Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

19.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52281

⸱

22 januari 2015

 ,  ,  , 
1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

In dit artikel

Samenvatting

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Samenvatting

Giant Unilamellaire Vesicles (GUVs) zijn een populaire biomimetic voor het bestuderen membraan samenhangende verschijnselen. Echter, vaak gebruikte protocollen groeien GUVs, dient te GUVs houdende functionele transmembraan proteïnen worden gemodificeerd. Dit artikel beschrijft twee dehydratatie-rehydratatie methoden - electroformation en gel bijgestaan ​​zwelling - naar GUVs met de voltage-gated kalium kanaal, KvAP vormen. In beide werkwijzen wordt een oplossing van eiwithoudende unilamellaire vesicles gedeeltelijk gedehydrateerd om een ​​stapel membranen, die vervolgens wordt zwellen in een rehydratatie buffer te vormen. Voor de electroformation werkwijze wordt de film afgezet op platinaelektroden zodat een wisselveld in tijdens rehydratatie kunnen worden toegepast. Daarentegen gebruikt de gel ondersteunde zwelling werkwijze een agarosegel substraat film rehydratatie verbeteren. Beide methoden kunnen GUVs in lage (bijvoorbeeld 5 mM) en fysiologische (bv, 100 mM) zoutconcentraties produceren. De resulterende GUVs gekenmerkt door fluorescentie microscopie, en de functie van gereconstitueerde kanalen gemeten met de inside-out patch-clamp configuratie. Terwijl zwelling in aanwezigheid van een wisselend elektrisch veld (electroformation) geeft een hoge opbrengst van foutloze GUVs, produceert de gel ondersteunde zwelling werkwijze een homogeen eiwit verdeling en vereist geen speciale apparatuur.

Inleiding

Bij het ​​bestuderen van de fysische principes die levende systemen regeren, bottom-up aanpak kan een experimentator om systeem samenstelling en andere parameters die niet gemakkelijk worden gemanipuleerd in cel-gebaseerde systemen 1 beheersen. Bij membraan processen, Giant Unilamellaire Vesicles (GUVs, diameter ~ 1-100 um) hebben bewezen een zeer nuttige biomimetische systeem 2-7 als ze goed geschikt voor microscopie studies en micromanipulatie 8-10. Hoewel er veel verschillende protocollen om GUVs produceren, de meeste vallen in twee categorieën - emulsie gebaseerde benaderingen 11,12 en technieken gebaseerd op rehydrating een lipide film 13-16. In-emulsie gebaseerde methoden, worden de binnenste en buitenste blaadjes van de GUV membranen samengesteld sequentieel uit lipide monolagen aan water / olie-interfaces. Deze benadering is geschikt voor het inkapselen van oplosbare eiwitten metin de GUVs en voor het vormen GUVs asymmetrische bijsluiter lipidensamenstelling. Echter, GUVs gevormd uit emulsies sporen oplosmiddel dat het membraan de mechanische eigenschappen 17 wijzigen behouden, en de benadering is bijzonder goed geschikt voor trans- membraaneiwit reconstitutie.

Film rehydratatie werkwijzen gebaseerd op het feit dat (dehydratatie) veroorzaakt veel lipidemengsels een multilamellaire stapel membranen. Indien stapel vervolgens in contact gebracht met een waterige buffer, zal membranen in de stapel uit elkaar solventstromen tussen hen en aan het oppervlak van de stapel te verplaatsen, kunnen afzonderlijke membranen los te GUVs 13,18 (ook een ware dierentuin van vormen andere lipidische objecten). Zelfs voor optimale buffer en lipidesamenstellingen Deze klassieke "spontane zwelling" werkwijze een relatief lage opbrengst van foutvrije GUVs. Een veel gebruikte methode om de opbrengst van foutvrije GUVs boost is "electroformation221 ;, waarin een wisselstroom veld (AC) wordt toegepast tijdens folie rehydratatie. Hoewel het mechanisme blijft slecht begrepen, "electroformation" kan spectaculair GUV opbrengsten geven (> 90% in gunstige omstandigheden) voor lage zoutconcentratie buffers (<5 mM) 14,19, en kan zelfs werken in fysiologische buffers (-100 mM) met een hogere frequentie (500 Hz versus 10 Hz) wisselveld en platina elektroden 15. Een alternatieve benadering om de opbrengst van foutvrije GUVs boost "gel ondersteunde zwelling", waarbij de lipide oplossing afgezet op een polymeer gel substraat plaats van passief (bijvoorbeeld glas, PTFE) materialen in klassieke "spontane zwelling ". Wanneer de resulterende lipide / gel film wordt gerehydrateerd kan GUVs snel vormen zelfs fysiologische buffers 16,20.

