Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52267

⸱

29 januari 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, Università degli Studi di Milano, 2San Raffaele Scientific Institute and Vita-Salute University, 3CEND Center of Excellence in Neurodegenerative Diseases, Università degli Studi di Milano

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

Samenvatting

Synaptische blaasjes los neurotransmitters bij chemische synapsen door middel van een dynamische cyclus van fusie en ophalen. Monitoring synaptische activiteit in real time en het ontleden van de verschillende stappen van exo-endocytose bij de enkele vesicle niveau cruciaal voor het begrijpen synaptische functies in gezondheid en ziekte.

Genetisch gecodeerde pH-gevoelige sondes direct gericht aan synaptische blaasjes en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) zorgen voor de ruimtelijke resolutie nodig is om blaasje dynamiek volgen. Het oneindig kleine veld door totale interne reflectie alleen prikkelen fluoroforen in een dunne laag (<150 nm) boven de glasplaat waarop cellen hechten, waar de processen van exo-endocytose plaatsvinden. De resulterende beelden met hoog contrast zijn bij uitstek geschikt voor het bijhouden van blaasjes en kwantitatieve analyse van fusie-evenementen.

In dit protocol, SH-SY5Y menselijke neuroblastoma cellen worden voorgesteld als een waardevol model voor het bestuderen van neurotransmitter afgifte bij de enkele-vesikel niveau TIRFM vanwege hun platte oppervlak en de aanwezigheid van gedispergeerde vesicles. De methoden voor het kweken SH-SY5Y als hechtende cellen en het transfecteren hen synapto-pHluorin voorzien, alsook de techniek om TIRFM en beeldvorming uitvoeren. Tenslotte wordt een strategie voor selecteren, tellen en analyseren fusiegebeurtenissen in whole-cell en single-vesikel niveaus gepresenteerd.

Om de beeldvorming procedure en de data-analyse benadering te valideren, zijn de dynamiek van pHluorin-tagged blaasjes geanalyseerd onder rust en gestimuleerd (depolariserende kalium concentraties) voorwaarden. Membraandepolarisatie verhoogt de frequentie van fusie evenementen en veroorzaakt een parallelle verhoging van de netto fluorescentie signaal opgenomen in hele cel. Single-blaasje analyse blijkt modificaties van fusie-event gedrag (verhoogde piek hoogte en breedte). Deze gegevens suggereren thop kalium depolarisatie niet alleen leidt tot een massale afgifte van neurotransmitters, maar wijzigt ook het mechanisme van de vesikel fusie en recycling.

Met de juiste fluorescente probe, kan deze techniek worden toegepast in verschillende cellulaire systemen om de mechanismen van constitutieve en gestimuleerde secretie ontleden.

Inleiding

Chemische synaptische transmissie tussen neuronen is een belangrijk mechanisme van communicatie in het zenuwstelsel. Zij beroept zich op de afgifte van neurotransmitters door middel van een dynamische cyclus van vesikel fusie en de afhaling aan het presynaptische website. Veel van de betrokken blaasje dynamiek eiwitten zijn geïdentificeerd; Hun specifieke bijdrage aan het verschijnsel nog worden opgehelderd 1.

Ons begrip wordt gedeeltelijk beperkt door het feit dat de meest gebruikte testen voor exo / endocytose niet altijd de meest geschikte. Verschillende studies met betrekking tot de vesikel fusie en dynamiek vertrouwen op elektrofysiologische technieken. Deze techniek biedt een optimale temporele resolutie en is uitstekend voor het onderzoeken van de initiële fusie van blaasjes naar de plasmamembraan maar kan veel van de onderliggende moleculaire gebeurtenissen die presynaptische functie ondersteunen detecteren. Elektronenmicroscopie, aan de andere kant biedt de beste morphological beschrijving van elke afzonderlijke stap, maar het dynamische aspect van het evenement kan niet worden gevangen, want monsters moeten worden vastgesteld om te worden geanalyseerd.

De komst van nieuwe optische opnametechniek 2,3, in combinatie met de vooruitgang in de moleculaire fluorescente probes ontwikkeling 6/4, zodat de visualisatie van exocytose processen in levende cellen, waardoor nieuwe niveaus van informatie over de synaptische structuur en functie.

