Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Samenvatting

Hier maken we een glazen pipette met twee functies: remming van diepe hersenstructuren door micro-injecties van geneesmiddelen en real-time monitoring van hun effecten door gelijktijdige elektrofysiologische opnames.

Samenvatting

Hier beschrijven we een werkwijze voor de constructie van een eenmalig gebruik "injectrode" met behulp van commercieel toegankelijk en betaalbaar parts. Een indringende systeem ontwikkeld dat het mogelijk maakt voor de injectie van een geneesmiddel bij het opnemen elektrofysiologische signalen van de getroffen neuronale populatie. Deze werkwijze is eenvoudig en economisch alternatief voor commerciële oplossingen. Een glazen pipet werd gemodificeerd door het te combineren met een injectienaald en een zilveren filament. De injectrode wordt aan commerciële micro-pomp voor drug delivery bevestigd. Dit resulteert in een techniek die real-time farmacodynamiek feedback verschaft door middel van multi-unit extracellulaire signalen afkomstig van de plaats van geneesmiddelafgifte. Als een proof of concept, namen we de neuronale activiteit van de superieure colliculus uitgelokt door lichtflitsen bij ratten, gelijktijdig met de levering van geneesmiddelen door de injectrode. De injectrode opnamecapaciteit maakt de functionele karakterisering van de injectie website ten gunste van nauwkeurige controle over de lokalisatie van drug delivery. De toepassing van deze werkwijze zich ook veel verder gaat dan hier getoond, de keuze van de chemische stof in het injectrode geladen is groot, onder tracering merkers voor anatomische experimenten.

Inleiding

De inactivatie van corticale gebieden en subcorticale kernen van belang bij de studie van functionele relaties tussen verschillende hersenstructuren ^2-4. Recente literatuur loss-of-function chemische of cryogene technieken toegepast om de rol van hersenstructuren ^2,5 bestuderen. Met betrekking tot farmacologische micro-injecties kunnen kleine hoeveelheden geneesmiddelen worden toegediend in een gebied van de hersenen met een geregelde snelheid tegelijk de bijkomende schade aan het omringende weefsel ^6,7. Deze techniek kan worden gebruikt om specifieke agonisten, inverse agonisten of antagonisten te leveren aan het effect van verschillende farmacologische doelwitten op neuronale -activiteit. Dergelijke effecten kunnen ook worden bestudeerd door het meten van veranderingen in neuronale reacties van verafgelegen plaatsen, waardoor onderzoekers om de relatie tussen verschillende corticale en subcorticale structuren bestuderen.

Hier tonen we het samenstel van een inrichting, het injectrode, staat both opnemen elektrofysiologische signalen en leveren geringe hoeveelheden geneesmiddelen op de doellocatie. We tonen de mogelijkheden van dit systeem door het injecteren GABA, een gemeenschappelijke remmer van neuronale activiteit in de rat superior colliculus. Deze regio is gevoelig voor visuele stimulatie, die ons toeliet om visueel opgeroepen multiunit activiteit gebruiken om injectrode lokalisatie bevestigen. De omkeerbaarheid van de inactivatie werd beoordeeld door het herstel van de normale neuronale activiteit na het einde van GABA injectie.

De bewakingsmogelijkheden meerdere eenheden activiteit van de injectieplaats maakt fijnafstemming van de injectiesnelheden en volumes nodig gewenste farmacodynamische respons. Daarom is een voordeel van deze techniek is het mogelijk beperking van de weefselbeschadiging veroorzaakt door microperfusion, aangezien de kleinste effectieve hoeveelheden geïnjecteerd. De voorgestelde protocol biedt een kostenefficiënte methode voor het genereren van de wegwerp hardware necessary voor het uitvoeren van experimenten waarbij geneesmiddelafgifte en lokale neuronale activiteit opname gewenst.

Protocol

LET OP: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad voor de Bescherming van Dieren en de ethische review board van de Université de Montréal.

