Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

Samenvatting

In vitro analyse van klasse-switch recombinatie bij muizen is uitdagend vanwege cytofiele IgE-moleculen die gebonden zijn aan Fc-receptoren op het oppervlak van B-cellen. We beschrijven een methode voor IgE-detectie door middel van trypsine-gemedieerde splitsing van oppervlakte-gebonden IgE vóór fixatie en permeabilisatie voor cytoplasmatische fluorescentiekleuring.

Samenvatting

B lymfocyten immunoglobuline zware keten (IgH) klasse switch recombinatie (CSR) is een werkwijze waarbij aanvankelijk uitgedrukt IgM schakelaars andere IgH isotypen, zoals IgA, IgE en IgG. Meting van IgH CSR in vitro is een belangrijke werkwijze voor de studie van een aantal biologische processen gaande van DNA recombinatie en herstel aspecten van moleculaire en cellulaire immunologie. In vitro CSR bepaling omvat de flowcytometrische meetoppervlak Ig expressie op geactiveerde B-cellen. Hoewel meting van IgA en IgG subklassen is eenvoudig, meting van IgE deze werkwijze problematisch vanwege oplosbaar IgE binding aan FceRII / CD23 op het oppervlak van geactiveerde B-cellen. Hier beschrijven wij een unieke procedure voor nauwkeurige meting van IgE-producerende muizen B-cellen die CSR hebben ondergaan in kweek. De methode is gebaseerd op trypsine gemedieerde klieving van IgE-CD23 complexen aan celoppervlakken, waardoor detectie van IgE-producerende B afkomstcellen door cytoplasmic kleuring. Deze procedure biedt een handige oplossing voor flowcytometrische analyse van MVO aan IgE.

Inleiding

Tijdens de zware keten van immunoglobuline (IgH-) klasse switch recombinatie (MVO) in muizen en mensen, de IgH- μ constant gebied exons (Cp) worden geschrapt en vervangen door een van de verschillende sets van downstream constant gebied exons (C _H s) (bijv Cv, Ce en Ca), resulterend in een omschakeling van de productie van IgM tot de productie van andere Ig klassen (bijvoorbeeld IgG, IgE of IgA). MVO plaatsvindt binnen schakelaar (S) regio's, die 1-10 kb sequenties 5 'om elke set van C _H s ¹ zijn. De Activation-Induced cytidinedeaminase (AID) enzym initieert MVO via cytidine deaminering activiteit.

IgE is een belangrijke mediator van allergische aandoeningen ² en een beter begrip van hoe IgE wordt geproduceerd en gereguleerd kan deuren openen naar nieuwe therapeutische benaderingen van atopische aandoeningen. Bij muizen en mensen, IgE is het meest strak gereguleerd Ig isotype. IgE wordt normaal gedetecteerd in gehalten duizenden times minder dan andere IgH isotypen ^3, maar kan sterk worden verhoogd bij ziektetoestanden ^4. Echter, CSR IgE is onvolledig begrepen. In vitro activatie van B-cellen met IL-4 in combinatie met ofwel anti-CD40 of LPS induceert CSR zowel IgG1 en IgE ^5. Geactiveerde B-cellen brengen de lage affiniteit IgE-receptor FceRII / CD23 ^2,6, die bindt oplosbaar IgE uitgescheiden in de cultuur na MVO. Dus bij de analyse met flowcytometrie, B cellen met receptor gebonden IgE vlek dezelfde cellen endogeen tot expressie IgE ^7b. Hoewel bekend is dat de muis B-cellen brengen lage affiniteit IgG FcγRIIB1 receptor (CD32) ^8, in onze ervaring blijkt niet te interfereren met de meting van klasse omschakeling naar IgG1. Echter, bij het meten van IgE omschakelen bij B-celactivering in kweek, niet-specifieke oppervlakte-IgE kan de analyse belemmeren. Gemeenschappelijke kleuringen, niet-IgE tot expressie brengende cellen te kleuren positief voor IgE.

Hier geschetst is een strategie die is gebruikt voor CSR assays true-IgE tot expressie B-cellen voeren en sporen van muizen ^9-11. Behandeling van geactiveerde B-cellen met trypsine, een gemeenschappelijk laboratorium reagens om eiwitten te verteren, verwijdert zowel cytophylic en membraangebonden oppervlak IgE. Na permeabilisatie en kleuring voor cytoplasmatische IgE onthult dus de ware IgE-producerende cellen.

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten hier beschreven waren in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen en door Animal Research Children's Hospital (BOOG), Boston, Mass goedgekeurd.