De eerste studies uitgebuit activiteit-afhankelijke styrylkleurstoffen (FM1-43 en aanverwante organische kleurstoffen) 7,8. State-of-the-art beeldvormende technieken gebruiken pH-gevoelige varianten van de Green Fluorescent Protein (GFP) (pHluorin) vastgebonden aan luminale blaasjes eiwitten 9. Deze probes worden gewoonlijk uitgeschakeld wanneer aanwezig in de blaasjes vanwege de lage luminale pH. Na fusie met de plasmamembraan, is het blaasje inwendige blootgesteld aan de neutrale extracellulaire ruimte, de pH abrupt verhoogt, ontlast de proton-afhankelijke blussen van pHluorin en de tl-signaal snel verschijnt. Aangezien de verandering in pHluorin sneller is dan de samensmelting door het volgen fluorescentie verhoogd, kan blaasje fusie met het membraan worden gemeten en geanalyseerd. Omdat oppervlakte-pHluorin gemerkte moleculen worden endocytosed, het fluorescentiesignaal vervolgens terug naar het basale niveau, dus dezelfde construct kan ook worden gebruikt om vesicle recycling 9 volgen.

Terwijl de vesicle gelabeld pH-sensor zorgt voor het visualiseren alleen die vesicles die echt fuseren met de plasmamembraan, is beeldvorming in hoge ruimtelijke en temporele resolutie vereist beschrijven in detail de stappen van het exo / endocytische processen. De optische techniek die de nodige ruimtelijke resolutie biedt, is de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), een toepassing van fluorescentie microscopie 10.

"> Totale interne reflectie optreedt aan het grensvlak tussen de glazen afdekking slip en het monster. Wanneer het lichtpad het glazen deksel slip met een invalshoek groter dan de kritische hoek bereikt, wordt het excitatielicht niet uitgezonden in het monster maar volledig teruggekaatst. Onder deze omstandigheden is een uitdovende lichtgolf vormen op het grensvlak en propageert in het medium met minder optische dichtheid (monster). Omdat de intensiteit van het verdwijnende veld exponentieel af met de afstand van de interface (met een penetratiediepte van ongeveer 100 nm) in de fluoroforen in dichtste nabijheid van de cover-slip kan worden opgewekt terwijl die verder van de begrenzing niet. In cellen getransfecteerd met GFP-constructen, die diepte overeenkomt met eiwitten aanwezig op het plasmamembraan of vesiculaire structuren benaderen. Zoals fluoroforen in de cel interieur niet kan worden opgewekt, wordt de achtergrond fluorescentie geminimaliseerd, en een beeld met een zeer hoge signaal / achtergrond ratio wordt gevormd 11.

Verschillende kenmerken maken TIRFM de techniek van keuze voor het bewaken van blaasjes dynamiek. De perfecte contrast en hoge signaal-ruisverhouding kan de detectie van zeer lage signalen afkomstig van één blaasjes. -Chip gebaseerde beeld acquisitie in elk frame biedt de temporele resolutie die nodig zijn om zeer dynamische processen op te sporen. Ten slotte is de minimale blootstelling van cellen aan het licht op een ander vliegtuig in de steekproef vermindert sterk fototoxiciteit en maakt langdurige time-lapse-opname 12.

Data-analyse blijft de meest uitdagende en cruciaal aspect van deze techniek. De eenvoudigste manier om vesikel fusie monitoren is de accumulatie van reporter fluorescente eiwitten op het celoppervlak meten gedurende 13. Als fusie toeneemt, netto fluorescentie signaal stijgt ook. Echter, deze werkwijze het proces onderschatten, vooral in grote cellen en in rusttoestand,omdat endocytose en fotobleking processen compenseren de toename van de fluorescentie-intensiteit als gevolg van blaasje exocytose. Een alternatieve methode is om elk afzonderlijk samensmelting 14 volgen. Deze laatste methode is zeer gevoelig en kan belangrijke informatie over het fusie mechanismen onthullen. Het vereist echter de handmatige selectie van enkele gebeurtenissen, want volledig geautomatiseerde procedures om blaasjes te volgen en de fluctuatie van hun fluorescerende signalen registreert zijn niet altijd beschikbaar. Observatie van vesicle dynamica vereist bemonstering cellen bij hoge frequentie. Dit genereert een grote hoeveelheid gegevens die nauwelijks handmatig kan worden geanalyseerd.

