Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Samenvatting

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Samenvatting

Auditieve haarcellen in het muizenorgaan van Corti detecteren en verzenden geluidsinformatie naar het centrale zenuwstelsel. De mechanosensorische haarcellen zijn uitgelijnd in één rij binnenste haarcellen en drie rijen buitenste haarcellen die zich uitstrekken langs de basale naar apicale as van de cochlea. De explantaatkweektechniek die hier wordt beschreven, biedt een efficiënte methode om cochleaire explantaten van het embryonale muizenbinnenoor te isoleren en te onderhouden. Bovendien lijken de morfologie en moleculaire kenmerken van sensorische haarcellen en niet-sensorische ondersteunende cellen binnen de cochleaire explantaatkweek op die in vivo waargenomen worden en kunnen worden bestudeerd binnen hun intrinsieke cellulaire omgeving. De cochleaire explantaten kunnen dienen als belangrijke experimentele hulpmiddelen voor de identificatie en karakterisering van moleculaire en genetische paden die betrokken zijn bij cellulaire specificatie en patroonvorming. Hoewel transgene muismodellen een effectieve benadering bieden voor genexpressiestudies, sterft een aanzienlijk aantal muismutanten tijdens de embryonale ontwikkeling, waardoor de analyse en interpretatie van ontwikkelingsfenotypen wordt belemmerd. Het orgaan van Corti van mutante muizen die vóór de geboorte sterven, kan worden gekweekt zodat hun in vitro ontwikkeling en reacties op verschillende factoren kunnen worden geanalyseerd. Bovendien beschrijven we een techniek voor het elektroporeren van embryonale cochleaire explantaten ex vivo die kan worden gebruikt om specifiek gen(en) te onderdrukken of overexpressie te veroorzaken en hun mogelijke endogene functie te analyseren en te testen of een specifiek genproduct noodzakelijk of voldoende is in een bepaalde context om de ontwikkeling van het zoogdiercochleair apparaat te beïnvloeden^1-8.

Inleiding

Het orgaan van Corti bij zoogdieren bestaat uit een mozaïek van gespecialiseerde celtypen, waaronder twee soorten mechanosensorische haarcellen, evenals ten minste vier soorten niet-sensorische ondersteunende cellen, waardoor het een ideaal modelsysteem is om normale cellulaire processen zoals proliferatie, lotspecificatie, differentiatie en patterning te bestuderen. Bovendien is de normale ontwikkeling van deze verschillende celtypen essentieel voor een normale gehoorfunctie. Daarom is het van cruciaal belang om de factoren, zowel moleculair als cellulair, die hun ontwikkeling reguleren te begrijpen. Desondanks vormt de kleine omvang van de muizencochlea en zijn ontoegankelijkheid een bijzondere uitdaging voor genexpressiestudies. Bovendien vinden de meeste van de gebeurtenissen met betrekking tot celbestemmingsspecificatie en patterning plaats tijdens embryonale perioden en zijn meestal voor de geboorte voltooid. Daarom is identificatie en karakterisering van signaalgebeurtenissen tijdens embryonale perioden essentieel om inzicht te krijgen in de moleculaire basis van cochleaire morfogenese.

Hier demonstreren we een methode om intacte cochlea in vitro te kweken uit embryonale muizen binnenoren. De redenering achter het gebruik van deze techniek is dat gekweekte cochleae hun moleculaire en morfologische kenmerken behouden, waardoor ze een waardevol model bieden voor het onderzoeken van potentiële kandidaatgenen en het onderzoeken van de mechanismen die betrokken zijn bij cochleaire morfogenese. Hoewel transgene muizen kunnen worden gebruikt voor genexpressiestudies, is een in vitro systeem vaak nodig voor het monitoren van specifieke genfuncties. Bovendien kunnen cochleaire culturen worden opgezet van transgene muizenembryo's, zodat hun in vitro ontwikkeling en reactie op verschillende oplosbare factoren en antagonisten kunnen worden bestudeerd. Hoewel embryo's op dag 13 (E13) worden gebruikt in dit protocol, kunnen culturen van E12 of E14 tot vroege postnatale binnenoren vergelijkbare resultaten opleveren.

