Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA In Situ Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

Samenvatting

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Samenvatting

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Deze aanpak is vooral effectief bij het in kaart brengen van zeer repetitieve sequenties te heterochromatische regio's, waar computationele benaderingen geconfronteerd onbetaalbaar uitdagingen. Hier beschrijven we een gestroomlijnde protocol voor DNA-ISH dat formamide wast die standaard stappen in andere DNA-ISH protocollen zijn omzeilt. Ons protocol is geoptimaliseerd voor hybridisatie met korte enkelstrengs DNA probes die fluorescente kleurstoffen, die effectief markeren repeterende DNA sequenties binnen heterochromatic chromosomale regio's in een aantal verschillende insecten weefsel dragen. Echter, kunnen aanvragen worden uitgebreid om te gebruiken met grotere sondes en visualisatie van enkele kopie (niet-repeterende) DNA-sequenties. We tonen deze methode in kaart brengen van verschillende repetitieve sequenties te geplet chromosomen van Drosophila melanogaster neurale cellen en Nasoniavitripennis spermatocyten. We tonen hybridisatie patronen voor zowel kleine, commercieel gesynthetiseerde probes en voor een grotere probe voor vergelijking. Deze procedure maakt gebruik van eenvoudige laboratoriumbenodigdheden en reagentia, en is ideaal voor onderzoekers die weinig ervaring hebben met het uitvoeren van DNA-ISH.

Inleiding

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Probes om enkele kopie gebieden in euchromatin kan worden opgewekt door een handvol benaderingen, zoals nick-translatie of end-labeling van lange DNA-producten ^1,2 en de opname van deoxygenin (DIG) -attached nucleotiden en hun herkenning door allerlei -groep geconjugeerde antilichamen ^1-3. Visualisatie van euchromatic sequenties in enkele of enkele kopie nummer vereist het gebruik van één enkele, grote probes met een hoge specifieke activiteit of een cocktail meerdere kleinere probes die gezamenlijk versterken signaal.

In tegenstelling, zeer repetitieve sequenties gevonden in heterochromatine, zoals satelliet-DNA's, zijn gemakkelijker doelwitten voor DNA-ISH, omdat ze normaal bestaan ​​als tientallen tot duizenden herhalingen geclusterd in één chromosoom regio bekend als blokken. Transposons kunnen ookgevonden bij hoge kopie nummers op verschillende chromosomale loci ^2. In deze gevallen kan één probes met een lage specifieke activiteit effectief labelen heterochromatic sequenties vanwege hun hybridisatie op meerdere plaatsen. Probes repeterende sequenties kunnen worden gesynthetiseerd commercieel als korte oligonucleotiden (30-50 bp) en chemisch geconjugeerd met een van meerdere verschillende fluorescerende groepen. In kaart brengen van repetitieve sequenties binnen heterochromatinevorming met behulp van genoom-sequencing technologie is moeilijk te wijten aan uitdagingen in de bouw steigers binnen zeer repetitief satelliet blokken ^4-6,7. Momenteel ISH staat als de meest effectieve manier van het in kaart brengen van deze sequenties op de sub-chromosoom niveau. Deze strategie is belangrijk voor het in kaart brengen van grote aantallen repetitieve sequenties die worden ontdekt door aanhoudende genoom en transcriptoom sequencing studies.

De efficiëntie en het gemak van het in kaart brengen repetitieve sequenties on-slide gemonteerd chromosomen zou worden greAtly versterkt door een vereenvoudigde protocol voor DNA ISH. Bijvoorbeeld, bestaande protocollen voor DNA-ISH betrekken meerdere wasbeurten van gehybridiseerd weefsels in formamide oplossing ^2,8, dus aanzienlijk toe te voegen aan de vereiste tijd voor het in kaart brengen van sequenties en ook de productie van grote hoeveelheden chemisch afval voor deze dure reagens. Hier beschrijven we een gewijzigde DNA ISH methode de noodzaak van formamide wassingen omzeilt en gebruikt elementaire laboratoriumapparatuur en reagentia. Deze methode werd oorspronkelijk ontworpen voor de snelle kartering van sterk herhaalde DNA-sequenties in heterochromatic gebieden van Drosophila larven neuroblasts met commercieel gesynthetiseerde oligo's die zijn geconjugeerd met fluorescentie kleurstoffen. Deze methode werkt ook voor het in kaart brengen repetitieve sequenties door grotere probes gesynthetiseerd via andere middelen ^9,10 en in meerdere verschillende weefsels en chromosoom types. Daarnaast kan deze methode gebruikt worden om euchromatic sequenties in kaart met behulp van langere of multiple, korte sondes binnen de euchromatic sequentie van belang.