Het voorstel van dit artikel is het TIRFM beeldvormingstechniek optimaliseren voor bewaking van de basale en gestimuleerde neurotransmitters in de SH-5YSY neuroblastoma cellijn, en beschrijven, stap voor stap een werkwijze ontwikkeld in het laboratorium te analyseren, zowel in whole-cell en single-vesikel levels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cel cultuur en transfectie

  1. SH-SY5Y celcultuur
    OPMERKING: De experimenten zijn uitgevoerd met het menselijke neuroblastoma SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y cellen groeien als een mengsel van zwevende clusters en hechtende cellen. Volg de instructies vermeld in het protocol (celdichtheid, splitsverhouding, enz.) Om cellen die groeien stevig aan glazen afdekplaat, wat cruciaal is voor TIRFM hebben.
    1. Voordat u begint, onder de laminaire stroming bioveiligheid kast, maken het opportuun volume van steriele fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en kweekmedium.
      1. Voeg 50 ml PBS met concentraties van 150 mM NaCl, 24 mM fosfaatbuffer, pH 7,4. Filtreer de oplossing.
      2. Voeg 50 ml celmedium uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met hoog glucose, 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), L-glutamine ( 2 mM), ennatrium pyruvaat (1 mM). Filtreer de oplossing.
    2. Verwijder compleet groeimedium en was de cellen met 3 ml PBS.
    3. Incubeer de cellen met 2 ml 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (6 cm petrischaal) gedurende 5 min bij 37 ° C, 5% CO2 en los cellen gebruiken pipet.
    4. Trypsine te inactiveren door toevoeging van 2 ml DMEM en cellen te verzamelen door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min.
    5. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml DMEM de pellet en pipet de oplossing op en neer voldoende om cellen te dispergeren in een enkele celsuspensie.
    6. Splitsen 1: 4 in een nieuwe 6 cm diameter petrischaal met 3 ml compleet medium. Handhaaf cellen in kweek in 6 cm diameter Petrischalen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Subcultuur keer per week of wanneer zij onder 80-90% van het oppervlak.
  2. SH-SY5Y cel plating voor beeldvorming
    1. Voor TIRFM experimenten, plaatcellen op glas covers. Employ glas bedekt met 0,17 ± 0,005 mm dikte en een 1,5255 ± 0,00015 brekingsindex. Voordat u begint, bereiden de dekglaasjes als volgt:
      1. Schoon glas bedekt met 90% ethanol, O / N.
      2. Spoel ze grondig in gedestilleerd water (drie veranderingen van gedestilleerd water). Droog glas covers in een droogoven.
      3. Plaats covers in glazen Petrischalen steriliseren in een voorverwarmde oven bij 200 ° C gedurende 3 uur.
    2. De dag voor transfectie, leg elke dekglaasje in een 3,5 cm petrischaal, voeg 1 ml kweekmedium en incuberen bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator.
    3. Trypsinize cellen zoals beschreven in de stappen 1.1.3 - 1.1.5, schorten de cel pellet in 1 ml compleet medium en te tellen. Bereken de juiste hoeveelheid celsuspensie aan elke petrischaal te geven 3 x 10 5 cellen / putje. Deze dichtheid is vereist voor optimale celgroei en efficiënte transfectie. Incubeer bij 37 ° Cin een 5% CO2 incubator O / N.
  3. SH-SY5Ytransfection van polyethyleenimine (PEI)
    OPMERKING: Om synaptische blaasjes dynamiek zichtbaar te maken, heeft pCB6 vector die synapto-pHluorin gebruikt. De synapto-pHluorin is verkregen door in-frame fusie van een pH-gevoelige variant van het groen fluorescent proteïne (GFP) 16 en de vesiculaire membraaneiwit synaptobrevine 2. Het construct is uitgebreid toegepast om synaptische vesikel eigenschappen binnen neuronen 9 onderzoeken.
    1. Voordat u begint met transfectie, maken 10 ml van de volgende oplossingen. Houd de oplossingen maximale als 1 maand.
      1. Voeg 150 mM NaCl-oplossing. Op pH 5,5 met 0,01 N HCl.
      2. Wordt PEI oplossing van 10% polyethyleenimine (PEI; 25 kDa lineair) in 150 mM NaCl-oplossing. De pH van de oplossing stijgt tot 8,8. Stel de pH tot 7,8 met 0,01 N HCl.
    2. 24 uur na plating, verwijder het medium en verfrissen met 1,5 mlvolledig medium. Houd de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
    3. Onder de laminaire stroming bioveiligheid kast, in een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 3 ug plasmide DNA 25 gl 150 mM NaCl-oplossing en 100 pl PEI oplossing per 3,5 cm Petrischaal.
    4. Vortex gedurende 10 seconden, vervolgens incubeer de DNA / PEI mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Voeg voorzichtig de DNA / PEI mengsel aan de petrischaal met dekglaasjes met cellen en schud om verdeel eveneens het reagens in de petrischaal.
    6. Na 4 uur verandert het medium en incubeer de cellen O / N bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Voeren imaging experimenten 24 - 48 uur na transfectie.