Al deze methoden kunnen alleen lipide GUVs die kan worden gebruikt om membraangebonden fenomenen zoals de studie producereninteractie tussen oplosbare eiwitten en membranen. Echter, een transmembraan eiwit in GUVs nemen, zijn belangrijke wijzigingen nodig om te verzekeren dat het eiwit blijft in een functionele toestand gedurende de reconstitutie procedure. Hoewel oplossingen van lipiden in organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld chloroform, cyclohexaan) zijn ideaal voor de productie lipidefilms, trans-membraaneiwitten zijn meestal alleen stabiel wanneer hun hydrofobe transmembraan domein is ingebed in een lipide bilaag, of omgeven door een detergent micel ( bijvoorbeeld gedurende eiwitzuivering). Aldus, het uitgangsmateriaal voor reconstitutie typisch natief membranen, gezuiverd eiwit in een reinigingsmiddel of kleine unilamellaire proteïne bevattende vesicles (proteo-SUV's) en / of multilamellaire vesicles (proteo-MLVs) gevormd door detergensverwijdering in de aanwezigheid van lipiden. De meeste methoden om deze membraaneiwitten te nemen in GUVs vallen in drie categorieën.

Direct insertion: Trans-membraaneiwit gesuspendeerd in detergens gemengd met voorgevormde, lipide only, mild detergens gesolubiliseerde GUVs en het detergens verwijderd middels biobeads 21. Terwijl conceptueel eenvoudige Deze werkwijze vereist een nauwkeurige regeling van de detergens concentratie zoals te hoge detergensconcentratie de GUVs terwijl een te lage concentratie kan het eiwit ontvouwen of aggregaat kan oplossen.

GUV / Proteo-SUV Fusion: Eiwit in proteo-SUV's wordt gecombineerd met voorgevormde, lipide-only GUVs en fusie wordt vergemakkelijkt met speciale fusogene peptiden 22 of wasmiddel 21. Typisch de omvang van de fusie is beperkt leidt tot GUVs met een laag eiwit dichtheid.

Uitdroging / Rehydratatie: A-eiwit bevatten lipide film wordt gevormd door gedeeltelijke dehydratatie van een proteo-SUV (of proteo-MLV) oplossing en GUVs worden vervolgens gekweekt als voor een zuivere lipide film. De zichtbare uitdaging is om het eiwit te beschermen tijdens de gedeeltelijke dehydratiin stap 23, maar de werkwijze is met succes gebruikt om trans-membraaneiwitten zoals bacterio, calcium-ATPase, integrine en VDAC reconstitueren in GUVs 7,23 - 25.

Dit artikel beschrijft dehydratatie / rehydratie protocollen GUVs met het voltage-gated kalium kanaal, KvAP van de hyper-thermofiele archaea, Aeropyrum pernix maken. KvAP een hoge mate van homologie met eukaryote spanningsafhankelijke kaliumkanalen 26 en een bekende kristalstructuur 27 , waardoor het een goed model voor het bestuderen van het mechanisme van spanning gating. De productie van de proteo-SUV is eerder in detail beschreven en is geen onderdeel van deze tutorial 26,28,29. Belangrijk hoeft KvAP proteo-SUV niet te worden geproduceerd voor elke GUV bereiding, aangezien ze kunnen worden opgeslagen in kleine (bijvoorbeeld 10 pi) bij -80 ° C gedurende langere tijd (> 1 jaar). Electroformationof-gel ondersteunde zwelling kan vervolgens worden gebruikt om GUVs groeien van de KvAP proteo-SUV (of proteo-MLVs).

