Methodenartikel

Hoge doorvoer analyse van volwassen stamcellen ontwikkeld voor toediening van therapeutische factoren voor Neuroprotective Strategies

DOI:

10.3791/52242

⸱

4 januari 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, 2Department of Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 3Biology Program, Iowa State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een experimenteel platform om snel gemanipuleerde stamcellen en hun gedrag te karakteriseren voordat ze worden toegepast in langetermijn in vivo transplantatiestudies voor redding en herstel van het zenuwstelsel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stamcellen (MSC's) afkomstig van beenmerg zijn een krachtige cellulaire bron en zijn in talrijke studies gebruikt als mogelijke kandidaten voor het ontwikkelen van strategieën voor de behandeling van verschillende ziekten. Het doel van deze studie was om MSC's te ontwikkelen en te karakteriseren als cellulaire voertuigen die zijn ontworpen voor de afgifte van therapeutische factoren als onderdeel van een neuroprotectieve strategie voor het redden van het beschadigde of zieke zenuwstelsel. In deze studie gebruikten we muis-MSC's die genetisch waren gemodificeerd met behulp van lentivirale vectoren, die codeerden voor hersenafkomstig neurotrofisch factor (BDNF) of gliaceldafkomstig neurotrofisch factor (GDNF), samen met groen fluorescent eiwit (GFP).

Voordat we verdergingen met in vivo transplantatiestudies was het belangrijk om de gemodificeerde cellen te karakteriseren om te bepalen of de genetische modificatie aspecten van normaal celgedrag had veranderd. Er werden verschillende kweeksubstraten onderzocht op hun vermogen om celadhesie, proliferatie, overleving en celmigratie van de vier subpopulaties van gemodificeerde MSC's te ondersteunen. Er werd hoogwaardige screeningsanalyse (HCS) uitgevoerd en beeldanalyse uitgevoerd.

Onderzochte substraten waren onder meer: poly-L-lysine, fibronectine, collageen type I, laminine, entactin-collageen IV-laminine (ECL). Ki67 immunolabeling werd gebruikt om celadhesie te onderzoeken en Propidium Jodide-kleuring werd gebruikt om celviabiliteit te onderzoeken. Time-lapse beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een getransmissie licht/milieukamerbeeldvormingssysteem op het hoogwaardige screeningssysteem.

Onze resultaten toonden aan dat de verschillende subpopulaties van de genetisch gemodificeerde MSC's vergelijkbaar gedrag vertoonden dat over het algemeen vergelijkbaar was met dat van de oorspronkelijke, niet-gemodificeerde MSC's. De invloed van verschillende kweeksubstraten op celgroei en celmigratie was niet dramatisch verschillend tussen groepen die de verschillende MSC-subtypen, evenals kweeksubstraten, vergeleken.

Deze studie biedt een experimentele strategie om gemodificeerde stamcellen en hun gedrag snel te karakteriseren voordat ze worden toegepast in langetermijn in vivo transplantatiestudies voor redding en reparatie van het zenuwstelsel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een groot probleem met de uitvoering van bruikbare therapieën voor de behandeling van aandoeningen van het zenuwstelsel is in het ontwikkelen van effectieve methoden die verdere degeneratie voorkomen en ook herstel van de functie te vergemakkelijken. Een innovatieve strategie is om genetisch ingenieur stamcellen ex vivo, voor de productie van neuroprotectieve factoren, voorafgaand aan hun transplantatie. Deze combinatie van celtherapie, gekoppeld aan een soort gentherapie, een krachtige werkwijze voor de behandeling van ziekte of letsel geïnduceerde neuronale dood in het zenuwstelsel.

Neurotrofe factoren zijn essentieel voor de groei en overleving van neuronen ontwikkeling en het onderhoud en plasticiteit van volwassen neuronen. Een aantal studies hebben belangrijke rollen van neurotrofe factoren aangetoond bevorderen initiële groei en differentiatie van neuronen in het centrale en perifere zenuwstelsel (CNS en PNS) en zij kunnen ook regeneratie stimuleert in vitro en in eennimal modellen van neurale letsel 1. BDNF (BDNF) wordt sterk tot expressie gebracht in het centrale zenuwstelsel en speelt een belangrijke rol bij het ​​reguleren van neurale ontwikkeling, synaptische plasticiteit en herstel 2. Gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) bevordert de overleving van vele soorten neuronen waaronder dopaminerge neuronen en 3. Aldus werd een belangrijke strategie om neurale reparatie op exogene bronnen van neurotrofe factoren geven aan de verwonde of zieke gebieden van het zenuwstelsel.

