,1 ng ml ^-1, 1 ng ml ^-1, 10 ng ^ml-1, 100 ng ml ^-1, 1000 ng ml ^-1, 10.000 ng ^ml-1 in afgiftebuffer en verwarm bij 37 ° C.
   2. Na de tweede cel wassen, gooi de media en vervangen door 100 ul van het antigeen oplossingen. Controleer of putten in dezelfde rij (A1-6 bijvoorbeeld) dezelfde antigeenconcentratie toegevoegd.
   3. Het opzetten van een negatieve controle in rij A door het toevoegen van 0 ng ^{ml-1-antigeen.} Voeg toenemende antigeenconcentratie langs de rijen (BG) gevolgd door Triton x-buffer (5% Triton X-100) in rij H cellen lyseren van de cellen worden gebruikt als een positieve controle. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten om de cellen zijn mediatoren vrij.
3. Het opzetten van individuele welzijn controles:
   1. Na de incubatie, overdracht 50 pi celsupernatant aan de andere helft van de plaat (putjes A1-6 putjes A7-12, etc.). Gooi de resterende 50 pl supernatant en vervangen door 50 pi Triton-x buffer voor de meting van de hoeveelheid vrijgekomen mediatoren in elke well in kolom 7-12 laten als percentage van de totale mediatoren in de cellen in kolom 1-6 .
4. Enzym substraat:
5. Voeg 50 ul van β-hexosaminidase substraat (50 mM 4-nitrofenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide bereid in DMSO verdund tot 2 mM toe te voegen aan citraatbuffer 0,2 M citroenzuur en 0,2 M natriumacetaat, pH 4,5) alle wells om de omzetting van het substraat 4-nitrofenol door β-hexosaminidase enzym vergemakkelijkt. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 uur.

5. Het beëindigen van de reactie:
   1. Stop de reactie door de toevoeging van 150 pl Tris-buffer (1 M Tris-HCl, pH 9) aan elk putje en de hoge pH van de buffer stopt de reactie en wordt de 4-nitrofenol een gele kleur.
6. Het lezen en analyseren van de resultaten:
   1. Lees de plaat met een plaat spectrofotometer bij 405 nm om de absorptie van de gele kleur te meten. Berekend het percentage vrijgegeven β-hexosaminidase met behulp van de volgende formule:

2. Pas deze formule aan elk putje, waarna een gemiddelde wordt genomen voor elke rij. A1 en A7 geven de plaats van de putjes in de plaat met 96 putjes. Maak een grafiek van percentage van β-hexosaminidase afgifte (die overeenkomt met de totale mediatorafgifte) against antigeenconcentratie ^{2, 3.}

Resultaten

De ouderlijke RBL-2H3.1 cellen en die getransfecteerd met de paarden FcsRIa receptor gen werden voor het eerst gesensibiliseerd met muis IgE anti DNP-HSA en uitgedaagd met de DNP-HSA antigeen. Muis IgE bindt aan de endogene receptor in rat beide cellijnen en werkt dus als een controle om de levensvatbaarheid vrijlating van beide cellijnen te testen om mediators (Figuur 1 A) los. Dit is een belangrijke controle en dient regelmatig sinds na uitgebreid (> 10 weken) passage worden uitgevoerd in celcultur...

Discussie

Samengevat zijn de resultaten van dit onderzoek bleek dat wanneer RBL-2H3.1 cellen die paarden FcsRIa worden gesensibiliseerd met paarden IgE en uitgedaagd door een antigeen, ze geven een piek mediator release van 36,68% ± 4,88% van het totale bedrag van de mediator in de cellen, vergeleken met de RBL-2H3.1 oorspronkelijke cellen niet tot expressie paarden FcsRIa.

Dus deze test biedt een nuttig instrument voor het onderzoeken en bestuderen van equine allergische reacties in vitro. H...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα	-	-	Geproduceerd in het lab
Equine IgE anti NIP-HSA	-	-	Geproduceerd in het lab
96 Well Plate	Sigma	CLS3595	-
Multi Channel Pipette	Anachem	-	-
Incubator	Galaxy R	-	-
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrofenylacetaat	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH werd geconjugeerd met Human Serum Albumin om NIP-HSA in het lab te maken
Dinitrofenyl Geconjugeerd aan Human Serum Albumin	Sigma	A6661	Afgekort DNP-HSA
Plate Spectrofotometer	Anthos Labtec HT2	-	-
Pipes	Sigma	P1851	-
Natriumchloride	Sigma	S7653	-
Kaliumchloride	Sigma	P9333	-
Magnesiumchloride	Sigma	M2670	-
Calciumchloride	Sigma	C1016	-
Triton x100	Sigma	X100	-
4-nitrofenyl N-acetyl-β-D-glucosamine	Sigma	N9376	Stockoplossing genaamd β-hexosamine substraat was 50mM bereid in DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	-
Citroenzuur	Sigma	251275	-
Natriumacetaat	Sigma	S7670	-
Tris	Sigma	T5941	-