Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA In Situ Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

Summary

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Abstract

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Deze aanpak is vooral effectief bij het in kaart brengen van zeer repetitieve sequenties te heterochromatische regio's, waar computationele benaderingen geconfronteerd onbetaalbaar uitdagingen. Hier beschrijven we een gestroomlijnde protocol voor DNA-ISH dat formamide wast die standaard stappen in andere DNA-ISH protocollen zijn omzeilt. Ons protocol is geoptimaliseerd voor hybridisatie met korte enkelstrengs DNA probes die fluorescente kleurstoffen, die effectief markeren repeterende DNA sequenties binnen heterochromatic chromosomale regio's in een aantal verschillende insecten weefsel dragen. Echter, kunnen aanvragen worden uitgebreid om te gebruiken met grotere sondes en visualisatie van enkele kopie (niet-repeterende) DNA-sequenties. We tonen deze methode in kaart brengen van verschillende repetitieve sequenties te geplet chromosomen van Drosophila melanogaster neurale cellen en Nasoniavitripennis spermatocyten. We tonen hybridisatie patronen voor zowel kleine, commercieel gesynthetiseerde probes en voor een grotere probe voor vergelijking. Deze procedure maakt gebruik van eenvoudige laboratoriumbenodigdheden en reagentia, en is ideaal voor onderzoekers die weinig ervaring hebben met het uitvoeren van DNA-ISH.

Introduction

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Probes om enkele kopie gebieden in euchromatin kan worden opgewekt door een handvol benaderingen, zoals nick-translatie of end-labeling van lange DNA-producten ^1,2 en de opname van deoxygenin (DIG) -attached nucleotiden en hun herkenning door allerlei -groep geconjugeerde antilichamen ^1-3. Visualisatie van euchromatic sequenties in enkele of enkele kopie nummer vereist het gebruik van één enkele, grote probes met een hoge specifieke activiteit of een cocktail meerdere kleinere probes die gezamenlijk versterken sign....

Protocol

1. Tissue Dissection en Fixatie (60 min)

1. Voor Drosophila hersenen, plaats 3 ^e instar larven in een druppel 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing). Kies groot 3 ^e instar larven die actief kruipen uit flesjes of flessen die niet overvol zijn.
   1. Gebruik een ultrafijne pincet paar te houden van de mond haken en andere pincet pair te grijpen 2/3 de lengte van het lichaam (Figuur 1A, B) grijpen. Trek de mond haken aan de hersenen, ventrale ganglia, speekselklieren en een deel van de larvale spijsverteringskanaal bloot. Gebruik de pincet naar de hersenen en ventrale ganglia scheiden (Figuur 1A, B) ....

Results

Om deze methode te demonstreren we gehybridiseerd een reeks kleine commercieel gesynthetiseerde oligonucleotiden die chemisch zijn gemodificeerd met fluorescente conjugaten (figuur 2) en een langere gebiotinyleerd probe (gemaakt door nick translatie van een PCR-product Figuur 2B) om chromosomen van verschillende weefsels soorten (zie tabel 1). De doelwitsequenties satelliet opgenomen herhalingen gelegen in pericentromerische (heterochromatische) regio's van mitotisc.......

Discussion

DNA ISH wordt vaak gebruikt om specifieke sequenties met chromosomen in kaart. We hebben een eenvoudige methode voor DNA-ISH geoptimaliseerd voor een groot aantal kopieën, heterochromatische sequenties beschreven. In plaats van het gebruik wast in een formamide oplossing, wat een vereiste is in andere bestaande DNA-ISH protocollen, plaatsen we weefsel gemonteerde dia's direct op een voorverwarmd blok aan DNA denatureren. Deze werkwijze omzeilt het gebruik van grote hoeveelheden formamide. Een cruciale stap voor het .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)	Sigma Aldrich
Ultrafine tweezers (5 gauge)	Dumont
22 x 22 mm cover slips	Fisher		Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear
Sigmacote	Sigma
Filter paper			75 - 150 mm
Paraffin wax paper
Heat block with thermometer
Dry incubator
Razor blades
Humidity chamber			empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes
Coplin jars			with slide grooves
Aluminum foil
Pasteur pipettes
1.5 ml microfuge tubes
Nail polish			clear or colored
P20 micropipette and plastic tips
Paperclips			20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain
Reagents
16% EM grade paraformaldehyde	Electron Microscopy Reagents
Acetic acid	Sigma
Liquid nitrogen
100% Ethanol, chemical grade
Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos
Long biotinylated probe	Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3		e.g., nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3		for detection of long biotinylated probe
Hybridization buffer	Recipe above
4x SSCT	Recipe above		saline-sodium citrate + Tween
0.1x SSC	Recipe above		saline-sodium citrate
Blocking solution	Recipe above
SBT	Recipe above		SSC, bovine serum albumin, Tween
1x PBT	Recipe above		phosphate-buffered saline + Tween
1x PBS			phosphate-buffered saline
Hypotonic solution			0.5% sodium citrate in H2O
Formamide	Sigma Aldrich
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector laboratories