Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Prionei zijn onconventionele zelf-propagerende eiwitdeeltjes, verstoken van enig coderend nucleïnezuur. Deze eiwitzaden dienen als sjablonen voor de omzetting en replicatie van hun goedaardige cellulaire isovorm. Toenemend bewijs suggereert dat veel eiwitaggregaten kunnen fungeren als zelf-propagerende sjablonen en het vouwen van cognate eiwitten kunnen corrupten. Hoewel aggregaten onder bepaalde omstandigheden functioneel kunnen zijn, leidt dit proces vaak tot verstoring van de cellulaire eiwithomeostase (proteostase), wat uiteindelijk kan leiden tot verwoestende ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), Amyotrofische laterale sclerose (ALS) of overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's). De exacte mechanismen van prion-propagatie en cel-tot-cel verspreiding van eiwitaggregaten zijn nog steeds onderwerp van intens onderzoek. Om deze kennis te bevorderen, is onlangs een nieuw metazoaan model in Caenorhabditis elegans, voor expressie van het prion-domein van het cytosolische gist-prioneiwit Sup35, gevestigd. Dit prionmodel biedt verschillende voordelen, aangezien het directe monitoring van het fluorescerend gelabelde prion-domein in levende dieren mogelijk maakt en genetische benaderingen vereenvoudigt. Hier worden methoden beschreven om prionachtig gedrag van eiwitaggregaten te bestuderen en om modifiers van prion-geïnduceerde toxiciteit te identificeren met behulp van C. elegans.
Inleiding
Vele neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), en overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's), worden geassocieerd met aggregerende eiwitten en daarmee gezamenlijk bekend als eiwit misfolding stoornissen (PMDs ). TSE of prion ziekten vormen een unieke klasse van PMDs doordat zij infectieuze bij mens en dier 1 kan zijn. Op moleculair niveau, prionen repliceren door het aantrekken en het omzetten van monomere α-helix-rijk-gastheer gecodeerd cellulaire PrP (PrP C) in de pathologische β-sheet-rijke Prpsc conformatie 2,3. Ze....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Monitoring transcellulaire Verspreiding van prion-achtige eiwitten door In Vivo Time-lapse Imaging
OPMERKING: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) en transgene lijnen volgens standaardwerkwijzen en de kweektemperatuur 47 zorgvuldig regelen.
- Genereren van transgene lijnen van C. elegans uiting van de prion-achtige eiwitten, gelabeld met monomere rood fluorescerend eiwit (mRFP). Bekijk deze video die laat zien hoe micro-injectie 48 gebruiken. Voor verdere details en methoden beschrijven hoe deze extrachromosomal lijnen integreren, zie 49.
- Bereid gesynchronise....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Monitoring intercellulaire verspreiding van prion-achtige eiwitten door in vivo time-lapse imaging
Transgene C. elegans lijnen expressie de prion domein zijn bijzonder geschikt voor de analyse van bepaalde aspecten van prion-achtige eiwitten, bijvoorbeeld cel tot cel transmissie en niet cel autonoom toxiciteit. De transparantie van de dieren maakt het bijhouden van fluorescent gelabelde eiwitten vanuit het levende organisme in elke fase van het lev.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier beschreven methoden helpen om te illustreren de verspreiding en de complexe cel autonome en niet-autonome cel toxiciteit van prion-achtige eiwitten. We hebben onlangs ontdekt dat een aggregatie-gevoelige cytosole prion domein wordt opgenomen in membraangebonden blaasjes in een autofagie gerelateerde proces. Een specifieke subgroep van deze vesicles transporteert het prion domein binnen en tussen cellen en weefsels 40. De sleutel tot hun beweging in het levende dier volgen is dat het eiwit moet worden .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
We danken Cindy Voisine en Yoko Shibata voor nuttige discussies en kritische opmerkingen over het manuscript. We erkennen de High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) en de Biological Imaging Facility (BIF) aan de Northwestern University voor hun hulp. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), de Ellison Medical Foundation en de Daniel F. en Ada L. Rice Foundation (aan R.I.M.). C.I.N.-K. werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Nanosphere size standards 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi library | Source BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ | |
| Equipment | |||
| Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
| 96 pin replicator | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| HiGro high-capacity, incubating shaker | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 Automated Workstation | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 shaker | New Brunswick | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389 | |
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| Spinning Disc AF Confocal Microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 camera | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| Software | |||
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| wrMTrck plugin for ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| C. elegans strains | |||
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Morimoto lab | available from our laboratory | |
| See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains |
Referenties
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