De belangrijkste stappen voor de electroformation protocol worden geïllustreerd in figuur 1. Druppeltjes van een oplossing van SUV die het eiwit wordt afgezet op platina draden (zie figuur 2). Gedeeltelijke dehydratatie van de SUV schorsing leidt tot de vorming van een lipide eiwit film door de fusie van SUV's. Tijdens rehydratatie wordt een wisselveld op de elektroden aan de lipide lagen helpen delamineren en vorm GUVs. Een veld 10 Hz werkt goed bij het ​​gebruik van "zoutarm" (<5 mM) rehydratatie buffer 28 en GUVs enkele uren duren om te groeien. In tegenstelling, fysiologische buffers (met ~ 100 mM zout) goed te werken met een lagere spanning, 500 Hz AC veld, maar vereisen een langdurige (~ 12 uur) zwelling periode 15. Deze methode is gebaseerd op een eerder protocol met ITO dia 24, maar gebruikt een aangepaste kamer containing twee platina draden, zoals weergegeven in figuur 2 (zie de bespreking voor details in het design en suggesties voor eenvoudigere, geïmproviseerde kamers).

Figuur 3 illustreert de gel ondersteunde zwelling methode. Het protocol werkt goed met buffers met fysiologisch zout concentraties, is een snelle en produceert GUVs met een meer homogene eiwit distributie. Echter, de opbrengst van geïsoleerde, blijkbaar defect-vrije GUVs (dat wil zeggen, de GUV membraan uniform is bij optische lengte-schalen en geen objecten omsluiten) is lager, maar het zorgt voor een voldoende aantal voor patch-clamp en micro-manipulatie experimenten . Deze methode is gebaseerd op een protocol met agarosegel alleen lipide GUVs 16 produceren en vereist minder gespecialiseerde apparatuur dan de electroformation methode.

De karakterisering van GUVs met fluorescentie microscopie wordt beschreven, evenals de procedures met behulp van een standaard patch-clamp set-up temeten KvAP activiteit in "inside-out" weggesneden membraan patches.

Groeiende eiwithoudende GUVs kan zijn moeilijker dan alleen lipide GUVs. In het bijzonder kunnen de uiteindelijke GUV rendement gevoelig afhankelijk van hoe de SUV oplossing afgezet en ontwaterd om het membraan stack. Voor iemand zonder eerdere ervaring met GUVs, kan het nuttig zijn eerst alleen groeien lipide GUVs na een gebruikelijke protocol 15,16 waarbij het ​​membraan film wordt gevormd door lipiden uit een organisch oplosmiddel. Zodra de conventionele protocol werkt goed, kan SUV depositie en gedeeltelijke dehydratatie vervolgens worden beheerst met behulp van alleen lipide-SUV's, die ook erg behulpzaam bij het aanpassen van het protocol voor een nieuwe lipide samenstelling. Wanneer GUVs groeien betrouwbaar van alleen lipide-SUV's, dan is het maar een kleine stap om eiwithoudende GUVs uit proteo-SUV's te produceren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Oplossing Voorbereiding

  1. Bereid 5 ml 'SUV buffer' bevattende 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) of Tris (pH 7,5) en 2 mM trehalose. Filtreer de buffer met een 0,2 urn spuitfilter en verdelen in porties van 1 ml die bij -20 ° C worden bewaard.
    LET OP: Extra informatie voor reagentia en instrumenten worden gegeven in de lijst met materialen.
  2. Bereid 40 ml van GUV 'Groei Buffer' dat de GUV interieur zal vullen tijdens de film rehydratatie. Voor een 'low salt' groei combineren 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) en 1 mM TRIS (pH 7,5) en -400 mM sucrose. Voor een 'fysiologisch zout' groei combineren 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) en 5 mM TRIS (pH 7,5) en -200 mM sucrose.
  3. Bereid 40 ml Observatie Buffer voor de externe oplossing in de experimentele kamer door het combineren van 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) en 5 mM TRIS (pH 7,5) en -200 mM glucose.
    LET OP: Deze buffers zijn alleen EXAmples. Zie de discussie buffers andere experimenten passen.
  4. Meet de osmolarities van de groei en observatie buffers met een osmometer. Korrels van sucrose of glucose toe om ze af te stemmen op binnen 1%, zodat GUVs niet zal lyseren of instorten wanneer overgebracht van de groei kamer naar de observatie kamer.
    OPMERKING: In dit concentratiegebied, het toevoegen van 1 mM van sucrose (13,7 mg per 40 ml) of glucose (7,2 mg per 40 ml) verhoogt de osmolariteit door ~ 1 mOsm.
  5. Filter de groei en observatie buffers met een 0,2 um filter en opgeslagen bij 4 ° C om bacteriegroei te remmen.
  6. Los 50 mg beta-caseïne in 10 ml 20 mM Tris (pH 7,5) buffer tot een 5 mg / ml beta-caseïne is gebruikt om de oppervlakken van experimentele kamers passiveren zodat GUVs niet houden, verspreiden en barsten te vormen. Zodra het beta-caseïne volledig is opgelost (tot enkele uren bij 4 ° C), filter (0,2 pm) het in monsters van 0,5 ml die flash worden ingevrorenbij -20 ° C voor later gebruik (ontdooid monsters opgeslagen bij 4 ° C kan typisch gebruikt tot 1 week).

