Het doel van deze techniek is om onderzoekers in staat te stellen dissectie, immunokleuring en montage van poppenoogschijfjes uit Drosophila melanogaster van elke leeftijd uit te voeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het Drosophila melanogaster oogschijfje is een krachtig systeem dat kan worden gebruikt om vele verschillende biologische processen te bestuderen. Het bevat ongeveer 800 afzonderlijke oogeenheden, ommatidia1 genoemd. Elk ommatidium bevat acht neuronale fotoreceptoren die zich ontwikkelen uit ongedifferentieerde cellen na het passeren van de morfogenetische golf in het derde larvale stadium2. Na de opeenvolgende differentiatie van de fotoreceptoren, ontwikkelen zich niet-neuronale cellen, inclusief kegel- en pigmentcellen, samen met mechanosensorische borstelcellen3. De laatste differentiatieprocessen, inclusief de gestructureerde rangschikking van alle ommatidiale celtypen, geprogrammeerde celdood van ongedifferentieerde celtypen en rhodopsine-expressie, vindt plaats tijdens de pop-fase4-7. Deze techniek richt zich op het manipuleren van de pop-oogschijf, en geeft inzicht en instructie over hoe de oogschijf tijdens de pop-fase te disseceren, wat inherent moeilijker is dan de veelgebruikte dissectie van de oogschijf in het derde stadium. Deze techniek geeft ook details over immunokleuring om de visualisatie van verschillende eiwitten en andere celcomponenten mogelijk te maken.
Inleiding
Het gebied van ontwikkelings- en celbiologie zijn sterk beïnvloed door het modelorganisme: Drosophila melanogaster. Binnen dit model, hebben studies van het oog schijf een veel kennis met betrekking tot signalering, celbiologie en andere gebieden bijgedragen. De late derde larvale oog instar disc is uitgebreid bestudeerd en is een krachtig model te gebruiken, want het geeft een momentopname van een reeks van ontwikkelings periodes, elk met zijn eigen unieke signaalmoleculen en processen, het morfogenetisch groef vordert in het oog disc 8. Er is echter behoefte aan begrip van ontwikkelingsprocessen verder uit in het popstadium ontwikkelingsfase. Ho....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze procedure is een 2 daagse procedure.
Dag 1 (2 uur + ontleden tijd)
1. Pupal Disc Eye Dissection
- Selecteer een pop voor dissectie.
OPMERKING: De leeftijd van de pop ontleed wordt bepaald door de experimentele behoeften. Indien behandeling celmorfologie wordt dit vaak gedaan op 42 uur na verpopping formatie (APF) bij 25 ° C, de leeftijd van het in beeld poppen. Verzamel witte poppen (beschouwd 0 hr APF) met een bevochtigde penseel en schik ze in chronologische volgorde (op basis van de collectie tijd) in een nieuwe vlieg voedsel flacon gehandhaafd op 25 ° C. Ontleden oude poppen in dezelfde chro....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Als voorbeeld van het gebruik van dit protocol, resultaten illustreren midpupal (42 uur APF bij 25 ° C) oog discs immunostained verschillende antilichamen zijn weergegeven in figuur 2. Door een antilichaam gericht tegen fosfotyrosine residu kan het membraan van de cellen waargenomen (Figuur 2A). Dit kan worden gebruikt om de regelmatige rangschikking van ommatidial cellen in het popstadium oog identificeren na het laatste patroon processen die vóór de midpupal stadium plaatsvinden. Een ander representat.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel het lijkt alsof het proces eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren is, vereist deze techniek in werkelijkheid veel oefening om onder de knie te krijgen. Normaal gesproken laten we studenten beginnen met het leren dissecteren en monteren van derde instar oogdisci12, die veel gemakkelijker te hanteren zijn. Deze oefening helpt om een geschikte dissectiepositie van de armen, handen en vingers13 te ontwikkelen, zodat de manipulatie van de forceps onder de dissectiemicroscoop stabiel, gemakkelijk.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We waarderen en willen het Howard Hughes Medical Institute bedanken voor de HHMI Professor award aan U.B. die dit project mogelijk heeft gemaakt. We danken het college van de University of California, Los Angeles voor het bieden van faciliteiten en onderwijsinfrastructuurondersteuning voor dit werk. Het werk werd ook ondersteund met financiering van Midwestern University en een genereuze donatie van de Charity Fidelity Gift Fund. We danken John VandenBrooks voor zijn opmerkingen over het manuscript en Krista Pearman voor haar technische assistentie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Breng volume tot 1 μl, pas de pH aan tot 7.4, autoclaveer of filter steriliseer, verdun tot 1x PBS met geautoclaveerde ddH2O voor gebruik. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Let op: Irritator! Draag handschoenen. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml van Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehydeoplossing | Fisher Scientific | F75P1GAL | Let op: Toxisch, waarschijnlijk menselijk carcinogeen! Draag handschoenen. |
| Fix-oplossing | (≈4% formaldehyde in PBS) 50 μl van 37% formaldehyde, 450 μl 1x PBS, maak vers voor gebruik | ||
| Normaal geitenserum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliteren in volumes van 1 ml en bewaar bij -80 °C |
| Blok-oplossing | 10% NGS in PBT. Dit kan worden gemaakt en bewaard bij 4 °C voor een paar dagen voor gebruik. | ||
| DAPI-stockoplossing | Life Technologies | D3571 | Voor tegenkleuring van kernen. Bereid een oplossing van 1 mg/ml met ddH2O. |
| VectaShield Montagemedium | Vector Labs | H-1000 | Montagemedium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Voor montage. Bereid 70% verdunning met ddH2O. |
| Apparatuur | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Gebruikt om weefsel in 3-well glazen schaal te wiebelen |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Gebruikt om een siliconen dissectieschaal te maken |
| Siliconen dissectieschaal | Meng Sylgard elastomer kit (bovenstaand) volgens de aanwijzingen voorzichtig (om bellen te voorkomen). Giet mengsel in petrischaal (elke maat). Laat SylGard overnacht in 37 °C incubator uitharden. | ||
| 3-well glazen schaal | Corning | 7220-85 | De 3-well variant hiervan is niet langer verkrijgbaar, dit is het 9-well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Recht, 5mm mes | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicaat glas capillaire | World Precision Instruments | 1B100-4 | Trek met naaldtrekker om een fijn punt te maken waardoor een kleine stroom PBS kan stromen. |
| Disposable Transfer Pipetten, Fijne punt | Samco Scientific | 231 | |
| De afmetingen van de slangen zijn gegeven in binnendiameter (ID) x buitendiameter (OD) x wanddikte in inches | |||
| PVC slang (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Gebruik deze met getrokken naald om de blazerbuis te assembleren zoals getoond in Figuur 2. |
| Tygon Silicone slang (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone slang (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
Referenties
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