1. Bereiding van reagentia

1. 1000x IL-4 Stock: Verdun IL-4 cytokine tot 20 ug / ml in _H2O en 0,1% runderserumalbumine (BSA). Verdeel in 200 ul aliquots van 1,5 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -20 ° C.
2. 1000x anti-CD40: verkrijgen van de fabrikant bij 1,0 mg / ml, bewaar bij 4 ° C.
3. B-cel stimulatie media: Aan 425 ml van RPMI-1640 medium, voeg 75 ml vers ontdooide foetaal kalfsserum (FCS), 10 ml 1,0 M HEPES-buffer, 5 ml L-glutamine stock, 5 ml penicilline: streptomycine stock, 5 ml Minimum Essential Medium Niet-essentiële aminozuren (MEM-NEAA), en 3,5 pl 2-mercaptoethanol. Blijf media bij 4 ° C gedurende maximaal een week. Voeg IL-4 (20 ng / ml) en anti-CD40 (1,0 ug / ml) onmiddellijk voor gebruikalleen de hoeveelheid dragers die.
4. 2% FCS-FACS buffer: Voeg 10 ml FCS tot 490 ml 1x PBS. Bewaren bij 4 ° C.
5. 2x trypsine-EDTA-oplossing Verdun 5 ml van 10x trypsine-EDTA voorraadoplossing (5,0 g trypsine, 2,0 g EDTA per liter) in 20 ml 1X PBS. WINKEL trypsine-EDTA in 2x werken porties bij 4 ° C. Laat opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
6. Foetaal kalf serum: Bewaar ontdooide FCS bij 4 ° C voor maximaal twee weken. Plaats op ijs 15 min voordat de cytoplasmakleuring procedure.
7. Neutraal gebufferde formaline: Bereid een 10% formaline-oplossing (3,7% paraformaldehyde). Formaline is giftig en dus omgaan onder een laboratorium zuurkast tijdens het dragen van de juiste PBM. WINKEL formaline bij kamertemperatuur in een chemisch opslagkast.
8. Methanol: Store absolute methanol (100%) bij -20 ° C tot de cellen zijn klaar om te worden gepermeabiliseerde. Merk op dat methanol is brandbaar en moet worden bewaard in een geschikte vriezer.

2.Zuivering en activering van B-cellen

1. Vanuit vers geoogste muis milt, bereiden een celsuspensie door het orgaan druk voorzichtig door een 70 um cel zeef met de plunjer van een injectiespuit 3 ml. In een 15 ml conische centrifugebuis verzamelen cellen in 10 ml 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
2. Decanteer het supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml rode bloedcel lysisbuffer gedurende 5 min. Neutraliseer met 13.5 ml 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
3. (Optioneel) magnetisch gescheiden van de B-cellen met anti-CD45R (B220) -gemerkt korrels, na het MACS zuiveringsprotocol volgens de instructies van de fabrikant.
4. Stimuleer gezuiverde B-cellen bij 1,0 x 10 ⁶ cellen / ml in B-cel stimulatie verwarmd medium dat IL-4 (20 ng / ml) en anti-CD40 (1,0 ug / ml) gedurende 5 dagen bij 37 ° C. Begin met 8 ml van de cultuur verdeeld in 2 putjes van een 6-well cultuur plaat (4 per ml).
5. Controleer cultuopnieuw dagelijks bij 1,0 x 10 ⁶ cellen / ml te handhaven. Stel de concentratie splitsen in andere putten en verdunnen van de kweek met B-cel stimulatie medium dat vers IL-4 en anti-CD40.