2. Cell Imaging door totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

  1. Imaging set-up
    1. Voeren TIRF beeldvorming met de set-up in figuur 1 beschreven. Het bestaat uit een gemotoriseerde omgekeerdemicroscoop (Figuur 1, bijvoegsel A), de laserbron (figuur 1, bijvoegsel B) en TIRF-schuif (figuur 1, bijvoegsel C). Bereik TIRFM verlichting door middel van een hoge numerieke apertuur (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X olie, immersie objectief.
    2. Voor TIRFM verlichting, maken gebruik van een multi-line (458/488/514 nm) 100 mW argon-ion laser. Met behulp van een mono-mode fiber, introduceren de lineair gepolariseerd laserlicht in de straal weg, via de TIRF slider. Steek de TIRF slider in de lichtgevende velddiafragma vlak van het gereflecteerde licht stralengang.
      1. Voor brede veld verlichting, sluit de microscoop met een conventionele kwik korte booglamp HBO wit licht. A-polarisatie behoud dubbel prisma in de slider zorgt voor de gelijktijdige combinatie van TIRF verlichting en wit licht.
    3. Filtreer het laserlicht met een excitatie filter (bandbreedte 488/10 nm) gemonteerd op een filterwiel, ingebracht in de laser pad. Diensteen hoge snelheid, de software wordt bestuurd, sluitertijd om snelle controle van de laser verlichting mogelijk te maken. Voor pHluorin analyse, mount een band voorbij 525/50 nm emissie filter. Vastleggen van digitale beelden (512 x 512 pixels) op een gekoelde Fast CCD camera met de Image ProPlus software.
  2. Het bereiken van TIRF verlichting (figuur 2)
    1. Zet de lasers, de computer, de camera, de filter wiel, en de sluiter controllers; dan, wacht 20 min voor aanvang van het experiment als de lasers nodig om op te warmen en te stabiliseren.
    2. Voor de beeldvorming, maakt het opportuun volume van de volgende oplossingen.
      1. Voeg 50 ml Krebs (KRH) oplossing bij 125 mM NaCl, 5 mM KCI, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2PO 4, 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) (gebufferd pH 7.4), 2 mM CaCl2, en 6 mM glucose.
      2. Voeg 10 ml KCl-KRH oplossing (pH 7,4) 80 mM NaCl, 50 mM KCI, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2PO 4, 25 mM HEPES (gebufferd tot pH 7,4), 2 mM CaCl2, en 6 mM glucose.
    3. Verwijder het glazen deksel met getransfecteerde cellen en plaats deze in de juiste beeldvorming kamer. Monteer de kamer en voeg 500 pl KRH oplossing in het midden van het glas.
    4. Olie toe te voegen over de doelstelling. Plaats de beeldvorming kamer op het podium van de microscoop en plaats de doelstelling van de glazen dekglaasje. Plaats de veilige afdekking over het monster.
    5. In epifluorescentie modus, richten zich op het dekglaasje (bovenkant) en kies getransfecteerde cellen geplaatst in de kamer centrum. Selecteer de cellen waarvan het fluorescerende signaal kan duidelijk worden geregistreerd met behulp van een belichtingstijd onder de 80 msec.
    6. Onder software controle, schakelen naar TIRF verlichting in de live-modus.
    7. Om de TIRF configuratie in te stellen, moet u de stand van de bundel dat naar voren komt uit het doel, op het monster deksel (Figuur 2B). Wanneer de balk in het midden van tHij objectieflens (Figuur 2A, links), een vlek zichtbaar in het midden van de TIRF monster deksel (figuur 2B, links) en de cel wordt afgebeeld in epifluorescentie (meerdere nadruk vlakken, hoge achtergrond fluorescentie Figuur 2C, links) .
    8. Om de kritische hoek bereikt, bewegen de gefocusseerde vlek in de Y-richting (voorwaarts of achterwaarts Figuur 2B, midden) met de hoek instelschroef op de TIRF slider (figuur 1C). Wanneer de straal convergeert op het monstervlak een hoek groter dan de kritische hoek (Figuur 2A, rechts), de vlek verdwijnt en een rechte, dunne, geconcentreerd lijn blijkt in het midden van het monster deksel (Figuur 2B, rechts).
    9. Te fine-tunen van de TIRF hoek gebruiken de cel monster (figuur 2C). Let beeld de fluorescentie op de video, in dit stadium een ​​beeld epifluorescentie-achtige nog zichtbaar. Zachtjes, bewegen de schroef totdat TIRF convoorwaarde wordt gerealiseerd: één optisch vlak van de cel in focus (dwz de plasmamembraan in contact met de cover-slip), resulteert dit in een vlak beeld met hoog contrast (Figuur 2C, rechts).
  3. Monster beeldvorming
    1. Stel de single-channel time-lapse experiment. Om photobleaching minimaliseren, vastleggen van de afbeelding met behulp van lage blootstelling tijd en high gain. Juiste belichting zijn tussen 40-80 msec. Acquire beelden op 1-2 Hz sampling frequentie. Blaasje kinetiek kan beter gewaardeerd bemonstering op een hogere frequentie (10 Hz) zijn. De reguliere speeltijd van observatie is meestal 2 min.
    2. Voeg 500 ul van KRH oplossing en opnemen cellen in TIRFM modus. Dit is de rusttoestand. Sla de tijd opeenvolgende beelden.
    3. Focus op dezelfde cel en opnemen onder dezelfde voorwaarden van het rusten (laservermogen, tijdopname, framenummer). Na vijf frames, voeg 500 ul van KCl-KRH oplossing en houden KCl in de kamer.Dit is de gestimuleerde toestand; bespaart de tijd opeenvolgende beelden.