Protocol

1. Tissue Dissection en Fixatie (60 min)

1. Voor Drosophila hersenen, plaats 3 ^e instar larven in een druppel 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing). Kies groot 3 ^e instar larven die actief kruipen uit flesjes of flessen die niet overvol zijn.
   1. Gebruik een ultrafijne pincet paar te houden van de mond haken en andere pincet pair te grijpen 2/3 de lengte van het lichaam (Figuur 1A, B) grijpen. Trek de mond haken aan de hersenen, ventrale ganglia, speekselklieren en een deel van de larvale spijsverteringskanaal bloot. Gebruik de pincet naar de hersenen en ventrale ganglia scheiden (Figuur 1A, B) van de andere weefsels en in een druppel 1x PBT (fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween) op een plastic Petri schaal.
2. Voor Nasonia testis dissecties, kiest mannelijke 3-dagen oude poppen (geel lichaam met rode ogen). Man Nasonia hebben kleine vleugel pad lengtes ten opzichte van females tijdens het popstadium (figuur 1C).
   1. Houd de pop bovenaan de buik bij de thoracale gebied met een pincet paar en met de andere pincet paar, pak het distale uiteinde van de buik en trek de traan-vormige testes (ze worden omringd door fat lichaam die zachtjes kan worden geschud weg; figuur 1D). Losmaken elke uitwendige lichaamsdelen van de testes, die zal voorkomen dat de juiste kneuzingen, en plaats in een druppel 1x PBT op een plastic Petri plaat.
3. Voor elk objectglaasje, ontleden totaal vier of vijf weefselmonsters (bv. Drosophila larven hersenen of Nasonia testes).
   OPMERKING: Meer dan vijf monsters zal leiden tot overvolle kernen en chromosomen.
4. Eventueel enkele scheiding van zusterchromatiden in euchromatic gebieden van mitotische chromosomen bereiken, behandelen van het weefsel met een hypotone oplossing overbrengen hersenen van 1x PBT tot een daling van 0,5% natriumcitraat 5-10 (niet meer dan 10) min.
   OPMERKING: Colchicine (a Antimitoticum) kunnen nuttig voor het verhogen van het aantal mitotische figuren aan metafase ¹¹ zijn. Echter, het gebruik ervan is niet nodig als zeer grote gezonde larven worden, en zelfs ongewenst, omdat het een negatieve invloed heeft op de chromosoom resolutie verspreiden en morfologie.
5. Plaats een druppel (~ 20 pi) fixeeroplossing (2,5% paraformaldehyde in 45% azijnzuur) op het oppervlak van een schone Sigmacote behandelde dekglas.
   OPMERKING: Zorg fixeeroplossing vers voor elke dag van gebruik. Fixatief oplossingen gaande 1,8-3,7% paraformaldehyde in 45% azijnzuur geven de beste resultaten voor FISH. Het gebruik van andere dan de hersenen of testes weefsels, of het aanpassen van dit protocol voor immuno-FISH kan verlangen te experimenteren met verschillende fixatieven (voor een lijst van verschillende fixatieven, zie ^12).
6. Breng zorgvuldig elk weefselmonster van het ontleden buffer (1x PBT) in de fixatief druppel met ultrafijne pincet, minimizing van de overdracht van het ontleden van buffer in de fixeeroplossing. Plaats de weefselmonsters zodat zij op gelijke afstand van elkaar in het fixeermiddel druppel. Incubeer de weefsels in fixeermiddel gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
7. Plaats een poly-lysine-gecoate slide gezicht voorzichtig naar beneden op het weefsel en dekglas. Druk niet op dit punt, maar in plaats daarvan laat de twee tot licht contact, zodat het dekglas plakt op de onderkant van de dia. Keer de glijbaan zodat het deksel slip is op de top.
8. Sandwich de dia / weefsel / dekglas in een opgevouwen stuk filterpapier. Op een stabiele ondergrond, met de duim, drukt zeer stevig recht naar beneden op de locatie direct boven het deksel slip. Wees voorzichtig om te voorkomen dat zijdelingse schuifdeuren van het dekglas (dit zal vegen veroorzaken van het weefsel).
9. Dompel de dia / weefsel / dekglas in vloeibare stikstof (zie apparaat in figuur 1E, F), en laat het staan ​​totdat de Stikstof stopt met koken (langer is fine). Verwijder de glijbaan en onmiddellijk snap het deksel slip met een frisse scheermesje door flicking een hoek van het dekglas in een opwaartse richting (geen krassen op de vaste weefsel met het scheermesje).
   1. Pre-koeling van de dia / weefsel / dekglas op een blok van droog ijs, dekking slip up, voor 1-2 min voorafgaand aan het onderdompelen in vloeibare stikstof zal helpen voorkomen dat de dia's van kraken.
10. Onmiddellijk de dia met weefsel in een pot Coplin gevuld met 100% ethanol bij kamertemperatuur en laten staan ​​gedurende ten minste 5 minuten (deze tijd kan langer indien nodig).
    OPMERKING: koude 100% ethanol kunnen worden gebruikt.
11. Verwijder de dia met weefsel, lont overtollige ethanol met een Kimwipe weg (zonder het aanraken van de vaste weefsel), en laat de schuif aan de lucht drogen gedurende 1 uur.
    1. Ga dan naar stap 2 of houden dia droog in de lage luchtvochtigheid of in een verdroging kamer voor weken tot zelfs maanden voor het uitvoeren van de hybridisatie.