2. SUV Voorbereiding

  1. Bereiden en fracties van proteo-SUV's naar aanleiding van de eerder gepubliceerde gedetailleerd protocol 28 bevriezen. Gebruik KvAP fluorescent gelabeld met Alexa-488 maleïmide, gereconstitueerd in DPhPC SUVs (10 mg / ml) bij een proteïne lipide-verhouding van 01:10 (massa).
    OPMERKING: Wildtype KvAP bevat één cysteine ​​per monomeer vlakbij het intracellulaire C-terminus (aminozuur 247).
  2. Fluorescerende, only Lipid SUV:
    OPMERKING: ga chloroform onder een rookkap dragen van nitril handschoenen en een veiligheidsbril. Vermijd het gebruik van een kunststof zoals chloroform ze kan oplossen. Chloroform oplossingen kunnen worden opgeslagen in amberkleurige glazen flesjes met Teflon caps en overgebracht met behulp van glas spuiten. Zorg glaswerk spoelen ten minste 5 tot 10 maal met chloroform vóór en na pipetteren lipiden.
    1. Bereid 100 ul10 mg / ml DPhPC SUV die 0,5 mol% van de rode fluorescente lipiden, Texas rood-DHPE, door het mengen van 100 ui DPhPC oplossing (10 mg / ml in chloroform) 8,2 gl van Texas rood-DHPE oplossing (1 mg / ml in methanol) in een 1,5 ml amberkleurige glazen flacon.
    2. Droog de lipiden onder een stikstofstroom in een chemische kap tijdens het draaien van het flesje. Toen de film droog lijkt te zijn, plaatst de lipiden onder vacuum gedurende 3 uur om eventueel achtergebleven oplosmiddel te verwijderen.
    3. Voeg 100 ul van SUV buffer om de lipiden, en vortex krachtig tot geen lipide blijft vast aan de wanden van de flacon en de oplossing is uniform melkachtig.
    4. Ultrasone trillingen de lipide oplossing SUV vormen. Pas de flacon positie totdat de echo zorgt ervoor dat de meeste bewegingen en stromen in het flesje, en zorg niet aan de oplossing onnodig verwarmen. Ga sonicatie totdat de oplossing doorschijnend, of indien mogelijk, transparant (2-5 min voor tip sonificatie, ~ 20 min voor badsonicatie).
    5. Aliquot SUV (bijvoorbeeld 10 ul of 20 pi) en bevriezen (-20 ° C) voor later gebruik.
      OPMERKING: Lipids, vooral onverzadigde vetten, kan gemakkelijk afbraak. WINKEL lipide oplossingen bij 20 ° C (of 80 ° C) onder argon en binnen 6 maanden. Lipide afbraakproducten kunnen worden gedetecteerd met dunnelaagchromatografie.

