De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Giant Unilamellaire Vesicles (GUVs) zijn een populaire biomimetic voor het bestuderen membraan samenhangende verschijnselen. Echter, vaak gebruikte protocollen groeien GUVs, dient te GUVs houdende functionele transmembraan proteïnen worden gemodificeerd. Dit artikel beschrijft twee dehydratatie-rehydratatie methoden - electroformation en gel bijgestaan zwelling - naar GUVs met de voltage-gated kalium kanaal, KvAP vormen. In beide werkwijzen wordt een oplossing van eiwithoudende unilamellaire vesicles gedeeltelijk gedehydrateerd om een stapel membranen, die vervolgens wordt zwellen in een rehydratatie buffer te vormen. Voor de electroformation werkwijze wordt de film afgezet op platinaelektroden zodat een wisselveld in tijdens rehydratatie kunnen worden toegepast. Daarentegen gebruikt de gel ondersteunde zwelling werkwijze een agarosegel substraat film rehydratatie verbeteren. Beide methoden kunnen GUVs in lage (bijvoorbeeld 5 mM) en fysiologische (bv, 100 mM) zoutconcentraties produceren. De resulterende GUVs gekenmerkt door fluorescentie microscopie, en de functie van gereconstitueerde kanalen gemeten met de inside-out patch-clamp configuratie. Terwijl zwelling in aanwezigheid van een wisselend elektrisch veld (electroformation) geeft een hoge opbrengst van foutloze GUVs, produceert de gel ondersteunde zwelling werkwijze een homogeen eiwit verdeling en vereist geen speciale apparatuur.
Inleiding
Bij het bestuderen van de fysische principes die levende systemen regeren, bottom-up aanpak kan een experimentator om systeem samenstelling en andere parameters die niet gemakkelijk worden gemanipuleerd in cel-gebaseerde systemen 1 beheersen. Bij membraan processen, Giant Unilamellaire Vesicles (GUVs, diameter ~ 1-100 um) hebben bewezen een zeer nuttige biomimetische systeem 2-7 als ze goed geschikt voor microscopie studies en micromanipulatie 8-10. Hoewel er veel verschillende protocollen om GUVs produceren, de meeste vallen in twee categorieën - emulsie gebaseerde benaderingen 11,12 en technieken gebaseerd op rehydratin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Oplossing Voorbereiding
- Bereid 5 ml 'SUV buffer' bevattende 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) of Tris (pH 7,5) en 2 mM trehalose. Filtreer de buffer met een 0,2 urn spuitfilter en verdelen in porties van 1 ml die bij -20 ° C worden bewaard.
LET OP: Extra informatie voor reagentia en instrumenten worden gegeven in de lijst met materialen. - Bereid 40 ml van GUV 'Groei Buffer' dat de GUV interieur zal vullen tijdens de film rehydratatie. Voor een 'low salt' groei combineren 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) en 1 mM TRIS (pH 7,5) en -400 mM sucrose. Voor een 'fysiologisch zout' groei combineren 100 mM KCl, 5 mM HEPES ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De groei van GUVs kan snel worden geëvalueerd door het onderzoeken van de groeikamer onder de microscoop. Voor electroformation, de GUVs neiging om te groeien in trossen langs de platina draden, zoals getoond in figuur 4. In-gel ondersteunde zwelling, GUVs weergegeven als bolvormige structuren die snel groeien en samensmelten (figuur 5).
Foutloze GUVs gemakkelijker kunnen worden vastgesteld en geëvalueerd na de overdracht aan een observatie kamer. Kalibratie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Biomimetic modelsystemen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van de eigenschappen en interacties van eiwitten en membranen. Vergeleken met andere gereconstitueerde systemen zoals BLMs of ondersteunde lipidemembranen, GUV systemen vertonen vele mogelijkheden waaronder aanzienlijke invloed membraan samenstelling, spanning en geometrie, maar ook als echte olie-vrij. Echter, waarin transmembraan eiwitten, zoals KvAP, in GUVs vereist aanzienlijke aanpassingen van conventionele protocollen voor slechts lipide G.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Susanne Fenz voor het bespreken van de mogelijkheid om eiwitten te reconstitutioneren door agarose-zwelling, Feng Ching Tsai voor de huidige metingen, en de huidige en voormalige leden van de Bassereau-groep voor ondersteuning en assistentie. Het project werd gefinancierd door de Agence Nationale de la Recherche (subsidie BLAN-0057-01), door de Europese Commissie (NoE SoftComp), door de Université Pierre et Marie Curie (subsidie van de FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. werd ondersteund door een Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. door een beurs van de Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. door een Marie Curie Incoming Inte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-fosfatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-fosfatidisch zuur (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | gelabeld lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | gelabeld lipid |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Aceton | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton spuiten | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials en Teflon cups | Sigma | SU860083 en SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Spuitfilter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Functiegenerator | TTi | TG315 | |
| Platinedraden | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluorethyleen | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Dekglasjes 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Dekglasjes 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, instelling 'high' |
| Petrischalen | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp versterker | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | versie 8.6 | |
| Glas pipetten boro silicaat OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Elektrodehouder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipetpuller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscoop | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objectief | Zeiss | 40X lange werkafstand, fase contrast | |
| Objectief | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (voor Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (voor TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
Referenties
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
