Met deze studie, introduceren we een gestandaardiseerde spanning model voor de geïsoleerde superfused runderen netvlies voor toekomstige preklinische therapeutische testen. Het effect van beide hypoxie (zuiver N2) of glutamaat stress (250 uM glutamaat) op retinale vertegenwoordigd door de a- en b-wave amplitudes geëvalueerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Glutamaat en hypoxie als Stress Model voor de geïsoleerde perfusie gewervelde Retina
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neuroprotectie heeft een sterk veld van onderzoek geweest oftalmologisch onderzoek in de laatste decennia en beïnvloedt ziekten zoals glaucoom, retinale vasculaire occlusie, netvliesloslating, en diabetische retinopathie. Het was het doel van deze studie een gestandaardiseerd stressmodel stellen voor toekomstige preklinische therapeutische testen.
Bovine netvliezen werden bereid en geperfuseerd met zuurstof verzadigde standaardoplossing en de ERG opgenomen. Na het opnemen van stabiele B-golven, hypoxie (zuiver N2) of glutamaat stress (250 pm glutamaat) werd uitgeoefend gedurende 45 min. Om de effecten op fotoreceptor alleen functie onderzoeken, werd 1 mM aspartaat toegevoegd aan een golven te verkrijgen. ERG-herstel werd gecontroleerd op 75 min.
Voor hypoxie, een afname in een golf amplitude van 87.0% werd waargenomen (p <0,01) na een blootstelling van 45 min (daling van 36,5% na afloop van de washout p = 0.03). Bovendien, een eerste decrgemak in B-wave amplitudes van 87,23% vastgesteld, dat statistische significantie bereikt (p <0.01, afname van 25,5% aan het eind van de washout, p = 0,03).
250 urn glutamaat, een eerste 7,8% reductie van a-wave amplitudes (p> 0,05), gevolgd door een reductie van 1,9% (p> 0,05). Een vermindering van 83,7% van B-wave amplitudes (p <0,01) werd opgemerkt; na een wash-out van 75 min de daling was 2,3% (p = 0,62). In deze studie wordt een gestandaardiseerd stressmodel voorgesteld die nuttig eventuele neuroprotectieve effecten in de toekomst te identificeren zijn.
Inleiding
Neuroprotectie heeft een sterk veld van onderzoek in oogheelkundige onderzoek in de afgelopen decennia. Het netvlies is een zeer gevoelige neuronaal netwerk die significant afhankelijk oxygenatie en wordt sterk beïnvloed door het metabolisme van de omringende cellen. Bekende oculaire aandoeningen gerelateerd aan zenuwcelbeschadiging retinale vasculaire occlusies, glaucoom, netvliesloslating.
Retinale arterie occlusie, als voorbeeld voor retinale vasculaire occlusie, leidt tot een plotseling verlies van zicht door hypoxie van de binnenste retina 1. Het wordt vaak geassocieerd met algemene vasculaire pathologieën 2 en leidt tot een blijvende gezichtsverlies 1, met slechts 8% van de patiënten herstellen gezichtsscherpte significant 1. Hoewel arteriële fibrinolyse is gesuggereerd als een behandeling optie, kon het voordeel niet worden aangetoond in een gerandomiseerde klinische trial 3.
Glaucoom en netvliesloslatingbeide een toename glutamaatconcentratie 4-6. Glutamaat onder fysiologische omstandigheden wordt aangetroffen als een prikkelende zender gedurende het gehele centrale zenuwstelsel en de binnenste retina 7,8. Verhoogde glutamaat niveaus zijn niet alleen in glaucoom en netvliesloslating 5,6 maar ook in proliferatieve diabetische retinopathie 9. Een toename van glutamaat eventueel leidt tot excitotoxiciteit en derhalve zenuwcelbeschadiging 10. In de meeste gevallen van netvliesloslating en in sommige gevallen van proliferatieve diabetische retinopathie operatie aan de retina (pars plana vitrectomie) noodzakelijk. Tijdens pars plana vitrectomie mechanische manipulatie, heldere licht van de optische vezel of shear stress die wordt uitgeoefend door hoge stroomsnelheden van irrigatie-oplossingen tijdens lange operaties oefenen een extra belasting op het netvlies 11,12.