Multipotente beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (MSCs) bieden een enorm afgifte van therapeutische eiwitten naar de beschadigde of zieke zenuwstelsel. Transplantatie van MSC heeft aanzienlijke aandacht gekregen pogingen patiënt compatibele cellen gebaseerde therapieën ontwikkelen omdat ze een aantal voordelen, waaronder 1) relatieve gemak van isolatie en onderhoud, 2) multipotente capaciteit, 3) weinig ethische bezwaren, 4) Vermogen om te overleven en te migreren na transplantatie en 5) potentieel voor autologe transplantatie 4,5. Veelbelovende resultaten zijn gerapporteerd met gebruik van naïeve en genetisch gemanipuleerde MSCs in diermodellen voor verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, waaronder ruggenmergletsel 6,7, 8,9 beroerte, myeline 10, en retinale degeneratie 11-13. Koppelen celtransplantatie met de levering van neurale groeifactoren uit genetisch gemanipuleerde stamcellen is een nieuwe en belangrijke neurale reparatie strategie.

Een essentiële stap in de ontwikkeling cellen gebaseerde therapeutische factor afgiftesystemen op de normale gezondheid van de gemanipuleerde cellen te bepalen. Als zodanig, maar het voornaamste doel van deze studie was om de algemene groei parameters van genetisch gemanipuleerde volwassen stamcellen te evalueren. Een belangrijke benadering voor een snelle beoordeling van meerdere celparameters is om cellulaire image-based high-through Doorlichting in dienstg (HTS), vaak aangeduid als hoog gehalte screening (HCS) procedures 14. Deze technologie maakt het mogelijk geautomatiseerde imago verwerven en analyseren en deze aanpak is bijzonder goed geschikt voor stamcelonderzoek toepassingen. In dit project hebben we een profilering platform dat zorgt voor de snelle karakterisatie en optimalisatie van de cel-substraat voorkeuren en cellulaire functies met genetisch gemanipuleerde stamcellen van volwassenen gebruik van een HCS-systeem.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de ondergrond voor de 96-well platen

  1. Een kaart van de 96-well plaat waarin de verschillende substraten en celtypen te onderzoeken (Figuur 1).
  2. Haal de voorraadoplossingen van verschillende substraten [poly-L-lysine, fibronectine, collageen type I, laminine, en entactine-collageen IV-laminine (ECL)], een 96-putjes multi-putjesplaat en stelt een werkstation in een steriele celkweek capuchon.
  3. Bereid afzonderlijke substraten door verdunning van voorraad in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 5 pg / ml (deze concentratie was eerder bepaald op basis van een substraat concentratieafhankelijke assay voor groei en proliferatie van cellen). Meng met een vortex voor gieten in een steriel reservoir.
  4. Voeg 100 ul substraatoplossing in elk putje volgens de 96 putjes kaart (Figuur 1) (een 12- of 8-kanaals micropipet is geschikt voor micropipetteren in een 96-well plaat). Dicht de deksel om de 96-well plaat met een strook Parafilm en bewaar overnacht bij 4 ° C.

2. Cell Plating en Time-lapse Imaging

OPMERKING: Mouse MSCs werden geïsoleerd uit het beenmerg van volwassen C57BL / 6 muizen en gehandhaafd als een hechtende cellijn. MSC's geïnfecteerd met lentivirale vectoren te construeren uitscheiden hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF; humaan cDNA) en gliale cel afgeleide neurotrofe factor (GDNF; humaan cDNA) met lentivirale vector's codeert BDNF (LV-BDNF, CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF, CMV-GDNF-IRES-GFP), en groen fluorescerend eiwit (GFP, LV-GFP, CMV-GFP).
OPMERKING: Kweekmedia voor muizen mesenchymale stamcellen (MSCs) is Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium dat 10% hybridoma gekwalificeerd foetaal runderserum, 10% paarden serum, 2 mM L-glutamine en 10.000 U / ml penicilline, 10 mg / ml streptomycine . De vijf verschillende muizen MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC en BDNF / GDNF-GFP-MSC's) werden uitgeplaat bij ongeveer 30% confluentie in T75 celkweek flessen.