Figuur 1: (A) Een 3 ^e instar Drosophila larve (rechts), met posities geïndiceerd voor waar aan de mond haken grijpen (aangeduid met *) en 2/3 van de weg naar beneden de larven aan hersenen ontleden; (Links) een schema van een larve een gelijk ontwikkelingsstadium, die de relatieve positie van de hersenen in het larvale weg. (B) De hersenen en ventrale ganglia ontleed een ^3e instar Drosophila larve (rechts) en een schema van deze weefsel (links). (C) 3 dagen oude Nasonia pop bij de gele body-rode ogen stadium. (D) een testis paar ontleed van een 3 dagen oude Nasonia mannelijke pop (rechts) met posities aangeeft waar de pop grijpen aan de achterkant van het abdomen (aangegeven met *) en halverwege op het lichaam; (Links) schematische beeltenis van mannelijke en vrouwelijke wasp poppen; mannelijke poppen kunnen worden onderscheiden door vleugels die niet voorbij de sagittale profiel (zwarte pijl), in tegenstelling tot vrouwen die vleugels die zich uitstrekken langs het profiel; de relatieve positie van de testis paar wordt getoond in de mannelijke pop. (E) De inrichting-een reeks paperclips-en (F) methode om dia dompelen in een vat van vloeibare stikstof. Meerdere paperclip strings kan worden gebruikt voor gelijktijdige onderdompeling van meerdere dia.

