Muis Pneumonectomie Model van Compenserende Lung Groei

Samenvatting

Muizen pneumonectomie is een veel gebruikt model van compenserende longgroei. Deze procedure kan worden gebruikt in combinatie met lijn tracing of transgene muismodellen om de onderliggende mechanismen te verduidelijken.

Samenvatting

Bij mensen draagt verstoord herstel en remodellering van een beschadigde long bij aan een reeks acute en chronische longaandoeningen die uiteindelijk kunnen leiden tot invaliditeit of de dood. Diermodellen voor longherstel en regeneratie op basis van letsel worden beperkt door letselspecifieke reacties, waardoor het moeilijk wordt om veranderingen die verband houden met de letselreactie en letselresolutie te onderscheiden van veranderingen die verband houden met longherstel en longregeneratie. Het gebruik van diermodellen om deze signaalroutes voor herstel en regeneratie te identificeren, is echter van cruciaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën gericht op het verbeteren van de longfunctie na longletsel. Het muis pneumonectomiemodel maakt gebruik van compenserende longgroei om die herstel- en regeneratiesignaalroutes te isoleren om de mechanismen van alveolaire herseptatie duidelijker te definiëren. Hier beschrijven we onze techniek voor het uitvoeren van muis pneumonectomie en sham pneumonectomie. Deze techniek kan worden gebruikt in combinatie met lijnage tracering of andere transgene muismodellen om de moleculaire en cellulaire mechanismen van longherstel en regeneratie te definiëren.

Inleiding

De hoofdfunctie van de long te voorzien van zuurstof en kooldioxide uitwisseling tussen een organisme en de atmosfeer. Bij de mens, een gastheer van aangeboren en verworven voorwaarden leiden tot een verminderde oppervlakte long gebied, wat resulteert in verminderde longfunctie. Dwz long - hoewel een groot aantal therapieën zoals inhalatiecorticosteroïden, bronchodilatoren, extra zuurstof en chronische mechanische ventilatie wordt gebruikt om de gevolgen van verminderde longfunctie ^1-3 beperken, zou de ideale therapie voor deze aandoeningen hergroei van functionele longweefsel bevorderen regeneratie.

Zoogdieren weefselregeneratie is goed gedocumenteerd. De Afrikaanse Stekelmuizen kunnen grote delen van de huid te regenereren zonder littekenvorming ^4. De distale falanx in de mens kan regenereren na letsel of amputatie ^5-7. Na pneumonectomie (PNX), compenserende long groei optreedt bij muizen ^8, ratten ^9, doengs ¹⁰ en ¹¹ mens. Per definitie, compenserende long groei gaat het niet alleen uitbreiding van bestaande luchtruim, maar opnieuw septatie van deze vergroot luchtruim met de uitbreiding van de bijbehorende microcirculatie ^12. Genexpressie analyse heeft aangetoond dat dit model recapituleert veel van de signalering evenementen van longontwikkeling ^13. Vier weken na muis PNX, alveolaire oppervlakte gelijk is aan die van schijn geopereerde dieren ^14. In dit manuscript, beschrijven we de muis PNX en sham PNX procedures.

Protocol

OPMERKING: Animal gebruik statement: Alle procedures in deze studie werden uitgevoerd met toestemming en volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Gebruik en onderhoud Comité (IACUC) in Cincinnati Children's Hospital. Acht weken oude C57BL / 6J mannelijke muizen werden verkregen van Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) en men acclimatiseren gedurende één week vóór gebruik. Tot de operatie werden de dieren gehuisvest in een pathogeenvrije barrière-faciliteit en voorzien geautoclaveerd chow en gefilterd water ad libdium. Elke muis kooi werd geleverd met een toegewijde lucht en water, en de kamers werden op een 12 uur per dag-nacht cyclus gehandhaafd. Na herstel van een operatie, werden muizen gehouden in kooien met gefilterd tops, mits geautoclaveerd chow advertentie libidum, en gefilterd water uit een fles water.

1. Voorbereiding van de instrumenten

1. Maak 6 huid retractors behulp van paperclips en pennen. Twist rechtgetrokken paperclips op de schachten van papier pennen, leave een 5 cm rechte staaldraad aan één uiteinde en een eenmalige 0,5 cm "U" vormige haak aan het einde van de draad.
2. Maak ongeveer 15 x 15 cm in het vierkant operatielakens gebruik van plastic wrap. Bereid een dressing per muis. Plaats een papieren toren in tussen elke wrap.
3. Steriliseer alle chirurgische instrumenten met een stapel van 12 x 12 inch kurk tegels, gaas en wattenstaafje swabs.