  1. Cel Plating
    1. Op de volgende dag, verwijder het substraat oplossingen door aspiratie en spoel elk putje met ongeveer 200 ul van steriele PBS, twee keer. Voeg celkweekmedium (200 pl / putje) aan elk putje na de laatste PBS spoeling. Plaats de plaat met 96 putjes in een celkweek incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2 gedurende equilibratie.
    2. Terwijl de 96-well plaat equilibreren in de incubator, oogst van de cellen door het verzamelen van de kweekmedia (MSCs in T75 kolven dient ongeveer 70% samenvloeiing op het moment van oogsten / plating zijn) (hierna geconditioneerde media) van de T75 kolf en opslaan in een 15 ml conische buis onder steriele omstandigheden (dit geconditioneerde medium wordt gebruikt in stap 2.1.4 hieronder).
    3. Voeg 8 ml steriele PBS om de kolf en draai voorzichtig en dan pipet uit de PBS en voeg 1 ml van 0,05% trypsine en 0,01%EDTA-oplossing om de cellen los te maken van het kweekoppervlak van de T75 kolf. Monitor cel onthechting door het bekijken van de kolf met behulp van een omgekeerde microscoop uitgerust met fase contrast optiek.
    4. Wanneer de cellen hebben losgemaakt, onmiddellijk aan toevoegen 8 ml van de geconditioneerde media (in stap 2.1.2 verzameld) aan de kolf. Verzamel de celsuspensie overgebracht in een 15 ml conische centrifugebuis en centrifugeer gedurende 4 min bij 450 xg om de cellen te pelleteren.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 200 ui vers en verwarmd (37 ° C) celkweekmedium.
    6. Bepaal het aantal cellen in de celsuspensie door het uitvoeren van een trypan blauw telling van levensvatbare cellen met een hemocytometer. Plaat de cellen bij een dichtheid van ongeveer 300 cellen / putje in de geschikte putjes van de plaat met 96 putjes.
    7. Herhaal deze stappen voor elke populatie van cellen.
  2. Time-lapse Imaging
    1. Zodra alle van de MSC's zijn bedekt, plaats96-well plaat in een incubator gedurende 2 uur om de MSC om aan een substraat.
    2. Start de HCS systeem wacht 2 uur voor het systeem equilibreren. Stel het milieu regelaar 37 ° C en sluit een gemengde gasfles met 5% CO2 in lucht tot het HCS systeem klimaatkamer toevoeren van een constante luchttoevoer.
    3. Verwijder de 96-well plaat uit de incubator na 2 uur evenwichtsperiode en dadelijk in de celgroeikamer van de HCS systeem. Laat 30 min evenwichtstoestand om eventuele warmte-gerelateerde uitzetting van de plaat en start het beeld acquisitie en analyse software om de plaat te configureren.
    4. Selecteer de 20X objectief voor imaging. Selecteer twee putten per aandoening [dwz, GFP-MSC's op Fibronectine enz. (6 substraten x 5 MSC subtypen voor een totaal van 30 voorwaarden x 2 herhalingen = 60 putten in totaal)] voor het opzetten van time-lapse imaging. Kies twee sites voor beeldvorming metin elk putje.
    5. Kies de juiste golflengtes van het licht voor de beeldvorming.
      OPMERKING: Twee verschillende golflengten (Fase contrast en GFP fluorescentie) werden geselecteerd voor time-lapse imaging.
    6. Focus op de put bodem met behulp van laser autofocus en neem testbeelden voor meerdere sites en meerdere putten om een ​​geoptimaliseerde focal plane vinden.
    7. Zodra de focus is vastgesteld, begint het vastleggen van beelden om de 5 min voor 48 uur voor alle 60 putten (120 plaatsen).
    8. Voer de cellen elke 24 uur door het verwijderen van de 96-well plaat uit de HCS systeem. Verwijder 75 ul van medium uit elk putje en voeg 100 ul vers medium aan elk putje (evenwicht dit vers medium bij 37 ° C en 5% CO2).
    9. Aan het einde van de time-lapse experiment, verwijder de 96-well plaat uit de HCS systeem. Onder steriele omstandigheden, verzamel de geconditioneerde media monsters uit elk putje en breng deze monsters een 96-well plaat.
      OPMERKING: Deze monsters kunnen worden gebruikt voor verdere analyzeis door het uitvoeren van ELISA voor neurotrofe factoren.
    10. Bereid de plaat met 96 putjes met gekweekte MSC extra testen zoals Ki67 celproliferatie assay of propidium iodide levende / dode kleuring assay (zie hieronder).
    11. Voeren time-lapse imaging-analyse voor celmigratie / cell tracking zoals beschreven in paragraaf 5 hieronder.