We presenteren ook een genoverdrachttechniek in gekweekte embryonale cochleaire explantaten met behulp van vierkantsgolfelektroporatie. Na de isolatie van de cochleaire explantaten kan elektroporatie worden gebruikt om DNA-plasmiden van gen(en) van belang in individuele cellen binnen de cochleaire ductus te laten uitdrukken. Deze techniek dient als een complementaire aanpak voor studies die gebruikmaken van transgene muizen om inzicht te krijgen in de moleculaire paden die ten grondslag liggen aan het cellulaire fenotype. Door deze methode van genoverdracht wordt een verscheidenheid aan epitheelceltypen binnen de embryonale cochlea getransfecteerd, waardoor verlies- en winst-van-functie-analyses op het niveau van een enkele cel mogelijk worden. Bovendien kunnen elektrofysiologische studies ook worden uitgevoerd in cochleaire explantaatculturen⁸. Deze methode van in vitro elektroporatie is relatief eenvoudig en rechttoe rechtaan, en gecombineerd met minimale schade aan het weefsel, heeft dit geleid tot een snelle uitbreiding van deze techniek.

Protocol

OPMERKING: Alle protocollen waarbij levende dieren moeten worden beoordeeld en door een Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd en moet volg officieel goedgekeurde methoden voor de verzorging en het gebruik van de proefdieren. Alle secties worden uitgevoerd met steriele techniek op een schone laminaire stroming bank. Handschoenen en een masker desgewenst worden gedragen tijdens deze procedure.