2. Muis Voorbereiding

1. Induceren anesthesie met 2% isofluraan. Wegen dier.
2. In een speciale chirurgische preparaat scheren linker thorax-halsgebied met elektrische scheerapparaat.
3. Breng een druppel van de kunstmatige traan zalf ogen van de muis.
4. Ontsmet nek en linker thorax met chloorhexidine en isopropylalcohol. Herhaal tweemaal.

3. Mouse Oro-tracheale intubatie en mechanische ventilatie

1. Hebben een niet-steriele chirurgische technicus plaats de muis rugligging in de voorverwarmde chirurgisch gebied.
2. Bevestigen diepte van de anesthesie door het documenteren van het ontbreken van een antwoord op de poot knijpen.
3. Na het wassen van de handen en het aantrekken van chirurgische kleding, masker en hoed, don steriele chirurgische handschoenen.
4. Na draperen en met behulp van aseptische techniek, maak een 1 cm verticale incisie over het voorafgaande midden-hals aan het strottenhoofd bloot. Licht inschuiven band spieren gebogen gekartelde 10 cm pincet en het strottenhoofd en luchtpijp bloot door het verspreiden van de band spieren met de punt van een rechte schaar.
5. Mondeling plaats een 22 G met stompe tip angiocatheter in het midden van de luchtpijp (Figuur 1A) en visueel te bevestigen plaatsing (Figuur 1B). Onderhouden anesthesie en ventileren met behulp van 1-3% isofluraan door knaagdieren ventilator (225 ul per slag; 200 stookt per min). Gebruik een druk limiet van 15 cm H ₂ O.

4. Muis Pneumonectomie

1. Leg de muis in de rechter laterale decubitus positie rug van de muis gerichtde operator (links boven). Gebruik een zelfdichtende plastic folie als een steriel laken. Snijden door het laken, gebruiken stompe getipt gebogen schaar om een 2 cm lange snede evenwijdig met de ribben bij het ​​4 ^e en 5 ^e intercostale ruimte. Steek de stompe punt gebogen schaar en ontleden de huid weg van de onderliggende ribben en intercostale spieren.
2. Trek de huid met vier retractors om een vierkant bloot 1,5 x 1,5 cm chirurgische venster (Figuur 2A). Bevestig de oprolmechanismen aan de kurk boord.
3. Ontleden tot op ribben met behulp van gebogen pincet, en gebruik een tip van de gebogen tang om de borstholte te voeren.
4. Met behulp van de stompe punt van micro-schaar, gebruikt u de onderste mes om de borstholte te voeren. Maak een 0,5 cm incisie tussen de ribben en herhaal in tegengestelde richting.
5. Met behulp van de twee resterende retractors, open de thorax in de anterior-posterior-as en de veilige de oprolmechanismen aan de kurk boord (Figuur 2B).
6. Het gebruik van gebogen stompe getipt tang in de linker hand de linker long en verdringen het bovenste gedeelte van de linker long lateraal en inferiorly door de thoracotomie totdat de linker longslagader en bronchus worden blootgesteld (figuur 3A, B).
7. Houdt de belaste titanium vasculaire microclip applicator in de rechterhand met het lichaam van de applicator in de palm en gebogen tip weg richt vanuit de palm (Figuur 3C), schuif de applicator tip in de thorax langs de kromming van het achterste deel van de linker long en clip de linker bronchus en de longslagader (Figuur 3D).
8. Verwijder de applicator maar houd de linker long ingetrokken. Pak de stompe punt van micro-schaar met de rechterhand en snijd de bronchus en longslagader distaal van de clip en verwijder de linker long (figuur 3E).
9. Verwijder de rib retractors.
10. Gebruik de gebogen stompe pincet te knijpen tot 1 cm van de huid inferieur aan de incisiop maar boven het niveau van het membraan en plaats een 24 G angiocatheter door de huid en in de linker borstholte (Figuur 4A, B).
11. Gebruik 5-0 Prolene hechtdraad twee onderbroken hechtingen rond de ^4de en ^5de ribben plaatsen naar de borstholte gesloten.
12. Verwijder de huid retractors. Gebruik twee sets pincetten om de huid langs de lengte van de incisie benaderen en lijm de huid gesloten.
13. Sluit een 3 ml luerlockspuit de angiocatheter en verwijder resterende lucht door het toepassen van zachte zuigkracht en het intrekken van de angiocatheter.
14. Lijm de nek incisie gesloten met twee pincetten als voorheen.