2. In situ hybridisatie (30 minuten op dag 1, 1 uur, 2,5 uur lange probes op dag 2)

1. Voeg 1 pl (100 ng) van elke probe 20 gl 1,1 x hybridisatiebuffer. Pipet sonde / hybridisatie buffer op het oppervlak van de vaste weefsel (vermijd contact met het weefsel).
2. Plaats voorzichtig een dekglaasje direct op de sonde / hybridisatie buffer, en zorg ervoor dat het deksel slip direct wordt gecentreerd over het weefsel. De buffer moet migreren naar the buitenrand van het deksel slip, waardoor er geen luchtbellen.
   OPMERKING: Kleine bubbels die geen contact met het weefsel hebben geen problemen om de procedure niet opleveren. Verwijder grote luchtbellen door voorzichtig een tipje van de dekglas en voorzichtig laten vallen terug op de dia.
3. Plaats de dia / weefsel / dekglas op het oppervlak van een blok voorverwarmd tot 95 ° C (cover slip up). Dek af met een groot stuk aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Laat de schuif incubeer bij 95 ° C gedurende 5 min.
   OPMERKING: Een typische warmte blok met gaten voor buizen kan worden omgedraaid om een ​​plat oppervlak waarop de dia / weefsel / dekglas plaatsen bieden.
4. Verwijder de glijbaan, laat het iets afkoelen totdat het warm aanvoelt. Wikkelen zorgvuldig een stuk uitgerekt Parafilm rond het dekglas om de vloeistof af te dichten eronder.
5. Plaats de gesloten schuif in een vochtige kamer en plaats de kamer in een incubator voorverwarmd tot 30 ° C. Incubeer bij 30 ° C gedurende 4 uur tot overnacht.
   1. Maak een vochtige kamer van een lege tip doos of met deksel Tupperware container met vochtige Kimwipes of papieren handdoeken geplaatst op de bodem.
      OPMERKING: enkelstrengs DNA-oligo-probes werden ontworpen om 28-33 basen theoretische smelttemperatuur _(Tm) van 45-47 ° C bereiken. Deze lengte en _Tm reeksen weerspiegelen het feit dat veel repetitieve sequenties die we hebben bestudeerd zijn AT-rijk en hebben een zeer lage GC-gehalte dus. Langere probes zullen waarschijnlijk hogere _Tm-waarden; Dit kan resulteren in hogere achtergrond hybridisatie bij standaard hybridisatie temperatuur van 30 ° C. Zo kunnen sommige problemen hybridisatie temperaturen gehouden de beste resultaten. Om de beste hybridisatietemperatuur, verhoging (of verlaging) van de temperatuur met 5 ° C vinden, stapsgewijs.
6. Verwijder voorzichtig de Parafilm van de glijbaan en dan verwijder voorzichtig het deksel slip door langzaam te tillen één hoek. Wash de dia drie keer voor elk 15 minuten wassen in 0,1x SSC buffer. Bedek de Coplin pot met aluminiumfolie tijdens het wassen aan het licht blootstelling te minimaliseren.
7. Als u geen lange gebiotinyleerde sonde, ga dan naar stap 2.8.
   1. Bij gebruik van een lange gebiotinyleerd sonde, droog het gebied rond het weefsel met een Kimwipe, zorg dat het weefsel zich niet aan te raken. Plaats 100 ul van het blokkeren oplossing over het weefsel en bedek voorzichtig met een dekglaasje, en zorg ervoor dat het opsluiten luchtbellen te vermijden. Wikkel het glijden over het dekglaasje met Parafilm en plaats bij 37 ° C gedurende 30 min.
   2. Verwijder voorzichtig het dekglaasje en dep rond het weefsel met een Kimwipe. Pipet 100 ul van rhodamine-avidine verdund 1: 1.000 in SBT over het weefsel en bedek voorzichtig met een dekglaasje, de zorg om te voorkomen dat het vangen bubbels. Wikkel het glijden over het dekglaasje met Parafilm en plaats bij 37 ° C gedurende 30 min.
   3. Verwijder het dekglaasje voorzichtig en was de glijbaan 3 keer gedurende 5 minuten elk in 4x SSCT en dan3 maal gedurende 5 minuten elk in 0,1x SSC.
      OPMERKING: Dia's kunnen worden gewassen voor een langere periode van tijd.
8. Verwijder de glijbaan en dep rond het weefsel met een droge Kimwipe om overtollige buffer te verwijderen (vermijd contact met het weefsel). Plaats de dia weefsel kant naar boven op een donkere plaats voor 10-15 minuten of tot het vocht volledig verdwijnt.
9. Pipetteer 11 ul Vectashield fixeermiddel (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool-DAPI) op het weefsel. Plaats een schoon dekglaasje (niet behandeld met Sigmacote) over het middelpunt van het fixeermiddel en de weefsels voorzichtig. Het fixeermiddel moet langzaam naar buiten migreren naar de randen van het dekglas.
   Opmerking: Als het fixeermiddel niet aan de rand van het dekglas rondom bereiken, wordt een 1-2 pi fixeermiddel worden aangebracht op één positie aan de rand van het dekglas van de benodigde volume te vullen. In dit geval moet u weg te vegen overtollige medium van de glijbaan oppervlak voordatafdichting.
10. Dicht de randen van het dekglas met nagellak. Vermijd het schilderen van de nagellak over het weefsel monster.
11. Plaats de dia rechtop in een donkere plaats en laat de nagellak droog tot het volledig vaste schijf (meestal 30 min of meer). Op dit punt, beeld het weefsel of bewaar bij -20 ° C gedurende 1 week later beeldvorming.