3. GUV Groei door Electroformation

  1. Bereid de electroformation kamer.
    1. Als de kamer niet is schoongemaakt, verwijder de ramen, veeg alle kit en vet, haal de draden, en spoel en scrub de kamer met een weefsel met behulp van water en ethanol (≥70%) afwisselend.
    2. Wrijf de draden goed, dompel de draden en de kamer in aceton, en ultrasone trillingen gedurende 5 minuten. Veeg alles met opnieuw een weefsel met behulp van aceton. Zet de kamer in ethanol en ultrasone trillingen gedurende 5 minuten.
    3. Monteer de kamer door het plaatsen van de draden door de gaten en draai en veeg de draden om ervoor te zorgen dat ze are schoon. Zet de kamer in gedestilleerd water, ultrasone trillingen gedurende 5 minuten en droog de kamer met een stroom van stikstof of lucht.
  2. Bereid 30 pi van 3 mg / ml suspensie in SUV SUV buffer. Om eiwithoudende GUVs vormen samen 8 pl proteo-SUV (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), 2 ui tl SUV (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) en 20 ui SUV buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis een laatste eiwit lipide (massa) verhouding van 1: 12,5 en 0,1 mol% TexasRed-DHPE. Meng de oplossing krachtig.
    1. Als alternatief voor het protocol met lipide-only SUV oefenen, gewoon combineren 10 ul van fluorescerende SUV's (10 mg / ml DPhPC en 0,5 mol% TexasRed-DHPE) met 20 pi SUV buffer.
  3. Stort de SUV Solution.
    1. Gebruik 2 pi pipet of 5 ul glazen spuit kleine (<0,2 ui) druppels van de SUV oplossing op de draden deponeren. Ongeveer 1 ui oplossing nodig voor een reeks druppels langs vormen1 cm van de draad. Zorg ervoor dat de druppels zijn klein genoeg en met voldoende tussenruimte dat ze niet aanraken of zekering.
    2. Laat het afgezette SUV drogen ~ 30 min in de open lucht. Wanneer alle druppels hebben gevestigd, draai de draad zodat de lipide deposito's zijn gemakkelijker te observeren met de microscoop.
      OPMERKING: Als de SUV's niet voldoende droog, kunnen ze gewoon afwassen de draden bij de groei buffer wordt toegevoegd, terwijl het drogen te veel kan het eiwit beschadigen. Omdat luchtvochtigheid beïnvloedt de droogsnelheid, de droogtijd en / of luchtvochtigheid kan worden aangepast voor optimale resultaten 30. De lipide film op de draden moeten zichtbaar onder een microscoop.
  4. Monteer de kamer.
    1. Sluit de ruimte Bodem: Gebruik een spuit vacuüm vet aanbrengen op de bodem van de kamer rond de drie putjes en op een 40 mm x 22 mm dekglaasje voorzichtig tegen de kamerbodem dichten zodat het hecht zonder speling. Verzegeling van de zijwanden van de kamer (waar de uitgang draden) metafdichtpasta. Solliciteer vacuüm vet op de top van de kamer waarin de drie putten.
    2. Voeg langzaam groei buffergeheugen totdat elk putje wordt gevuld tot de top. Vermijd snelle beweging van de oplossing in de putten als dit de lipide film strip uit de elektroden.
    3. Sluit de tank af door zachtjes te drukken op de bovenklep dia op het vet, het verzorgen van de onderkant dekglaasje niet te verjagen. Gebruik een tissue om eventuele druppels buffer bij de randen van de bovenste dekglas verwijderd.
      LET OP: Dit is een goed moment om de kamer onder de microscoop te onderzoeken om te bevestigen dat de lipide film is gebleven op de draden.
  5. Sluit de signaal generator om de draden met behulp van twee alligator clips. Stel de frequentie (10 Hz / 500 Hz sinus voor laag / hoog zout buffer) en gebruik een multimeter voor het meten en regelen van de spanning over de draden tot 0,7 / 0,35 V root mean square (Vrms) voor de lage / hoge zout buffer. Bedek de kamer met aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming tegen licht. Verlaat thij GUVs groeien voor 2 tot 3 uur voor de lage zout buffer, en 12 uur of O / N voor de hoge zout buffer.
  6. Koppel de kamer van de generator en zorgvuldig plaats het op een omgekeerde microscoop om GUV groei te evalueren. Gebruik langzame, gestage bewegingen of vloeistofstroom in de putten kan voortijdig los GUVs uit de draden.
    OPMERKING: GUVs op de bramen gewoonlijk zichtbaar fasecontrast (40X lang werkende doelstelling afstand), terwijl GUVs overal op de onderste helft van de draden kan worden gezien met epifluorescentie. Indien geen GUVs zichtbaar, draai hem de draden te kijken naar het bovenoppervlak. GUVs kunnen bij 4 ° C worden bewaard in een groeikamer gedurende enkele dagen.