Alle genoemde ziekten hebben gemeen dat de pathologie is gelokaliseerd in het Retineen alleen en vormen de oogheelkundige gemeenschap met de uitdaging om manieren om het netvlies te beschermen als een neurosensory systeem te vinden.
De electroretinogram (ERG) is de standaard methode voor de beoordeling van de in vivo fotoreceptor functie (a-golf) en de functie van de binnenste retina (b-golf). De ERG wordt gemeten door zilver-elektroden ingebracht in de cornea en de ogen worden gestimuleerd door een toenemend lichtniveau defecten in staafjes en kegeltjes of in de binnenste retina detecteren. Verschillende defecten in het netvlies kan worden gedetecteerd door veranderingen in de amplitude (de sterkte van de respons) of de latentie (de response-interval doorlooptijd) van de ERG. Verschillende ERG protocol en meetmethoden (patroon-ERG, multifocale-ERG of helder veld ERG) laten een verdere differentiatie van de gebreken. De techniek van het geïsoleerde netvlies is recentelijk geïntroduceerd, waardoor effecten op het netvlies zonder storingen door bijvoorbeeld een studie dier evaluerenalgemene reacties 13,14.
Het was het doel van deze studie te evalueren en een gedefinieerd en gestandaardiseerd stress-model en hypoxie en glutamaat spanning op de superfused geïsoleerde netvlies. Zo hopen we de fundamenten voor toekomstige studies over neuroprotectieve effecten van bepaalde stoffen of intra-oculaire irrigatie oplossingen leggen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van Bovine Eyes
- Verkrijgen runderen ogen direct nadat het dier wordt geslacht.
- Vervoer de beschermde ogen "Sickel oplossing" speciaal medium met 120 mM NaCl, 2 mM KCI, 0,1 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2, 1,5 mM NaH 2PO 4, 13,5 mM Na 2 HPO 4 en 5 mM glucose bij RT.
- Voer de voorbereiding van het netvlies onder donkere omstandigheden aangepast met een zwak rood licht.
- Verwijder het voorste deel van het oog. Voer een equatoriale incisie ca. 4 mm achter de limbus. Daarna verwijdert hoornvlies, de iris, het corpus ciliare en de lens uit één stuk. Houd het netvlies in Sickel-oplossing.
- Mechanisch los het glasvocht bijlagen aan de retinale oppervlak en verwijder het glasvocht van het open oog beker.
- Daarna verdelen het oog in vier kwadranten en punch-out ronde gebieden van ca. 7 mm diameter met een trephine.
- Voorzichtig te scheiden van het netvliesvan het pigment epitheel en plaats deze op een opname-apparaat in een doos beschermd tegen licht. Het opnameapparaat omvat een plastic beheerder met mazen in het midden; Plaats het netvlies van het gaas en bevestig met een plastic ring direct aan de elektroden.
OPMERKING: De plastic handhaver heeft twee kanalen om een constante stroom van het medium mogelijk te maken.
2. Opname van de electroretinogram (ERG)
- Om de electroretinogram opnemen, gebruikt twee zilver / zilver chloride-elektroden aan weerszijden van het netvlies en perfuseren het netvlies een constante perfusie snelheid van ca. 1 ml / min en een constante temperatuur van 37 ° C. Gebruik de "Sickel-oplossing" verzadigd met zuurstof.
- Vóór het begin van de meting, donker het netvlies (bescherming tegen licht tijdens alle metingen) aanpassen en gebruiken stimulus interval van vijf minuten. Gebruik een 1 Hz enkele witte xenon-flitser voor stimulatie met een intensiteit ingesteld op 6,3 MLX op het netvlies oppervlak.
- Gebruik gekalibreerd grijsfilters en een lichte stimulans van 10 usee gecontroleerd door een timer om een optimale respons te hebben.
- Te meten en de data te verwerken, filteren de ERG en versterken het (100 Hz high-pass filter, 50 Hz notch filter, 100.000 x versterking) met behulp van een Grass RPS312RM versterker. Probeer om te filteren op mogelijke storende frequenties die het signaal kunnen verstoren. Om de gegevens te verwerken, een analoge naar digitale data acquisitie board op een desktop computer (PC compatible).