3. Ki67 Celproliferatie en propidiumjodide Levend / Dead Assay

  1. Ki67 celproliferatietest (Immunocytochemie)
    1. Spoel de celkweken met 0,1 M fosfaat (PO4) buffer gedurende één minuut twee keer. Bevestig de kweek met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Verwijder de PFA en spoel de putjes met PBS gedurende zeven minuten drie keer.
    2. Na de laatste spoeling, voeg 100 pl blokkerende oplossing (fosfaatbuffer zoutoplossing, 5% normaal serum ezel, 0,4% bovine serum albumine, en 0,2% Triton X-100) aan elk putje eennd incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bereid de primaire antilichaam, konijn anti-Ki67, door verdunning in blocker oplossing bij een mengverhouding van 1: 200.
    3. Verwijder de blocker oplossing en 100 pl van het primaire antilichaam oplossing aan elk putje. Bedek de plaat met 96 putjes en incubeer de monsters bij 4 ° C overnacht.
    4. Op de volgende dag, verwijder het antilichaam oplossing en spoelen met PBS gedurende 7 min, 3 keer.
    5. Bereid het secundaire antilichaam, ezel anti-konijn Cy3 in blokkerende oplossing bij een mengverhouding van 1: 500. Voeg DAPI nucleaire vlek het secundaire antilichaam oplossing bij een verdunning van 1: 100. Na het verwijderen van de laatste PBS spoeling Breng 100 pi van het secundaire antilichaam / DAPI oplossing in elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 90 min.
    6. Verwijder het secundaire antilichaam / DAPI en spoel elk putje met PBS gedurende 7 min, 3 keer. Bedek de plaat met 96 putjes en bewaar bij 4 ° C tot beeldvorming.
  2. Propidium Jodide Levend / Dead Assay
    1. Meet celdood door propidium jodide (PI) uitsluiting assay zoals hierna beschreven.
    2. Bereid de propidium jodide kleuring oplossing bij een concentratie van 1,5 pM in kweekmedia.
    3. Voeg 100 ui 70% ethanol tot een putje van de MSC's gedurende 2 min aan de te doden die cellen. Deze goed dient als positieve controle voor de PI vlek. De meerderheid van de MSC zal PI gekleurde aangeeft celdood. Verwijder de ethanoloplossing.
    4. Voeg 100 ul propidiumjodide kleuring oplossing in elk putje en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
    5. Spoel de cellen met 0,1 M fosfaatbuffer gedurende 1 min, 2 keer. Fixeer de cellen met 4% PFA in 0,1 M P0 4 buffer gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Verwijder de PFA en spoelen met PBS driemaal gedurende 7 min.
    6. Incubeer met DAPI oplossing (1:50) verdund in blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Spoel alle putjes metPBS gedurende 7 min, 3 keer.
    7. Verwijder de DAPI en spoel elk putje met PBS gedurende 7 min, 3 keer. Bedek de plaat met 96 putjes en bewaar bij 4 ° C tot beeldvorming.

4. Geautomatiseerde Imaging en Multiwavelength Scoren Analyse

  1. Laad een 96-well plaat (voorheen verwerkt voor Ki67 immunokleuring of propidiumjodide gekleurd) in het HCS systeem en laat de plaat equilibreren gedurende 20 min openen HCS beeldsysteem acquisitie en analyse software.
  2. Kies de verwerving instellingen voor de 10X objectief met camera binning 1 en een versterkingsinstelling van 2. Vind de Z-vlak waarin de cellen bevinden door gebruikmaking van de functie Automatische en berekent de offset voor elke golflengte van belang. Voor deze analyse, beelden vast te leggen voor DAPI (W1), Cy3 (W2), en FITC (W3). Kies de maximale intensiteit niveau waarop de negatieve controle putten vertonen geen signaal voor het acquisitie. Bevestig deze instelling geschikt is voor de pos istieve putten.
  3. Verwerven plaat. Maak foto's en bewaar ze in het beeld acquisitie en database analyse software.
  4. Zodra beelden zijn verworven, geopende afbeelding verwerven en analyseren offline software en beoordeling plaat gegevens uit de bovenstaande afbeeldingen verworven.
  5. Selecteer de Multi-golflengte scoren analyse. Configureer de minimale en maximale intensiteiten voor elke golflengte.
    OPMERKING: DAPI detectie moet de vlekken rond elke zichtbare kern markeren. Cy3 moet de positieve cellen met Ki67 immunoreactiviteit (IR) detecteren en mag niet detecteert IR onder de negatieve controles. Voor Cy3 Ki67 IR, de geschatte minimale breedte was 7 micrometer, bij benadering maximale breedte was 30 micrometer, de intensiteit boven de lokale achtergrond was 150 grijswaarden, en de minimale vlek was 50 pm 2.
  6. Run-analyse voor alle posities. De gegevens te exporteren om te bekijken in spreadsheet.

5. Cell Tracking

  1. Open afbeelding acquisition en analyse programma en klik op "Review Plate gegevens [DB] ...", het selecteren van de plaat van belang.
  2. Bekijk de gegevens als "Time vs. Well".
  3. Kies een van de sites van de sectie "Sites" door links te klikken op de gewenste selectie. Selecteer "doorgegeven ..." onder de "Wavelengths:". Klik met de rechtermuisknop op het doel goed in de 96-well plaat sjabloon en klik op "Afbeeldingen laden".
  4. Volg de cellen door te klikken op de "apps" en dan "Track objecten".
  5. Gebruik "Dynamic Data Exchange (DDE)" om het formaat kiezen om de gegevens, bijvoorbeeld Microsoft Excel exporteren.
  6. Kies de tracking gegevens te exporteren, bijvoorbeeld, de verstreken tijd, voorwerp, afstand, tijd interval, snelheid, absolute hoek, afstand tot de oorsprong, delta x en delta y.
  7. Tag elke cel van belang met "Ctrl-toets + linker muisknop" on target cellen.
  8. Track cellen. Indien nodig, te stoppen / veranderen oneigenlijk volgen van cellen met de toets "Esc" en vervolgens de instellingen aan te passen.
  9. Na cell tracking is voltooid, gegevens op te slaan met "Log Data".