4. GUV Groei door Gel-bijgestaan ​​Zwelling

  1. Maak 10 ml van een 1% agarose-oplossing door het mengen van 100 mg van agarose met 10 ml zuiver water. Verwarm het totdat het kookt door het te plaatsen in een magnetron bij 480 W voor ~ 20 sec. Roer om ervoor te zorgen dat de agarose volledig is opgelost.
    OPMERKING: De oplossingkunnen worden opgeslagen bij 4 ° C en opgewarmd wanneer nodig.
  2. Plasma-clean (lucht plasma) een cover-glijbaan voor 1 min, zodat de agarose-oplossing zal mooi verspreid over het. Gebruik de cover-dia's binnen de komende 15 min als het effect van plasma reiniging vermindert snel.
  3. Breng 200 pl warm agarose oplossing in elk 22 x 22 mm2 zo in de oplossing bevochtigt het gehele oppervlak. Kantel de dia verticaal en raak de onderrand om een ​​tissue om overtollige vloeistof te verwijderen en laat slechts een dunne gladde laag van agarose op de dia.
  4. Plaats het preparaat op een hete plaat of in een oven bij 60 ° C en laten drogen gedurende ten minste 30 min. De agarose film nauwelijks zichtbaar met het blote oog. Nadat de objectglaasjes afkoelen tot KT, gebruik onmiddellijk of bewaar ze maximaal een week in een gesloten houder bij 4 ° C.
  5. Plaats de-agarose gecoate dekglaasje in een standaard 3,5 cm petrischaal.
  6. Bereid de SUV-oplossing zoals in paragraaf 3.2 en de toepassing ~ 15 ul van de SUV-oplossing (3 mg / ml lipide) in~ 30 fijne druppels voorzichtig op de agarose oppervlak. Zorg ervoor dat u de agaroselaag vervormen teveel.
  7. Plaats het preparaat onder een zachte stroom van stikstof gedurende ongeveer 10-15 min en volg de verdamping van de buffer door oog als druppeltjes drogen.
  8. Zodra de SUV gedroogd, voeg groei buffer aan het glijoppervlak bedekken. Voor een kleine 3,5 cm petrischaaltje gebruik ~ 1 ml buffer.
  9. Laat de zwelling te gaan voor ~ 30 min, en dan onderzoeken de groei van GUVs in de kamer met behulp van een omgekeerde microscoop met fase-contrast of Differentieel Interferentie Contrast (DIC).
    OPMERKING: Epifluorescentie waarneming is moeilijk vanwege de sterke achtergrond van fluoroforen in de gel en de auto-fluorescentie van de agarose.

5. Oogsten en Observeren GUVs

  1. Passiveren de observatie kamer (bv kleine petrischaaltje of glazen dekglaasje), zodat GUVs niet houden, verspreiden en barsten op de kamer beneden. Bedek de chamber bodem met beta-caseïne oplossing, incubeer gedurende 5 minuten, spoel de caseïneoplossing met zuiver water, droog met een stroom van lucht of stikstof, en ten slotte toe observatie buffer (bv ~ 5 mm diepte voor een kleine petrischaal).
  2. Oogst de GUVs. Snij het einde van een 100 ui pipetpunten zodat de opening groter (~ 2 mm diameter), en streven langzaam de schuifspanning pipetteren gemakkelijk GUVs vernietigen.
    1. Voor-electro gevormd GUVs, opent de klimaatkast door voorzichtig verwijderen van de bovenste dekglaasje. Plaats de pipetpunt boven iedere draad en zuig ~ 50 ul tijdens het verplaatsen de pipetpunt langs de draad naar de GUVs los.
      NB: Het kan helpen om de draad te GUVs te verzamelen over de "andere kant" van de draad te draaien.
    2. Voor "-gel bijgestaan ​​zwelling" GUVs, tikt u eerst op de zijkant van de petrischaal een paar keer om te helpen de GUVs los te maken van het dekglaasje oppervlak. Plaats de pipet net boven het dekglaasje en zuig 50 ul terwijl pulling de tip terug over het oppervlak. Rechtstreeks over geoogst GUVs om een ​​observatie kamer, of op te slaan in een 1,5 ml microcentrifugebuis bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
  3. Plaats de observatie kamer op een omgekeerde microscoop, voeg de GUVs aan de observatie kamer, en wacht een paar minuten voor de GUVs te vestigen op de kamer bodem.
  4. De enquête van de kamer met fase contrast of DIC te glad, bolvormig ('foutloze') "GUV kandidaten" snel te lokaliseren. Onderzoekt elke "GUV kandidaat" in epifluorescente elke daarin kleinere liposomen in genest sluiten. Controleer ten slotte dat de lipide fluorescentie-intensiteit is uniform en compatibel met een enkel membraan (dat wil zeggen, unilamellair).
    Opmerking: In sommige bilamellar (of multilamellaire) vesicles, de membranen te dicht bij elkaar worden opgelost zodat deze worden weergegeven unilamellaire in fase contrast of DIC afbeeldingen. Echter, deze voorwerpen worden onderscheiden van werkelijke unilamellar GUVs hun lipide fluorescentie, die tweemaal (of meer) helderder.

