Ontwikkeling van een In vitro Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van Equus Caballus IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI

Summary

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Abstract

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains ¹. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout ^{2, 3}. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml^-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses ^{4, 5}. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease ^{6, 2, 3}.

Introduction

Allergie is gekend voor duizenden jaren. Een astma-behandeling werd beschreven in het Oude Egyptische medische tekst die bekend staat als de Ebers Papyrus (~ 1550 BCE) en besproken kruidenmiddelen om het ⁷ behandelen.

Vandaag allergie geclassificeerd als type I overgevoeligheidsreactie, waarbij de T-helpercel type 2 _(Th2) arm van het immuunsysteem stuurt de productie van immunoglobuline E (IgE) antilichamen in respons op omgevingsveranderingen antigenen genoemd allergenen. Dit zijn verschillende stoffen die gewoonlijk interactie met cellen in het immuunsysteem en stimuleert de synthese en secretie van pro-inflammatoi....

Protocol

1) Voorbereiding van de Cell Line:

1. Het ontwikkelen van de RBL-2H3.1 cellijn die paarden FceRI α:
   1. Met behulp van elementaire weefselkweek technieken voor monolaag cellijnen, transfecteren ouderlijke RBL-2H3.1 cellen met behulp van de pEE6 plasmide, het dragen van de paarden FcsRIa gen (GenBank: Y18204.1) ^28. Voeg 2 ul ^-1 ug van het plasmide DNA 0,8 ml van cellen bij een dichtheid van 1,2 x 10 ⁷ cellen ^ml-1. Electroporate de cellen bij 250 uF 960 V met een 0,4 cm electrocuvette onmiddellijk incubeer op ijs gedurende 10 min.
   2. Selecteer de getransformeerde cellen met medium dat 0,4 g geneti....

Results

De ouderlijke RBL-2H3.1 cellen en die getransfecteerd met de paarden FcsRIa receptor gen werden voor het eerst gesensibiliseerd met muis IgE anti DNP-HSA en uitgedaagd met de DNP-HSA antigeen. Muis IgE bindt aan de endogene receptor in rat beide cellijnen en werkt dus als een controle om de levensvatbaarheid vrijlating van beide cellijnen te testen om mediators (Figuur 1 A) los. Dit is een belangrijke controle en dient regelmatig sinds na uitgebreid (> 10 weken) passage worden uitgevoerd in celcultur.......

Discussion

Samengevat zijn de resultaten van dit onderzoek bleek dat wanneer RBL-2H3.1 cellen die paarden FcsRIa worden gesensibiliseerd met paarden IgE en uitgedaagd door een antigeen, ze geven een piek mediator release van 36,68% ± 4,88% van het totale bedrag van de mediator in de cellen, vergeleken met de RBL-2H3.1 oorspronkelijke cellen niet tot expressie paarden FcsRIa.

Dus deze test biedt een nuttig instrument voor het onderzoeken en bestuderen van equine allergische reacties in vitro. H.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα	-	-	Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA	-	-	Produced in the lab
96 Well Plate	Sigma	CLS3595	-
Multi Channel Pipette	Anachem	-	-
Incubator	Galaxy R	-	-
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin	Sigma	A6661	Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer	Anthos Labtec HT2	-	-
Pipes	Sigma	P1851	-
Sodium Chloride	Sigma	S7653	-
Potassium Chloride	Sigma	P9333	-
Magnesium Chloride	Sigma	M2670	-
Calcium Chloride	Sigma	C1016	-
Triton x100	Sigma	X100	-
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide	Sigma	N9376	Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	-
Citric Acid	Sigma	251275	-
Sodium Acetate	Sigma	S7670	-
Tris	Sigma	T5941	-