- Na de aanpassing aan het donker periode constant perfusie, meet de amplitudes van de elektrische signaal tot stabiele B-wave amplitudes worden geregistreerd.
OPMERKING: Amplitudes worden als stabiel beschouwd als vijf afzonderlijke metingen te bereiken een gemiddelde waarde en wijken minder dan 10%. Een goed voorbeeld van afzonderlijke metingen wordt gegeven in figuur 1. - Om de test te starten, vervangen zuivere zuurstof ofwel zuivere stikstof (aantal afzonderlijke experimenten, n = 5) om te testen op hypoxieof 250 urn glutamaat (n = 5).
- Noteer de elektrische responsen elke 5 min gedurende 45 min.
- Na de testperiode, perfuse de netvliezen met standaard medium verzadigd met zuurstof voor 75 min en kijk naar de veranderingen van de b-golf amplitude. Dit is de wash-out fase. Meet de B-wave amplitude van de trog van een golf naar de top van de B-golf.
- Om het effect van hypoxie of glutamaat op de fotoreceptor potentiële onder scotopic condities te bestuderen, onderdrukken de B-golf door toevoeging van 1 mM tot de voedingsoplossing.
- Na het opnemen van een stabiele fotoreceptor potentieel voor 30 min, voert de procedure als hiervoor, waardoor de retina 45 min de verschillende oplossingen voor irrigatie met 1 mM aspartaat. Gebruik dezelfde wash-out periode (stap 2.8) zoals eerder vermeld.
3. Data Analysis
- Om de gegevens statistisch geëvalueerd, garanderen een normale verdeling voor alle data, bijvoorbeeld met de Kolmogorov-Smirnov-test 15.
- Bereken de verlaging van de a- en b-wave amplitudes in procenten na blootstelling fase ten opzichte van de laatste meting voor het handboek. Vergelijk de verlaging van de ERG-amplituden na 45 min - na afloop van de expositie periode - naar ERG gemeten vóór toepassing.
- Vergelijk de a- en b- golf aan het eind van de washout fase naar de corresponderende amplitude vóór blootstelling aan een eventueel herstel onderzoeken.
- Voor statistische analyse, gebruik maken van de software JMP statistische software of SPSS-software. Bereken data gedurende het gemiddelde ± standaardafwijking. Schatten betekenis door de juiste statistische toets.
Opmerking: Deze tests verschillend kan zijn afhankelijk van de experimentele scope. In deze instelling, gebruik maken van de Student's gepaarde t-test.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na 1 uur perfusie van de retinale preparaten met zuurstof verzadigde oplossing (Figuur 1A en B) ERG-amplitudes vertoonden stabilisatie en minder variatie van de amplitudes tussen afzonderlijke metingen. pH, osmotische druk, temperatuur en pO 2 (behalve hypoxie tests) werden voor alle tests constant gehouden.
De fotoreceptor signaal uit het signaal van de binnenste retina isoleren, werd 1 mM aspartaat toegevoegd aan de standaardoplossing om de B-wave (figuur 1A)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie werd een significant effect op de B-golf amplitude na 45 minuten van hypoxie werd gevonden. Deze daling was nog steeds significant na de wash-out fase. Een soortgelijk effect op de fotoreceptor effecten konden worden waargenomen.
De resultaten worden ondersteund door andere gepubliceerde gegevens 16 en geven ons de mogelijkheid om eventuele neuroprotectieve effecten na hypoxie bestuderen.
Na 45 min uiteenzetting van 250 uM glutamaat, von...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit artikel is opgedragen aan mijn geliefde vrouw Maren en onze kleine Karl.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Duitsland | 1.064.041.000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Duitsland | 1.050.010.250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Duitsland | 58.330.250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Duitsland | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Duitsland | 1.065.860.500 | |
| 5 mM glucose | Merck Pharma, Duitsland | 40.741.000 |
Referenties
- Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
- Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. Hypertension-related eye disorders). Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).
- Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
- Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
- Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
- Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
- Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
- Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
- Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
- Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
- Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
- Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
- Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
- Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
- Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
- Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
- Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
- Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