1. Dissectie van de embryonale Mouse Inner Ear

1. Instellen voor orgaan van Corti explantkweken:
   1. Steriliseer de laminaire stroming weefselkweek kap instelling door UV licht gedurende ongeveer 30 minuten en desinfecteren van het oppervlak met 70% ethanol voorafgaand aan gebruik. Bovendien steriliseren alle dissectie instrumenten, waaronder fijne dissectie instrumenten en Sylgard beklede schalen voor embryo dissectie via autoclaaf of door onderdompeling in 70% ethanol gedurende ten minste 20 minuten voor gebruik. Giet 70% ethanol en laat de gerechten en instrumenten aan de lucht drogen op een schone laminaire stroming clean bench voor gebruik.
   2. Bereid steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) / (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur) (HEPES) mengsel door toevoeging van 10% van 10x HBSS en 0,5% HEPES en de pH op ongeveer 7,2 en filter steriliseren eindoplossing en bewaar bij 4 ° C. Voeren alle dissecties in gekoeld HBSS / HEPES oplossing voor het weefsel tijdens de gehele procedure beter te bewaren.
   3. Coat glazen bodem gerechten met basaalmembraan matrix door toevoeging van 5 ml koude (4 ° C) steriele Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 300 ul aliquot van basaalmembraan matrix in een steriele 15 ml polypropyleen buis. Meng door vortexen inhoud en voeg 150 ul van de basaalmembraan matrix-DMEM mengsel aan het midden van elke kweekschaal, dat voordien de gehele kweekputje aanwezig in het midden van de schaal. Dek de gerechten en op te slaan in een 37 ° C incubator voor ten minste 45 minuten vóór gebruik.
   4. Giet 4-5 ml gekoeld HBSS in three steriele polystyreen petrischalen en laat sloot in de kap.
   5. Bereid kweekmedium in een steriele 15 ml polypropyleen buis door toevoeging van 9 ml DMEM, 100 pl N2 supplementen, 10 g / ml Cipro en 1 ml FBS.
2. Isolatie van embryo:
   OPMERKING: In deze procedure voor het kweken van cochleaire explants uit embryonale muizen, oogst innerlijke oren uit embryonale dag (E) 13 rotsbeenderen met de dag na de bevruchting wordt beschouwd als E1 ^9. Het protocol kan ook gebruikt worden met embryonale muis binnenoren beginnen vanaf E12 tot E18.
   1. Euthanaseren een getimede-zwangere muis met CO ₂ en offeren van dieren door cervicale dislocatie of passend goedgekeurde protocollen. Voeren euthanization weg van laminaire stroming weefselkweek kap om de steriliteit in de weefselkweek kamer te behouden.
   2. Plaats geëuthanaseerd muis op papier handdoek met de buik naar boven en desinfecteren buik met 70% ethanol.
   3. Open de buikholte door grijpen huidmet gebogen tang met één hand en gesneden opperhuid en de spieren langs de middellijn met een schaar met behulp van een andere hand. Maak twee loodrecht snijdt aan beide zijden en trek de baarmoeder voorzichtig door het optillen van bilaterale baarmoederhoorns met een pincet en maak het van onderaf bindweefsel met een schaar.
   4. Plaats de embryonale ketting in een petrischaaltje met gekoelde dissectie oplossing (HBSS / HEPES mengsel) en transfer naar het laminaire stroming schone werkbank.
   5. Verwijder embryo voorzichtig uit placenta en plaats ze in een van de steriele platen met dissectie oplossing. Als de oplossing blijkt bloedige, verhuizen ze naar een nieuwe petrischaal.
      LET OP: Op dit punt, kan embryo's worden opgevoerd met behulp van een Theiler enscenering gids.
   6. Onthoofden embryo door knijpen in de nek met een paar schone tang of schaar en plaats de kop in een verse petrischaal met gekoelde dissectie oplossing.
3. Dissectie van de innerlijke oren:
   1. Plaats one embryo hoofd in een steriele Sylgard schotel met koud dissectie
   2. oplossing. Werken onder een dissectie microscoop bij een vergroting van ~ 1,6X, immobiliseren het embryo hoofd door het plaatsen Minutien kunnen rond of dichterbij oog (Figuur 1A).
   3. Met behulp van twee paren van een steriel pincet voorzichtig de huid te verwijderen en het openstellen van de schedel op de dorsale zijde over de middellijn (Figuur 1B). Verwijder hersenen uit schedelholte en innerlijke oren zich binnen rotsbeenderen kunnen worden geïdentificeerd in dit stadium (figuur 1C, D). De voering van het bloedvat, dat gewoonlijk aanwezig rond het binnenoor kan worden gebruikt als een landmark voor het identificeren van het binnenoor in dit stadium (figuur 1D).
   4. Prepareer het binnenoor van de temporale bot door het plaatsen van de tang onder het weefsel en isoleren van het binnenoor van de basis van de schedel en overbrengen in een nieuw schaaltje met koud ontleden oplossing (Figuur 1E, F).

2. Generatie van het Orgaan van Corti explantkweken

Opmerking: In dit stadium van ontwikkeling, het weefsel kraakbeen en kan gemakkelijk worden ontleed met behulp van een tang.