1. Vergadering van de opname-injectie Pipette

1. Trek een ongeveer 7 cm lange glazen capillair (1 mm buitendiameter) met een pipet trekker.
2. Breek het topje van de capillaire en controleer de opening onder een lichtmicroscoop. Controleer of de inwendige diameter tussen 30 urn tot 40 urn.
3. Plaats een 7 cm lange zilveren draad in het glazen capillair met ongeveer 1 cm uitsteekt uit de niet-tapse uiteinde van de glazen pipet.
4. Buig de overtollige filament loodrecht op het glas capillair.
5. Breng een druppel van flexibele kunststof lijm op de as van een 30 G injectienaald.
6. Plaats een 30 G hypodermische naald in de glazen pipet volgens het schema in figuur 1 .
7. Voeg een tweede coating van lijm om een ​​goede afdichting van de verbinding tussen de glazen pipet en de injectienaald waarborgen.
8. Laat de pipet drogen met de punt naar boven gedurende ongeveer 12 uur tot goede uitharding van de lijm te garanderen. Het uiteindelijke resultaat wordt getoond in figuur 2.

Opmerking: Deze procedure wordt uitgevoerd op acute experimenten en sterilisatie van de pipetpunt is niet vereist.

2. Animal Voorbereiding

1. Plaats de rat in een anesthesie doos.
2. Veroorzaken anesthesie via 4% isofluraan gedurende 5-10 min.
3. Leg het dier op een stereotaxische tafel met verwarmingselement en rectale sonde naar een lichaamstemperatuur van 37 ° C te handhaven. Gebruik een neuskegel aan anesthesie met 2% isofluraan te behouden. Bevestig het hoofd van de rat met behulp van oor bars en tanden houder.
4. Breng oogzalf of oogdruppels, waarvan 1% Atropine daalt om te helpen bij pupilverwijding bevatten. Om uitdroging te vermijden, dien smeren druppelis ongeveer elke 30 minuten.
5. Scheer het hoofd en reinig deze met 10% povidonjood.
6. Voor plaatselijke verdoving, injecteer 0,5 ml van 2% lidocaïne onder de hoofdhuid 2-3 plaatsen verheffende de huid en de tip van de naald.
7. Bevestig adequaat niveau van anesthesie door het uitvoeren van een teen knijpen en het observeren van het gebrek aan beweging. Bovendien bewaken de hartslag zodat het binnen normale waarden (300 tot 400 slagen / min).
8. Incise de hoofdhuid in een rechte lijn langs het gemiddelde met een # 10 scalpel zowel de coronale en sagittale hechtingen bloot.
9. Onthul de Lambda en Bregma punten door op vernietiging van het weefsel dat bedekt de schedel met een chirurgische spatel.
10. Niveau de schedel, zodat Bregma en Lambda posities zijn op hetzelfde vlak.
11. Om het referentiepunt te stellen, gebruik dan een stereotaxische apparaat met een gemonteerde glazen buis in te stellen recht boven Bregma. Dit zal de "nul" voor de antero-posterior en medial-laterale metingen coördinaten.
12. Stel het punt van belang door het verplaatsen van de stereotaxisch monteren om de gewenste coördinaten, let op de stereotaxische coördinaten en trek een vierkant rond het doelgebied die markeert waar de craniotomie zal worden uitgevoerd.
13. Gebruik een chirurgische boor met een gesteriliseerde boor langs de gemarkeerde plein langzaam zonder druk om langzaam te verwijderen de botmateriaal. Wees voorzichtig te lang in hetzelfde gebied niet te boren, omdat warmte produceert en veroorzaken laesies op de cortex.
14. Wanneer het bot afgrenzing van de craniotomie voldoende dun is geworden, verwijder voorzichtig de craniale deel met een pincet om de cortex bloot.
15. Vaak irrigeren de blootgestelde cortex met kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel uitdroging te voorkomen.
    OPMERKING: Dura mater verwijderen behoeft de rat de punt van de injectrode stevig genoeg te dringen.