3. beeldanalyse en gegevensverwerking

OPMERKING: Om beelden te analyseren, zijn macro's ontwikkeld in het lab, op basis van bestaande functies van de beeldanalyse software; vergelijkbaar macro's zijn online beschikbaar (URL in Tabel van materialen en apparatuur).

  1. Fluorescentie-intensiteit kwantificering
    1. Gebruik een "Sequence fluorescentie-intensiteit" macro op fluorescentie-intensiteit kwantificering in een gebied van belang (ROI) van het beeld, in de loop van de film.
    2. Open de time-opeenvolgende beelden. Ga naar de macro-menu en selecteer 'Sequence fluorescentie-intensiteit'. In het venster 'Analysis' verschijnt 'selecteer de ROI ".
    3. Kies een van de selectie in het menu om de ROI te creëren. Plaats 3 ROI's in de regio's van de celmembraan zonder vlekken (achtergrond ROI). Employ this "achtergrond ROI" om het fotobleken evalueren en de drempel voor samensmelting analyse (Figuur 3A) ingesteld.
  2. Photobleaching correctie en drempel bepalen (Figuur 3B)
    1. Om de photobleaching evalueren, opent de fluorescentie-intensiteit rijen "achtergrond ROI", (figuur 3Ba). Normaliseren van de fluorescentie-intensiteit waarden in elk frame het eerste intensiteitswaarde (F0) (F / F0) (figuur 3BB). Het gemiddelde van de waarden.
    2. Markeer de gemiddelde data en maak een lijn plot met behulp van de grafiek menuopties.
    3. Uit de data-analyse menu, selecteer "trendlijn" om het dialoogvenster plotanalyse openen. Selecteer het type regressie. Stel "exponentieel" regressie. Selecteer vervolgens "scherm vergelijking op chart". In het grafiekvenster verschijnt de exponentiële vergelijking en de parameterwaarden automatisch toegewezen (figuur 3BC ).
    4. Breng de exponentiële correctie van de intensiteitswaarden van elk frame als volgt:
      Fn (gecorrigeerd) = Fn / exp (-n * a)
      Fn = experimentele fluorescentie-intensiteit gemeten bij frame van n; n = aantal frames; a = bleken factor (constante uiting van de snelheid van de intensiteit van het verlies te wijten aan photobleaching;   Figuur 3BD).
    5. Om de drempel te stellen, opent u een genormaliseerde en gecorrigeerd "achtergrond ROI", berekent de gemiddelde fluorescentie-signaal en de standaarddeviatie (SD). De gemiddelde waarde plus 3 SD vertegenwoordigt de drempel (Figuur 3BE). Gebruik deze drempel voor data-analyse.
  3. Selectie van fusie gebeurtenissen met behulp van een semi-automatische procedure
    1. Open de tijdvolgordelijke beelden met software voor beeldanalyse. Breng een Gauss-filter om de actieve sequentie van beelden.
    2. Analyseren van beelden met behulp van de functie "te tellen voorwerpen" of een macro die de selectie mogelijk maaktvan een object waarvan de pixels hebben de gemiddelde fluorescentie-intensiteit binnen een bepaald bereik. Stel de intensiteit bereik handmatig, met behulp van de drempel functie (ga naar de bar menu, bedoelde maatregel → drempel om het gebied van belang te benadrukken). Een adequate drempel is 30% meer dan de lokale fluorescerende achtergrond signaal.
    3. Breng een macro "Filters objecten" om alleen objecten die voldoen aan de volgende criteria:
      1. Solliciteer reeksen optie (min en max inclusief) voor het aspect. Aspect meldt de verhouding tussen de lange as en de korte as van de ellips gelijk aan het object. Aspect is altijd ≥1. Adequate waarden min = 1, max = 3.
      2. Solliciteer bereiken voor diameter. Diameter meldt de gemiddelde lengte van de diameters gemeten bij twee graden tussenpozen verbinden twee holle punten die door het zwaartepunt van het object. Stel het bereik in pixels (of micrometer, bij gebruik van een gekalibreerd systeem).