1. Orient het binnenoor, zodat ventrale zijde naar boven is gericht (Figuur 2A) en het stabiliseren van het binnenoor door voorzichtig het plaatsen van de scherpe einde van Minutien pinnen via het evenwichtsorgaan gedeelte van het binnenoor (Figuur 2B).
2. Met behulp van ultrafijne tang opengesneden de bovenliggende kraakbeen door het maken van een incisie met behulp van het ene uiteinde van een tang in de buurt van het ovale venster en verwijder voorzichtig het kraakbeen van het slakkenhuis (figuur 2C).
   Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat forceps niet te diep worden ingebracht in het kraakbeen bovenliggende kraakbeen soms versmolten met de cochleaire kanaal waarbij het nuttig gesloten tang om kraakbeen los van de onderliggende cochleaire kanaal door schrapen onder de sppervlakte van het kraakbeen. In dit stadium van ontwikkeling, de cochleaire spiraal slechts driekwart omwenteling lengte.
3. Vervolgens blootstellen het sensorische epitheel door het plaatsen van de tang op het gewenste gebied van de cochleaire kanaal, ofwel de base of op zijn apex en zachtjes te trekken uit het dak van de cochlea (figuur 2D).
   OPMERKING: Het dak van het slakkenhuis moet volledig worden geschrapt omdat zij de zintuiglijke epitheel de analyse belemmeren kan maskeren.
   Opmerking: Deze procedure moet voorzichtig worden uitgevoerd zoals het is gemakkelijk om de sensorische epitheel scheuren.
4. Als laatste stap, verwijder voorzichtig het onderliggende bindweefsel van de blootgestelde sensorische epitheel, zodat de basis van de cochleaire explant is over het algemeen vlak.
5. Isoleer de ontleed slakkenhuis van het vestibulair gedeelte van het binnenoor behulp van een tang. Dit kan worden uitgevoerd voor of na stap 2.4 (figuur 2E).
6. Breng de ontleed cochleair zintuiglijke epitheel in een kelder membrane-matrix gecoate cultuur goed met behulp van een 1,5 mm steriele scooper (figuur 2F).
7. Plaats de cochleaire explantatie de luminale oppervlak van het epitheel naar boven en zuig de basaalmembraan matrix-DMEM oplossing zorgvuldig plat het weefsel en vervangen door 150 ul vers kweekmedium door voorzichtig toevoegen van de schotel. Men dient ervoor te zorgen dat elk explantaat goed hecht aan de beklede glazen dekglaasje en niet drijvend in het kweekmedium. Zorg ervoor dat de punt van de tang wordt gewezen terwijl aandient door op het glas goed te voorkomen dat schade aan het cochleair explant.
8. Zacht overdracht de kweekschaal in een steriele 150 mm kweekschaal en in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende de gewenste tijdsperiode, gewoonlijk 3-6 dagen in vitro (DIV). Na 1 DIV, onderzoekt de culturen onder een dissectiemicroscoop om ervoor te zorgen dat het cochleair explant goed heeft gehandeld op grond van de cultuur schotel.
9. Na incubation in vitro gewenste tijdsduur worden de kweken verwerkt voor immunohistochemie.
   OPMERKING: De explantkweken meestal geïncubeerd 6 DIV dat gelijkwaardig is aan ontwikkelingsfase, P0. Na incubatie in vitro kweken kunnen worden verwerkt voor toepassingen later als immunohistochemie (Figuur 3B), RT-PCR, in situ hybridisatie en / of Western blot.

3. elektroporatie gemedieerde genoverdracht

1. Instellen voor elektroporatie:
   1. Steriliseren een 100 mm Sylgard gecoate glazen schaal autoclaaf of onderdompelen in 70% ethanol gedurende 20 minuten en laat aan de lucht drogen op een schone werkbank voor gebruik.
   2. Bereid DNA van een expressievector keuze met behulp van geschikte maxi- of midi-prep kits. De expressie vectoren die in dit protocol zijn pIRES2-Atoh1.EGFP en pCLIG-NeuroD1.EGFP. De eindconcentratie van DNA moet ten minste 1 ug / ul in steriele DNA /RNase-vrij water.
2. Electroporating DNA in embryonale cochleaire explants:
   1. Voeg 10 ul van plasmide-DNA-oplossing een nieuwe 100 mm Sylgard gecoate schaal en breng een volledig ontleed cochleair explantaat (verkregen uit stap 2.5) in de DNA-oplossing.
   2. Met luminale oppervlak van het epitheel naar boven kantelen van de cochlea licht zodat het loodrecht op het vlak van de schaal.
   3. Elektrode schoepen aan beide zijden van de cochlea met negatieve peddel (kathode) naar de sensorische epitheel en de positieve peddel (anode) aangrenzend aan de basis van de cochlea.
      OPMERKING: Aangezien DNA negatief geladen, migreert van negatief naar positief elektrode en door het plaatsen van de kathode uiteinde van de sonde naast het sensorische epitheel; het DNA zal vooral gaan door het oppervlak van het sensorische epitheel.
   4. Met behulp van electroporator, leveren 9 tot 10 pulsen van 24 mV, 30 msec pulsduur met het voetpedaal schakelaar op tHij electroporator en voeg 100 pl warm kweekmedium de geëlektroporeerd slakkenhuis.
   5. Herhaal de stappen 3.2.1-4 voor alle cochleair explants en voor DNA van alle genen van belang en de overdracht van de geëlectroporeerd cochleae in het basaal membraan-matrix gecoate schotel voor plating (stap 2.7). Cultuur alle geëlektroporeerd cochleae in een 37 ° C, 5% _CO2 bevochtigde incubator voor de gewenste tijdsduur die vervolgens worden verwerkt voor immunocytochemie.
      OPMERKING: Het slakkenhuis van een hele nest van CD1 muis (ongeveer 8-12 pups) kunnen worden geïsoleerd, gemicrodissecteerde, geëlectroporeerd en vergulde in <4 uur.