Buffer / Solution Recepten

10x PBS

• 80 g NaCl
• 2,0 g KCl
• 14,4 g Na ₂ HPO ₄
• 2,4 g KH ₂ PO ₄
• pH 7,4, H ₂ O tot 1 L

1x PBT

• 5 ml 10x PBS
• 45 ml _H2O
• 0,1% Tween 20

20x SSC

• 175.3 g NaCl
• 88,2 g Nacitraat
• in 800 ml _H2O
• pH 7 H ₂ O tot 1 L

4x SSCT

• 200 ml 20x SSC
• 799 ml _H2 O
• 0,1% Tween 20

0.1x SSC

• 5 ml 20x SSC
• 995 ml _H2O

Hybridisatie mix (20 pl, gemodificeerd van ¹¹⁾

• 10 pl formamide
• 4 ui 50% dextransulfaat
• 2 pl 20x SSC
• 4 ui _H2O

SBT ⁸ (10 ml)

• 2 ml 20x SSC
• 0,01 g runderserumalbumine (BSA)
• 10 ul Tween 20
• 7,9 ml _H2O

Blokkeeroplossing ⁸ (10 ml)

• 0,3 g BSA
• 10 ul Tween 20
• 2 ml 20x SSC
• 8 ml _H2O

Fixatief met paraformaldehyde (1 ml)

• 393,75 pi H ₂ O (water toevoegen als eerste)
• 450 ul ijsazijn
• 156,25 pl 16% paraformaldehyde

Resultaten

Om deze methode te demonstreren we gehybridiseerd een reeks kleine commercieel gesynthetiseerde oligonucleotiden die chemisch zijn gemodificeerd met fluorescente conjugaten (figuur 2) en een langere gebiotinyleerd probe (gemaakt door nick translatie van een PCR-product Figuur 2B) om chromosomen van verschillende weefsels soorten (zie tabel 1). De doelwitsequenties satelliet opgenomen herhalingen gelegen in pericentromerische (heterochromatische) regio's van mitotisc...

Discussie

DNA ISH wordt vaak gebruikt om specifieke sequenties met chromosomen in kaart. We hebben een eenvoudige methode voor DNA-ISH geoptimaliseerd voor een groot aantal kopieën, heterochromatische sequenties beschreven. In plaats van het gebruik wast in een formamide oplossing, wat een vereiste is in andere bestaande DNA-ISH protocollen, plaatsen we weefsel gemonteerde dia's direct op een voorverwarmd blok aan DNA denatureren. Deze werkwijze omzeilt het gebruik van grote hoeveelheden formamide. Een cruciale stap voor het ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)	Sigma Aldrich
Ultrafijne pincetten (5 gauge)	Dumont
22 x 22 mm dekglasjes	Fisher		Sigmacote-behandeld door 15 seconden onderdompelen, afdrogen en alle sporen van Sigmacote wegvegen zodat het dekglas helder is
Sigmacote	Sigma
Filterpapier			75 - 150 mm
Paraffinewaspapier
Verwarmingsblok met thermometer
Droge incubator
Veshaaiers
Vochtigheidskamer			lege pipettipbox of Tupperware, bekleed met vochtige papierhanddoeken of Kimwipes
Coplin-potten			met gleufjes voor de slides
Alumiiniumfolie
Pasteur-pipetten
1,5 ml microcentrifugebuisjes
Nailpolish			helder of gekleurd
P20 micropipet en plastic punten
Paperclips			20 - 25 standaard metalen paperclips aan elkaar gelinkt om een ketting te vormen
Reagentia
16% EM-kwaliteit paraformaldehyde	Electron Microscopy Reagents
Azijnzuur	Sigma
Vloeibare stikstof
100% Ethanol, chemisch zuiver
Commercieel gesynthetiseerde, fluorescerend gelabelde oligo's
Lange biotinylering probe	Invitrogen; Alternatieve stappen 2.7.1-2.7.3		bijv. nick vertaald en biotinyleerd met BioNick van Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Alternatieve stappen 2.7.1-2.7.3		voor detectie van lange biotinylering probe
Hybridisatiebuffer	Recept hierboven
4x SSCT	Recept hierboven		saline-natriumcitraat + Tween
0,1x SSC	Recept hierboven		saline-natriumcitraat
Blokkaloplossing	Recept hierboven
SBT	Recept hierboven		SSC, bovien serumalbumine, Tween
1x PBT	Recept hierboven		fosfaat-gebufferde zoutoplossing + Tween
1x PBS			fosfaat-gebufferde zoutoplossing
Hypotone oplossing			0,5% natriumcitraat in H2O
Formamide	Sigma Aldrich
Vectashield montagemedium met DAPI	Vector laboratories