      3. Het optimale bereik in prelimin definiërenAry experimenten: selecteer handmatig de vlekken van de rente en meet vervolgens de diameter met behulp van het perceel profiel functie.
    4. Selecteer "scherm objecten": geselecteerde objecten verschijnen bovenop de TIRFM afbeelding (Figuur 4B).
    5. Neem in de analyse alleen die plekken die een korte (1-3 frames) tonen voorbijgaande toename in fluorescentie-intensiteit, onmiddellijk gevolgd door een duidelijk verlies van signaal (voorbijgaande spots). Maken gebruik van de cirkelvormige selectie naar een ROI ongeveer een spotdiameter radiaal te creëren rond de geselecteerde blaasje / plekjes (experimentele ROI). Voer deze stap handmatig.
    6. Met de ROI gekozen Bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elke ROI in de loop van de film.
  4. Gegevensanalyse (Figuur 3C-D)
    1. Het tijdsverloop van de fluorescentie gemeten veranderingen in elke "experimentele ROI" naar een spreadsheet exporteren; (Figuur 3DA). Normaliseren van de intensiteitswaarde in elk frame het eerste fluorescentie-intensiteit (F / F0), (figuur 3Db).
    2. Breng de exponentiële correctie van de intensiteitswaarden in elk frame zoals vermeld in stap 3.2.4 (figuur 3Dc).
    3. Om het totale aantal fusiegebeurtenissen (piekaantal), de tijd elke fusie plaatsvindt (piekbreedte) en de amplitude van fluorescerende piek (piekhoogte en AUC) bereken toepassing logische functies met spreadsheet of wiskunde pakketten. Een voorbeeld van samensmelting analyse met logische formules wordt weergegeven in figuur 3dd en 3de.
    4. Stel dat de toename van de fluorescentie-intensiteit boven de drempel (gemiddelde achtergrond fluorescentie-intensiteit ± 3SD) als vesikel fusie met de plasmamembraan en de resulterende piek als samensmelting.
    5. Bereken de breedte als verschil tussen de laatste en de eerste x-waarde van elke piek. Vermenigvuldig deze waarde voor 1 / (bemonsteringsfrequentie). Beschouw dit de waarde van eenis de tijd van de vesikel fusie en de hechting aan het plasmamembraan vóór blaasje re-verzuring en recycling (figuur 3DD).
    6. Bereken de hele cellen AUC als een som van waarden overschrijdt drempel. Beschouw deze waarde als netto fluorescerende verandering tijdens de opname tijd als gevolg van de spontane (rust) of opgeroepen (gestimuleerd) synaptische activiteit.
    7. Bereken de piekhoogte als het verschil tussen de maximale y-waarde van elke piek en de drempel. Beschouw deze waarde als een indicatie van de fusie soort (single vs. simultane / sequentiële fusie of voorbijgaande versus volledige fusie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De TIRF beeldvorming en data-analyse procedures beschreven zijn ontworpen om blaasjes dynamiek in cellulaire systemen te bestuderen. Deze techniek kan worden gebruikt om de effecten van signaalmoleculen en drugs op fusiegebeurtenissen en neurotransmitter blaasje dynamiek 17 bepalen. Met behulp van GFP-tag plasmamembraan eiwitten, heeft de TIRFM analyse werd gebruikt om de constitutieve mensenhandel van GFP-gelabeld glutamaat transporters in gliacellen en epitheelcellen 18,19 karakteriseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze paper wordt een protocol om imago en blaasjes dynamiek analyseren afscheidende cellen, met behulp van fluorescentie-cDNA gecodeerde vectoren en TIRFM. Belangrijke elementen van succesvolle beeldvorming door TIRFM zijn de selectie van de cellulaire model en celtransfectie met genetisch gecodeerde optische indicatoren van blaasje vrijkomen en recycling.