4. Analyse van Cochlear explantkweken

OPMERKING: De kweken worden gewoonlijk gedurende 6 DIV dat gelijkwaardig is aan ontwikkelingsfase, P0. Na incubatie in vitro, worden de kweken gefixeerd en verwerkt voor immunocytochemie.

1. Na de gewenste lengte van incubation verwijderen kweekmedium en snel spoel de cochleaire explantaat in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en geïncubeerd in 4% paraformaldehyde (bereid in PBS) gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
2. Was het fixeermiddel door toevoeging van PBS en spoelen met PBS driemaal gedurende 15 min.
3. Permeabilize met PBS-T (PBS + 0,5% Tween) gedurende 30 minuten voor het blokkeren met PBS-T met 10% geit serum.
4. Incubeer in primaire antilichaam oplossing die primair antilichaam in PBS-T met 1% geit serum overnacht bij 4 ° C.
5. Was de cochlea driemaal bij kamertemperatuur met PBS-T 15 minuten elk voor het toevoegen van geschikte Alexa-geconjugeerde secundaire antilichamen.
6. Sinds het cochleair explant is gekweekt op glazen dekglaasje kan individueel worden behandeld door het isoleren van het dekglaasje van de schotel en montage op een dia. Dit kan worden bereikt door het weken de kweekschaal in OS30 oplosmiddel gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Met behulp van de steriele scheermesje, los het dekglaasje van het dish en monteren op een glijbaan en visualiseren onder een tl-microscoop.

Resultaten

We beschrijven een methode om cochlea te isoleren van embryonale binnenoren en micro-dissectie uit te voeren om het sensorische epitheel bloot te leggen. Eenmaal gedissecteerd, kan het worden geplaatst en gekweekt als een intacte cochleaire duct (Figuur 3) en geanalyseerd door immunohistochemistry. De gekweekte cochleaire explantaten bieden een nuttige assay om het effect van verschillende oplosbare factoren en farmacologische geneesmiddelen op de cochleaire ontwikkeling te onderzoeken. Na de dissectie v...

Discussie

Alle cellen in het membraneuze labyrint van de muis binnenoor zoals zintuiglijke, nonsensory en de spiraal ganglion neuronen zijn alle afgeleid van placodally afgeleide otocyst gelegen naast de achterhersenen van het ectoderm, rond E8 ^10-14. Op E11, het ventrale gebied van de otocyst uitstrekt tot de cochleaire ductus en als ontwikkeling gaat, een groep van epitheelcellen in de cochlea, en in andere gebieden van de otocyst, worden gespecificeerd als prosensory pleisters die vervolgens tot geeft verschillende ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco’s Modified Medium	Gibco	12430-054
Fetaal bovien serum	Gibco	10082
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Ciprofloxacin hydrochloride	Cellgro	61-277-RF
Glas schaal 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Glas schaal 100 mm	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-15
Dumont #5 tang	Fine Science Tools	11251-10
Pulsgenerator	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Kweekschalen met glazen bodem	MatTek	P35G-0-10-C
Matrigel matrix	BD Biosciences	356237
Kweekschaal, 60 x 15 mm	Becton Dickinson	353037
Weefsel kweekschalen	Greiner Bio-one	639160
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Conische buizen, 15 ml	Greiner Bio-one	188261
Myosine 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Myosine 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200