6.-Patch klemmen GUVs

  1. Maak patch pipetten met een 1-2 micrometer tip diameter van standaard borosilicaat capillair glas met behulp van het programma aanbevolen voor de pipet trekker.
    OPMERKING: Bijzondere behandelingen zoals brand polijsten niet nodig, en pipetten kan worden gebruikt voor meerdere dagen na zijn getrokken als ze worden bewaard in een gesloten doos.
  2. Passiveren de kamer door incubatie met een beta-caseïne-oplossing (5 mg / ml) zodat GUVs niet hechten, verspreiden en breuk op kameroppervlakken. Spoel de caseïne uit na 5 min.
  3. Plaats de aardelektrode, vult de kamer met observatie buffer, overdragen 10 ul van de GUV schorsing zoals beschreven in stap 5.2 en 5.3, en wacht een paar minuten voor de GUVs om zich te vestigen op de bodem.
  4. Vul een frisse patch pipet met oplossing (observatie buffer of een andere iso-osmotische oplossing) enmonteren op de patch-clamp versterker headstage.
  5. Zoek door de kamer om een ​​"foutloze" GUV lokaliseren zoals beschreven in paragraaf 5.4, en controleer of het fluorescerend eiwit bevat.
  6. Breng een constante positieve druk (> 100 Pa, of ongeveer 1 cm H 2 O in een manometer) om de patch pipet interieur schoon te houden, en steek de patch pipet in de kamer. Breng de patch pipet in het gezichtsveld, testimpulsen gelden voor het meten / compenseren de pipet spanning offset en weerstand, en onderzoekt de pipet onder tl-verlichting te bevestigen dat de tip is schoon.
  7. Breng de patch pipet richting de GUV, en indien nodig, tegelijkertijd verminderen van de positieve druk, zodat de uitstroom uit de patch pipet niet de GUV maken "weg te lopen". Wanneer de patch pipet dicht bij de GUV, passen een negatieve druk (tot 5 cm H2O) aan de GUV tegen de patch pipet trekken. Controleer de weerstand als de "; Tong "van GUV membraan komt de patch pipet en de gigaseal vormen.
  8. Als een gigaseal niet vormen, verwijder de patch pipet uit de kamer en terug te keren naar stap 6.4. Als het membraan patch vormden een gigaseal, maar de GUV blijft aan de pipet, accijnzen de patch door weg te trekken uit de GUV, barsten de GUV tegen de kamer bodem, of in het kort het verplaatsen van de pipet uit de oplossing.
  9. Wanneer de inside-out membraan patch is uitgesneden uit de GUV en de gigaseal stabiel is, schakelt u de test pulsen en een spanning protocol toe te passen zoals die weergegeven in figuur 13.
    OPMERKING: Figuur 13 volgt de standaard elektrofysiologische conventie voor een inside-out patch waarin stroom in de patch-elektrode is 'positief', en V = V bad - V pipet. Houd de pleister op een negatieve potentiaal (bijvoorbeeld V = -100 mV) voor ~ 30 sec plaatsen KvAP in de toestand van rust, terwijl de stappen (100 msec tot 5 sec) om meer positieve potentials (bv V = 100 mV) kan rijden dan het in het uitvoeren van (dat wil zeggen, open) actieve toestanden.
  10. Na metingen op een membraan patch klaar zijn, breken de patch met een zap of drukpuls en controleer of de spanning te compenseren van de patch elektrode niet afgedreven. Verwijder de patch pipet uit de kamer, en terug te keren naar stap 6.4.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De groei van GUVs kan snel worden geëvalueerd door het onderzoeken van de groeikamer onder de microscoop. Voor electroformation, de GUVs neiging om te groeien in trossen langs de platina draden, zoals getoond in figuur 4. In-gel ondersteunde zwelling, GUVs weergegeven als bolvormige structuren die snel groeien en samensmelten (figuur 5).