5. Mouse Sham Pneumonectomie

1. Expose de linker long zoals vermeld in "Muis Pneumonectomie" protocol. Til de ribbenkast met gebogen stompe tang om lucht in de linker borstholte (figuur 5A, B).
2. Plaats een 24 G angiocatheter in de linker thoRacic holte zoals hierboven zorg dat u de linker long niet te verwonden.
3. Met behulp van een 5-0 prolene hechtdraad en zorg dat u de long (figuur 5C) niet te doorboren, plaatst u twee lengtes van hechtmateriaal in de 3 ^e / 4 ^e en 5 ^e / 6 ^e rib tussenruimtes (Figuur 5D). Plaats beide lengten hechtmateriaal alvorens binden aan het risico van linker long hernia verminderen. Bind het hechtmateriaal tot twee onderbroken steken (figuur 5E) te maken.
4. Lijm de huid over de thoracale incisie, verwijder resterende lucht met de angiocatheter, en lijm de nek incisie als hierboven.

6. Reanimatie, analgesie, en Recovery

1. Schakel de isofluraan en toedienen van 0,1 mg / kg buprenorfine en 0,5 ml normale zoutoplossing subcutaan.
2. Wanneer spontane ademhaling hervat, verwijder de endotracheale tube.
3. Observeren muis totdat het weer ambulant. Wandelen meestal Resumes enkele minuten nadat de endotracheale tube.
4. Plaats de muis in een 27 ° C incubator (bevochtigde, 25% zuurstof) om O herstellen / N.
   LET OP: Wij plaatsen verschillende pellets van chow bevochtigd met water op de vloer van de kooi voor de eerste 24 uur na de operatie.
5. Dien 0.1 mg / kg buprenorfine door intraperitoneale injectie tweemaal daags gedurende drie dagen na de operatie. Zorg ervoor dat u de operatiewond te openen bij de omgang met dieren.

7. Mouse Monitoring

1. Weeg muizen 1, 3, 5 en 7 dagen na de operatie.

Resultaten

. Een perceel van PNX en schijngeopereerde muis gewichten wordt gegeven in Figuur 6 In onze handen, overleving is consequent 95-100% voor zowel PNX en sham pneumonectomie. Voor een beschrijving van de wijze waarop de rechter long opnieuw groeit in dit model en het verwachte tijdsverloop, verwijzen we de lezer naar manuscripten van Gibney et al. ¹⁵ en Wang et al. ¹⁴

Een aantal gemeenschappelijke valkuilen moet vermeden worden om de muis...

Discussie

We hebben de meest gedetailleerde beschrijving van de muis PNX en muis schijnvertoning PNX procedures gemeld to-date. We hebben de lezer op de hoogte van een aantal van de gemeenschappelijke valkuilen die de onderzoekers leren van de procedure doorgaans tegenkomen gemaakt, en we hebben een aantal technieken ontwikkeld door ons laboratorium te verzachten tegen deze valkuilen geschetst. Andere laboratoria met behulp van dit model kunnen andere techniek aanpassingen hebben ontwikkeld of maken gebruik van verschillende inst...

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6 inch Vascular clip applicator	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon small titanium red clip	Teleflex Medical (WECK)	1201
Narrow pattern 12 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Curved serrated 10 cm Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
Castroviejo needle holder	Fine Science Tools	12565-14
Straight 9 cm Strabismus scissors (blunt tip)	Fine Science Tools	14075-09
Straight 8.5 cm hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Straight, blunt tip Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-12
Skin glue	Gluture	32046
22 G Angiocatheter
24 G Angiocatheter
3 ml Luer lock syringe
4 Short retractors
2 Long retractors
5-0 Prolene on curved cutting needle	Ethicon	8698G
0.5 ml Syringe on 27 G needle
Normal saline
Buprenorphine
Press-n-Seal wrap	Glad Products Company
12 x 12 inch Cork board stack	Office Depot
70% Ethanol
Betadine
Mouse ventilator	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Type 845
Isoflurane vaporizer	OHMEDA	Excel 210 SE
Artificial tear ointment	Puralube	NDC: 17033-211-38

```