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC groeiparameters werden onderzocht door het kweken van de verschillende populaties van MSCs op verschillende substraten. De vijf verschillende populaties van MSC subtypes (MSCs, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC's en BDNF / GDNF-GFP-MSC's) werden uitgeplaat in 96-well weefselkweek platen vooraf bekleed met de verschillende substraten zoals weergegeven in figuur 1. Na vier dagen kweken werden de platen gefixeerd en immunologisch en / of gekleurd met de geschikte reagentia en het gebruik van de HCS systeem vervolgens onderzocht en analyses uitgevoerd met de beeldacquisitie en analyse software.

figure-results-1
Figuur 1:. 96-well plaat sjabloon voor proefopzet 96 putjes werden bekleed met verschillende substraten en putjes werden geënt met gemanipuleerde stamcellen zoals in de template. Als voorbeeld, maar wells in rijen BF werden in dit experiment. Rijen A, G en H waren leeg gelaten. Afkortingen - MSC's: mesenchymale stamcellen; GFP-MSC's: green fluorescent eiwit tot expressie MSC; BDNF-GFP-MSC's: hersenen afgeleide neurotrofe factor-GFP expressie MSC; GDNF-GFP-MSC; Gliale cel afgeleide neurotrofe factor-GFP expressie MSC; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF en GDNF- GFP-expressie MSC's; ECL: entactine-collageen IV-laminine).

Anti-Ki67 immunokleuring, gevolgd door DAPI tegenkleuring werd gebruikt om te evalueren of de verschillende substraten beïnvloed proliferatie van de verschillende populaties van gemanipuleerde MSCs (Figuur 2A). Expressie van de Ki67 antigeen treedt met voorkeur in de late G1, S, G2 en M fasen van de celcyclus, en niet in cellen in de rustfase (G 0) gedetecteerd en is daarom bruikbaar als een marker voor cellulaire proliferatie 15 . 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) is een veelgebruikte nuduidelijke en chromosoom tegenstreng dat blauwe fluorescentie uitzendt na binding aan AT regio's van het DNA 16. Het totaal aantal cellen in een gebied kan worden bepaald door het tellen van het aantal DAPI gekleurde kernen. Zoals geïllustreerd in figuur 2B, hoewel er variatie in het percentage prolifererende MSCs, alle substraten toch ondersteunde aanzienlijke celproliferatie voor elk van de MSC subtypes.

figure-results-2
Figuur 2: Ki67 celproliferatie assay. (A) Samengevoegd, dubbel-fluorescerende beeld van Ki67 immunolabeling (rood) en DAPI (blauw) kernkleuring. Veel van de MSCs werden immunologisch met Ki67 antilichaam (rood). Schaalbalk = 50 um. (B) staafgrafiek het percentage Ki67 immunologisch MSC subtypes gekweekt op polystyreen (PS), poly-L-lysine (PLL), fibronectine, collageentype I, laminine of entactine-collageen IV-laminine (ECL) substraten voor 5 dagen in vitro (DIV). N = één experiment. Elke staaf vertegenwoordigt gemiddeld gepoolde gegevens uit 8 afgebeeld plaatsen van 2 putten voor elke conditie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Propidium jodide (PI) kleuring werd gebruikt om te evalueren of de verschillende substraten beïnvloed celoverleving (figuur 3). Propidiumjodide is een veelgebruikte rood-fluorescerende nucleaire en chromosoom tegenkleuring. Propidium jodide membraan impermeant en algemeen buiten levensvatbare cellen, en is dus nuttig om dode cellen te detecteren in een populatie. Het percentage dode cellen in een bepaalde toestand te bepalen in combinatie met een algemene nucleaire label zoals DAPI om alle cellen in een veld identificeren. Het percentage van de PI-positieve cellen was laag op alle houders onderzocht (Figuur 3). Als positieve controle voor de PI reagens werden enkele putjes die MSCs geïncubeerd in 70% ethanol, een aandoening bekend meeste cellen te doden, wat resulteert in een hoog percentage van PI-gemerkte cellen zoals geïllustreerd in figuur 3B en 3C (ethanol behandeld positieve control).