Foutloze GUVs gemakkelijker kunnen worden vastgesteld en geëvalueerd na de overdracht aan een observatie kamer. Kalibratie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Biomimetic modelsystemen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van de eigenschappen en interacties van eiwitten en membranen. Vergeleken met andere gereconstitueerde systemen zoals BLMs of ondersteunde lipidemembranen, GUV systemen vertonen vele mogelijkheden waaronder aanzienlijke invloed membraan samenstelling, spanning en geometrie, maar ook als echte olie-vrij. Echter, waarin transmembraan eiwitten, zoals KvAP, in GUVs vereist aanzienlijke aanpassingen van conventionele protocollen voor slechts lipide G...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Susanne Fenz voor het bespreken van de mogelijkheid om eiwitten te reconstitutioneren door agarose-zwelling, Feng Ching Tsai voor de huidige metingen, en de huidige en voormalige leden van de Bassereau-groep voor ondersteuning en assistentie. Het project werd gefinancierd door de Agence Nationale de la Recherche (subsidie BLAN-0057-01), door de Europese Commissie (NoE SoftComp), door de Université Pierre et Marie Curie (subsidie van de FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. werd ondersteund door een Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. door een beurs van de Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. door een Marie Curie Incoming International Fellowship van de Europese Commissie en een subsidie van de Université Pierre et Marie Curie. De publicatiekosten werden gedekt door de Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine)Avanti Polar Lipids 850356P
Egg PC L-α-fosfatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051P
Egg PA L-α-fosfatidisch zuur (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids 840101P
18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholineAvanti Polar Lipids 850375P
Cholesterol (ovine wool, >98%) Avanti Polar Lipids 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MPgelabeld lipid
BPTR-CeramideInvirtogenD-7540 gelabeld lipid
ChloroformVWR22711.290AnalaR Normapur
AcetonVWR20066.296AnalaR Normapur
EthanolVWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
Hamilton spuiten Hamilton Bonaduz AGdiverse
Amber vials en Teflon cupsSigmaSU860083 en SU860076
ParafilmVWR291-1214
Microcentrifuge tubeEppendorfdiverse
AgaroseEuromexLM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
SucroseSigma84097-1kg
Glucose SigmaG8270-1kg
TrehaloseSigmaT9531-25G
KClSigmaP9333-1kg
HepesSigmaH3375-100G
TRISEuromexEU0011-A
OsmometerWescorVapro
pH meterSchott instrumentsLab850
SonicatorElmasonicS 180 H
Spuitfilter 0.2 µmSartorius steimMinisart 16532
FunctiegeneratorTTiTG315
PlatinedradenGoodfellowLS41307499.99+%, d = 0.5 mm
PolytetrafluorethyleenGoodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease'VWR1597418
sealing pasteVitrex medical A/S, DenmarkREF 140014Sigillum Wax
Dekglasjes 22 x 40 mm No1.5VWR631-0136
Dekglasjes 22 x 22 mm No1.5VWR 631-0125
Plasma cleanerHarrickPDC-32Gairplasma, instelling 'high'
PetrischalenFalcon BDREF 3530013.5 cm x 1 cm
patch clamp versterkerAxon instrumentsMulticlamp700B
DAQ CardNational InstrumentsPCI-6221
LabviewNational Instrumentsversie 8.6
Glas pipetten boro silicaat OD 1 mm ID 0.58 mmHarvard ApparatusGC100-15
ElektrodehouderWarner Instruments Q45W-T10P
MicromanipulatorSutter MP-285
PipetpullerSutter P-2000 
CameraProSilica GC1380
Zeiss microscoopZeissAxiovert 135
ObjectiefZeiss40X lange werkafstand, fase contrast
Objectief Zeiss100X Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (voor Alexa-488)HoribaXF100-3
Filterset Cy3 (voor TexasRed)HoribaXF101-2

Referenties

  1. Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
  2. Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  3. Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
  4. Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605(2011).
  5. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  6. Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102(2009).
  7. Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
  8. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  9. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  10. Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
  11. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  12. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  13. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  14. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
  15. Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  16. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  17. Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  18. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
  19. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  20. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  21. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  22. Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  23. Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  24. Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102(2005).
  25. Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
  26. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  27. Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
  28. Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529(2011).
  29. Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
  30. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  31. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
  32. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
  33. Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
  34. Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
  35. Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
  36. Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
  37. Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a(2013).
  38. Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

KvAP-reconstitutieelectroformatie-methodezwelling met behulp van gelfluorescentiemicroscopielipiden-eiwitfilmdehydratie-rehydratieincorporatie van membraaneiwitten
Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.