3. Vullen en Plaatsing van het injectiesysteem

1. Vul het5-10 ul injectiespuit door aspiratie met minerale olie.
2. Vul de injectienaald met de vaste glazen pipet met een oplossing van 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) en 300 uM γ-aminoboterzuur (GABA) of een oplossing van 2% lidocaïne met 0,5% CSB ^9. Verdun alle oplossingen met een zoutoplossing.
   1. Bij een overvloedige stof vullen met een gewone injectiespuit en met de gebruikelijke voorzorgsmaatregelen technieken om de vorming van luchtbellen te vermijden.
   2. Bij duurdere stoffen, gebruik van minerale olie aan de injectrode vullen en het chemische middel kan vervolgens door afzuigen worden ingevoerd. Aangezien het dichtheidsverschil tussen minerale olie en water relatief hoog, deze stof is een goede kandidaat voor het injecteren van waterige oplossingen.
      Opmerking: Een kleurstof kan worden toegevoegd om de scheiding tussen beide vloeistoffen te bevestigen.
3. Om de injectie pipet te vullen, vul een 1 ml spuit met de oplossing door aspiratie en dan langzaam injecteren van de oplossingin de injectiepipet.
4. Besteed zorgvuldige aandacht voor lekken in de regio's in figuur 1 aangegeven door zwabberen deze gebieden schoon en het observeren van lekkages door verdere injecteren van de oplossing langzaam met de spuit.
5. Verwijder de spuit 1 ml. Wanneer u dit doet, moet u lichte druk houden op de plunjer, zodat het vacuüm niet de oplossing van de injectie pipet verwijderen.
6. Vul de injectiespuit met minerale olie door aspiratie en bevestig deze stevig aan de gevulde injectie pipet, dan voorzichtig weg te vegen alle overtollige oplossing uit de verzamelde injectrode met gaas.
7. Controleer of de punt niet wordt geblokkeerd door injectie van een zeer klein volume, voldoende om een ​​druppeltje vormt aan het uiteinde van de glazen pipet zien.
8. Monteer de injectrode op de micropomp systeem en ervoor zorgen dat het goed is bevestigd.
9. Positie voorzichtig injectrode tip op het doel coördinaten en laat de punt aan het oppervlak van de cortex.
10. Langzaam de injectrode met de stereotaxische inrichting de beoogde structuur (superior colliculus in dit geval) met de juiste anatomische coördinaten.
11. Bedek de blootgestelde cortex met warme agar om weefsel uitdroging te voorkomen.

4. Injectie en omkeerbare inactivatie

1. Stel de micro-injectie pomp te injecteren 400 tot 800 nl 40 nl / min en druk op Uitvoeren om de injectie te starten. Merk op dat de piek tarief zal verminderen tijdens de injectie te tonen.
   Opmerking: In de experimentele opstelling, neurale activiteit herstelde binnen een uur na het einde van GABA levering. Elk gekalibreerd mechanische inrichting kan worden gebruikt om druk uit te oefenen op de micro-injectie spuit om de injectie te voeren.
2. Na de overname van de elektrofysiologische gegevens, euthanaseren met een door de lokale Animal Ethics Gemeenschap erkende methode.

Resultaten

De constructie van de injectrode is weergegeven in figuur 1. A silver wire (C) wordt toegevoerd aan een glazen pipet (D) met een gedeelte van de draad gebogen en buiten uitsteekt uit de opening. Een 30 G naald (B) is bevestigd en afgedicht aan de opening van de glazen pipet met lijm. Nadat de pipet werd gevuld met de substantie injectie, wordt een glazen micro injectiespuit (A) aan de naald. Het is belangrijk dat er een goede afdichting wanneer de micro injectiespuit verbindt met de naald (E) en waarbij...

Discussie

De voorgestelde protocol werd ontworpen om de uitdagingen als gevolg van de huidige omkeerbare inactivatie methoden op te lossen. Specifiek, dit project gericht op het verfijnen van de gebruikte chemische micro-injecties van stoffen moduleren neurale activiteit, vooral in diepe hersenstructuren methoden. Een technische uitdaging die uit dit type opstelling is dat beide probes wordt colocalized in dezelfde beperkte ruimte in vivo teneinde nauwkeurige opnames leiden op de injectieplaats. Dit probleem kan worden o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Injectiepomp (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Injectieconsole (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton-spuit	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	Spuiten tussen 5 en 10 μl gebruikt
Flexibele kunststoflijm	Lepage	393915	De gelvorm is gemakkelijker aan te brengen op de as van de 30 G hypodermische naald en vormt een waterdichte afdichting wanneer deze droog is.
Glazen pipetten	WPI	#TW100F-4	Dunne wand, 1 mm OD, 0.75 mm ID met filamentpijpen gebruikt
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Zilverdraad	A-M Systems, Inc.	782500	Naakt 0.010”