figure-results-3
Figuur 3: Propidiumjodide celdoodassay. (A) Samengevoegd, het dubbele tl voor propidiumjodide (rood) en DAPI (blauw) vlekken. Hoewel de kernen van alle levensvatbare cellen werden gekleurd met DAPI (blauw) werd geen propidium iodide kleuring gedetecteerd in de MSC. (B) Vrijwel alle MSC's werden gekleurd met propidiumjodide na blootstelling aan 70% ethanol. Schaalbalken in A en B = 100 urn. (C) Bar grafiek die de percentages van propidiumjodide (PI) gekleurd MSC subtypes gekweekt op polystyreen (PS), poly-L-lysine (PLL), fibronectine, collageen type I, laminine of entactine-collageen IV-laminine (ECL) substraten voor 5 dagen in vitro (DIV). Ethanol Controle: Deze conditie diende als een positieve controle voor de PI kleuring reagens. De meeste cellen blootgesteld aan PI vlek volgende ethanol behandeling dood zijn en dus positief gekleurd voor de PI-reagens. N = één experiment. Elke staaf vertegenwoordigt gemiddeld gepoolde gegevens uit 8 afgebeeld plaatsen van 2 putten voor elke conditie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om de mogelijke invloed van verschillende substraten op het gedrag van gemanipuleerde MSC's, cel migratie werd geanalyseerd met behulp van time-lapse digitale microscopie en het doorgelaten licht / milieu-kamer-systeem op het HCS systeem te onderzoeken (zie Aanvullende Video 1). Meerdere sites / goed werden time-lapse afgebeelden gebruikt om celmigratie berekenen van de verschillende subpopulaties van MSCs groeien op verschillende substraten met de beeldacquisitie en analyse software. In het algemeen, zoals getoond in figuur 4C, alle subtypes van MSCs toonde de snelste migratiesnelheid van de extracellulaire matrix gecoate oppervlakken (fibronectine, collageen, laminine en ECL) en de langzaamste op niet beklede polystyreen oppervlak.

figure-results-4
Figuur 4:. Cell tracking en migratie MSC bijgehouden met afbeelding acquisitie en analyse software. Overlay beelden van doorgelaten licht en fluorescentie beelden van (A) de start van de time-lapse beeldvorming en (B) op 29 uur later aan het einde van de time-lapse imaging-sessie (zie Aanvullende Video 1). Celmigratie nummers worden aangegeven door de gekleurde lines. Schaalbalk. 50 pm (C) Bar grafiek die de gemiddelde migratiewaarden (uitgedrukt in pm / uur) MSC subtypes gekweekt op polystyreen (PS), poly-L-lysine (PLL), fibronectine, collageen type I, laminine, of entactine-collageen IV-laminin (ECL) substraten voor 2 dagen in vitro (DIV). N = één experiment. Elke staaf vertegenwoordigt het gemiddelde van ten minste 10 afgebeeld cellen uit 2 putten voor elke conditie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tezamen bieden deze resultaten leveren voorlopig bewijs dat deze subpopulaties van genetisch gemanipuleerde MSC gelijkaardige groei-eigenschappen weer te geven. Deze resultaten leveren overtuigend bewijs dat de lentivirale gemedieerde genetische modificaties van deze MSC gaf geen dramatische aantoonbaar schadelijke effecten op de groei parameters onderzocht met behulp van deze screening platform.

Aanvullende Video 1. Time-lapse digitale video van MSC volgen met behulp van het beeld acquisitie en analyse software programma. Het migratiepad is voor twee MSC's [aangeduid als 1 (groen volgen lijn) en 2 (Blue volgen lijn)] worden geïllustreerd. Video vastgelegd tijdens een 29 uur periode. Beelden werden vastgelegd om de 5 min. Fluorescentie beelden van GFP-expressie MSC's werd gebruikt voor time-lapse beeldvorming in de voorbereiding van de video. Kalibratiebalk = 50 micrometer. Dit type analyse is nuttig voor het onderzoeken cel gedrag, waaronder celmigratie en celdeling.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volwassen mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn een aantrekkelijk celtype voor de ontwikkeling van een experimentele strategie combineert een cellulaire en gen delivery gebaseerde therapie. MSC's zijn multipotent, kunnen differentiëren in cellen van mesodermale afkomst, en weer aanzienlijke plasticiteit, differentiëren / transdifferentiating in neuronale en gliale geslachten met de juiste inductie paradigma 17,18. Bovendien zijn MSCs werden getransplanteerd en effectief gebleken in preklinische studies voor een aantal aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen 19. De therapeutische werkzaamheid van MSCs bekend vanwege hun gunstige anti-proliferatieve, anti-inflammatoire en anti-apoptotische activiteiten 20. MSCs zijn ook bekend om verschillende neurotrofe en groeifactoren, die waarschijnlijk bijdraagt ​​aan de neuroprotectieve eigenschappen geassocieerd met naïeve MSC na transplantatie op plaatsen van beschadiging of ziekte 21 produceren en uitscheiden. Importantly kunnen MSC's genetisch worden gemodificeerd voor langdurige afgifte van neurotrofe factoren voor gecombineerde cellulaire en gentherapie toepassingen en zijn gebruikt in een aantal diermodellen van verwonding of ziekte het CNS 11,19,22.