3. trypsinisatie, Fixatie en Permeabilisatie

1. Trypsinisatie
   1. Verzamel tot 1,0 x 10 ⁷ van gekweekte cellen in een 15 ml conische buis, centrifuge bij 300 xg gedurende 5 minuten en decanteer het supernatant.
   2. Was met 10 ml PBS om de resterende eiwit uit de cel collectie media te verwijderen. Herhaal het centrifugeren stap en decanteer de bovenstaande vloeistof.
   3. Resuspendeer de celpellet in het restvolume na decanteren (ongeveer 100 ui).
   4. Voeg voorzichtig 800 pi kamertemperatuur 0,1% (2x) trypsine-EDTA op de cellen. Verdeel deze vervolgens in een hoek van 45 ° langs de zijkant van de conische buis.
   5. Sluit de buis en meng voorzichtig door het kantelen van de buis zodat de vloeistof langs de lengte van de buis 6/5 tijds. Een vezelig, witte neerslag kan ontstaan ​​in de oplossing. Beperk de trypsine tijd om onder een min.
   6. Blus de trypsine reactie met 1 ml koude FCS. Verdun de FCS onmiddellijk door 10 ml koude PBS.
   7. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, decanteer de bovenstaande vloeistof en breng de buizen ijs.
2. Bevestiging
   1. Resuspendeer de cellen in het restvolume na decanteren. Eventueel meenemen volume tot 100 ul met koude PBS.
   2. In een zuurkast, voeg 800 ul van 10% neutraal gebufferde formaline oplossing voor de cellen en pipet op en neer. De buis verwarmen na toevoeging van formaline. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min.
3. Permeabilisatie
   1. Het opzetten van een tafelmodel vortex-mixer op een zacht schudden snelheid.
   2. Trek 9 ml koude (-20 ° C) methanol in 10 ml serologische pipet.
   3. Houd de buis met de cellen over de vortexmenger en voorzichtig beginnen ShakinG de cellen.
   4. Voeg koude methanol aan de buis zodanig valt druppelsgewijs op de cellen terwijl de buis nog schudden zodat de methanol continu mengen. Na de eerste 2 ml methanol de afgifte snelheid kan worden verhoogd tot een langzame stroom.
   5. Laat de buis zitten op ijs gedurende 30 minuten aan de permeabilisatie voltooien. Als alternatief kunnen de cellen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maximaal een maand.

4. Fluorescentie kleuring voor IgG1 en IgE Class Switching

1. Centrifuge monster bij 300 xg gedurende 5 minuten en giet de methanol oplossing. Een witte neerslag kan pellet met de cellen.
2. Voeg 10 ml kamertemperatuur 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten om de cellen te wassen. Herhaal een keer. Opmerking: Het wassen van de pellet met kamertemperatuur PBS lost extra neerslag die na stap 4.1 kan vormen.
3. Voer een aanvullend wassen met 10 ml van 2% FCS-FACS buffer.
4. Verdeel monsters naar een 96 putjes ronde bodemplaaten centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Decanteer supernatant en zet de plaat op het ijs.
5. Vlekken in 60 pl 2% FCS-FACS buffer per putje met de volgende verdunningen antilichaam: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100 Anti CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
6. Na 5 min kleuring was de plaat met 150 ul van 2% FCS-FACS buffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
7. Resuspendeer in 400 ul van 2% FCS-FACS buffer en pipet door een 40 pm nylon celzeef in een 5 ml FACS buis.

5. Gebruik de volgende Gating Strategie:

1. Isoleer CD45R (B220) positieve cellen van de stralen lymfocyt populatie op de FSC / SSC grafiek (Figuur 1).
2. Uit de B220 positieve cellen, gebruik maken van de IgE en IgG1 perceel aan de desbetreffende populaties te onthullen.

Resultaten

Deze procedure is met succes toegepast om CSR studeren om IgE in muizen B-cellen. Om de efficiëntie te tonen meten CSR, we gestimuleerde muis milt B-cellen met anti-CD40 en IL-4, zoals eerder ¹¹ beschreven. Na vijf dagen stimulering werden de cellen verzameld en verwerkt volgens de hierboven beschreven en gekleurd met fluorescent gelabelde IgM, IgG1, IgE, en B220 (CD45R) antilichamen protocol. Gated op de stralen lymfocyten (figuur 1), een duidelijke populatie van IgE + cellen niet netjes wor...

Discussie

Stimulatie van de muis milt B-cellen in cultuur met anti-CD40 en IL-4 zal simuleren T helper type 2 (T _H 2) interacties, bemoedigende klasse omschakeling naar IgG1 en IgE ^5. B-cellen kunnen worden geactiveerd voor CSR in met de totale splenocyten ¹² of gezuiverde milt B-cellen ^11. Zoals in het protocol (stap 2.3), B-cel verrijking is optioneel en is ter beoordeling van de onderzoeker als het zou gunstig bepalen. Positieve magnetische scheiding van B-cellen met CD45R (B220) -ge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-Mouse IgE FITC	BD Pharmingen	553415	clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	clone A85-1
Methanol	BDH	BDH1135-4LP	Bewaar bij -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40	eBioscience	16-0402-85	clone HM40-3
RPMI Medium 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Phosphate Buffered Saline (10x)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS purification column	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Reconstitueer in water of 0,1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	5,0 g Trypsine, 2,0 g EDTA•4 Na per Liter van 0,9% NaCl
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100 ml	10.000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x)
L-Glutamine 200 mM	Sigma Aldrich	G7513
2-mercaptoethanol (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100 ml
Red cell lysis buffer	Sigma Aldrich	R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum	Thermo	SH30910.03
B cell Stimulation media			B cell stimulatie media bestaat uit RPMI met foetaal kalfsserum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutamine, Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml) en anti-CD40 (1 µg/ml)