TIRFM is bij uitstek geschikt voor groeiende cellen aanhanger van een glazen deksel en voldoende vlak om een ​​stabiele visualisatie v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag aan de Università degli Studi di Milano erkennen voor steun aan Eliana Di Cairano (post-doctorale beurs) en Stefania Moretti (Ph.D. fellowship). Dit werk werd ondersteund door de Universiteit Research Program PUR naar CP

We willen graag Prof. Jeremy M. Henley, School van Biochemie, Universiteit van Bristol, Verenigd Koninkrijk, bedanken voor de pHluorin bouwen en Dr. Dotti Francesco voor hulp bij data-analyse, en Silvia Marsicano voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
Axio Observer Z1figure-materials-1 Zeiss491912-9850-000inverted microscoop
Multiline Argon Laser Lasos 77figure-materials-2 Lasos00000-1312-752multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser
Laser TIRF-sliderfigure-materials-3 Zeiss423681-9901-000
100X Objectieffigure-materials-4 Zeiss421190-9900-000Olie, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD-camera RetigaSRV Fast 1394figure-materials-5 QImaging
LAMBDA 10-3 optische filterwisselaar met SmartShutterfigure-materials-6 Sutter Instrument Company
Software
Image ProPlus 6.3 Softwarefigure-materials-7 Media Cyberneticsselectie van spots, selectie van ROI, bepaling van fluorescentie-intensiteit
Excelfigure-materials-8 Microsoftcorrectie voor fotobleken, gehele cel- en enkelvoudige vesikelanalyses
GraphPad Prism 4.00figure-materials-9 GraphPad Software, Inc.statistische analyse

Referenties

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  3. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
  6. Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
  7. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
  8. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  12. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  13. Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  14. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
  15. Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
  16. Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
  17. Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
  18. D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
  19. Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
  20. Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758(2014).
  21. Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
  22. Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
  23. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
  24. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Totaalinterne reflectie fluorescentiemicroscopieSynapto-pHluorin transfectieVesikelfusieanalyseKwantificering van fluorescentie-intensiteitTracking van enkelvoudige vesikelsKaliumdepolarisatiestimulatie
TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.