Bij het ​​ontwikkelen van een gecombineerde cellulaire en gentherapie gebaseerde strategie is het belangrijk dat de gezondheid van de cellen zorgvuldig onderzocht vóór het uitgebreide gebruik in vitro, met name in vivo toepassingen. Als een proof of concept, hebben we onderzocht meerdere populaties van gemanipuleerde en controle MSC lijnen, om de gevolgen van de genetische modificaties op de gezondheid van de cel en fitness met een hoog gehalte screening (HCS) aanpak te bestuderen. In het algemeen, HCS verwijst naar cellulaire image-based high throughput screening 14. Deze screening aanpak maakt een kwantitatieve beoordeling van cellulaire fenotypes op verschillende niveaus van ruimtelijke (cel subcellulaire) en temporele (milliseconden tot dagen) resolution over verschillende experimentele omstandigheden. Dankzij deze aanpak toegankelijk mogelijke verschillen in substraatvoorkeur op de volgende parameters: celproliferatie, expressie van groen fluorescent eiwit (GFP), celdood en celmotiliteit / migratie. Experimenten werden ontworpen in 96-well celkweek plaatformaat. Binnen enkele plaat we routinematig onderzocht mogelijke substraat gerelateerde verschillen ten opzichte van elke parameter voor de verschillende MSC populaties van lentivirale getransduceerde cellen en vergeleken de kunstmatige MSCs met de originele, niet-getransduceerde MSC's. Dit leverde een middel om de resultaten voor de verschillende MSC subtypes rechtstreeks vergelijken met een batterij van in vitro testen zoals celproliferatie behulp Ki67 immunolabeling, live / dead levensvatbaarheid van de cellen test met behulp van propidiumjodide kleuring, en het gedrag van cellen door het uitvoeren van time-lapse digitale beeldbewerking . Als een verlengstuk van deze HCS kan men ook ELISA's uitvoeren op geconditioneerde media monsters verzameld van individuele wells om kwantitatief secretie van neurotrofe factoren. Geconditioneerde media van verschillende MSC subtypen kunnen ook worden gebruikt in in vitro bioassays biologische activiteit van uitgescheiden factoren 11,23 bepalen. Dit type HCS platform kan eveneens worden gebruikt voor in vitro metingen van neuriet uitgroei uit primaire neuronale kweken en neurale stamcellijnen 24. Kortom, onze resultaten zien dat de subpopulaties van de genetisch gemodificeerde MSCs weergegeven soortgelijke gedrag in vergelijking met het ongemodificeerde MSC. De invloed van verschillende cultuur substraten op celgroei en celmigratie was dramatisch verschillend tussen de MSC subtypes, alsook cultuur substraten. Als zodanig heeft de extracellulaire matrix substraten getest verschijnt niet een cruciale rol spelen bij het moduleren van deze aspecten van celgedrag deze verschillendenanomaterialen MSCs.

Deze studie toont het gebruik van een HCS systeem voor het analyseren different aspecten van cel gedrag. Het is echter niet ongebruikelijk tegenkomen beperkingen geassocieerd met beeldanalyse. Bij gelegenheid, terwijl het analyseren van de fluorescentie beelden, het was een beetje moeilijk om de juiste drempelwaarde waarboven immunolabeled of gekleurde cellen zouden worden geteld als positief bestempeld / lood te bepalen. Aldus subjectieve vertekening te minimaliseren, de vaststelling van de drempelwaarden afhankelijk was een vergelijking met controles (negatieve controles voor fluorescentie beeldvorming hebben gelijktijdig gedurende alle verwerking door het weglaten van het primaire of secundaire antilichamen uitgevoerd). Een andere beperking is opgetreden tijdens de analyse van cel migratie met behulp van time-lapse digitale beeldbewerking. In sommige gevallen, de beeldverwerkingssoftware niet kunnen maken tussen willekeurige Brownse beweging van een cel dan een cel eigenlijk migreren slechts een zeer korte afstand. Aanvullende beperkingen waren duidelijk in situaties waarin de analysesoftware was niet in staat de aanwezigheid van multip onderscheidenle cellen in nabijheid van één andere. Om deze beperking nodig handleiding cel selectie te overwinnen tijdens de analyse in plaats van een volledig geautomatiseerde analyse. Cell uitplaatdichtheid kan ook leiden tot vertekening celmigratie gegevens tussen populaties van cellen die meer voorkeur groeien in groepjes versus cellen die groeien los van elkaar weergegeven. Deze soorten verschillen in delen die een weerspiegeling van cel-substraat versus cel-voorkeuren.

Met een HCS systeem om beelden te verkrijgen en gegevensanalyse uitvoeren een efficiënte en snelle manier om meerdere bloedcelparameters beoordelen. Daarnaast werden time-lapse digitale video's voor 30 verschillende omstandigheden (6 substraten en 5 verschillende MSC subtypes) routinematig verworven over een periode van uren tot dagen (48 uur) tijdens het gebruik van de klimaatkamer. Deze gegevens werden vervolgens gebruikt om verschillen in celmigratie prijzen in verschillende cellijnen van verschillende ECM berekenen enmoleculen.

In dit rapport hebben we de implementatie van een hoog gehalte screening platform voor de gezondheid en de functie cel beoordelen gemarkeerd. Dit type analyse is nuttig voor de ontwikkeling van rationele strategieën voor het ontwerpen celtypen, alsook polymere substraten gericht celgroei en neurale regeneratie bevorderen. Dit is een essentiële stap op weg naar de toepassing van stamcellen gebaseerde levering van therapeutische factoren voorafgaand aan de uitgebreide in vivo preklinische studies met behulp van celtransplantatie strategieën.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Publicatie vergoedingen voor deze video artikel werden ondersteund door Molecular Devices, LLC.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door de US Army Medical Research and Materiel Command (subsidienummer W81XWH-11-1-0700) en het Stem Cell Research Fund. PAB en EMP waren ontvangers van Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 well platesGreiner Bio One65509096 well plates selected for use in ImageXpress
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)A9647
Rabbit anti-Ki67 antibodyAbcam (Cambridge, MA)Ab166671:200 verdunning
Collagen type ISigma-Aldrich (St. Louis, MO)C7661Rattenstaart collageen
DAPIInvitrogen (Carlsbad, CA)D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) 711-165-1521:500 verdunning
ECL(Entactin-Collagen-Laminin)Millipore/Chemicon (Temecula, CA)08-110
Fetal bovine serum (FBS)Hyclone (Logan, UT)SH30071.03
Equine serumHyclone (Logan, UT)SH3007403
EthanolChemistry Store (Ames, IA)12003510100%, 200 proof
FibronectinFisher Scientific (Hampton, NH)CB-40008
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)Hyclone (Logan, UT)SH30396.03
KH2PO4Fisher Scientific (Hampton, NH)P285Voor PO4 buffer
K2HPO4Fisher Scientific (Hampton, NH)P288Voor PO4 buffer
L-GlutamineGibco/Invitrogen (Grand Island, NY)25030-081
Laminine (muis)Trevigen (Gaithersburg, MD)3400-010-01
Mouse MSCs of adult C57BL/6 miceTulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)Geïsoleerd uit beenmerg
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)Deze cellen werden verkregen uit ons eerdere onderzoek: Ye et. al. (in voorbereiding)
Normal donkey serum (NDS)Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) 017-000-121
Paraformaldehyde (PFA)Fisher Scientific (Hampton, NH)O40424% PFA in 0.1 M PO4 buffer
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich (St. Louis, MO)P0781
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)P4417
Poly-L-lysineSigma-Aldrich (St. Louis, MO)P4707
Propidium iodide (PI)Invitrogen (Carlsbad, CA)P1304MP
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)X100
Trypsin 0.05% (EDTA 1x)Invitrogen (Carlsbad, CA)25300-054
Iscove's Modified Dulbecco's MediumInvitrogen (Carlsbad, CA)12440–046
Hybridoma-qualified FBSHyclone (Logan, UT)SH30396.03
Equine serumHyclone (Logan, UT)SH3007403
ImageXpress MicroMolecular devices (Sunnyvale, CA)ImageXpress microHigh content screening systeem
MetaXpress 4.0Molecular devices (Sunnyvale, CA)MetaXpress 4.0Beeldverzameling en analysesoftware

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
  2. Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
  3. Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
  4. Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
  5. Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
  6. Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
  7. Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
  8. Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
  9. Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
  10. Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
  11. Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
  12. Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
  13. Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
  14. Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
  15. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
  16. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
  17. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
  18. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
  19. Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
  20. Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
  21. Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
  22. Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
  23. Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
  24. Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mesenchymale stamcellenhigh content screeninglentivirale vectorenbrain derived neurotrophic factorglial cell derived neurotrophic factortime lapse imagingpropidiumjodide kleuringKi67 immunolabelingcelproliferatie assaycelmigratieanalyse

Gerelateerde artikelen