Methodenartikel

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme

16.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52321

⸱

8 januari 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

In dit artikel

Samenvatting

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Samenvatting

Prionei zijn onconventionele zelf-propagerende eiwitdeeltjes, verstoken van enig coderend nucleïnezuur. Deze eiwitzaden dienen als sjablonen voor de omzetting en replicatie van hun goedaardige cellulaire isovorm. Toenemend bewijs suggereert dat veel eiwitaggregaten kunnen fungeren als zelf-propagerende sjablonen en het vouwen van cognate eiwitten kunnen corrupten. Hoewel aggregaten onder bepaalde omstandigheden functioneel kunnen zijn, leidt dit proces vaak tot verstoring van de cellulaire eiwithomeostase (proteostase), wat uiteindelijk kan leiden tot verwoestende ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), Amyotrofische laterale sclerose (ALS) of overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's). De exacte mechanismen van prion-propagatie en cel-tot-cel verspreiding van eiwitaggregaten zijn nog steeds onderwerp van intens onderzoek. Om deze kennis te bevorderen, is onlangs een nieuw metazoaan model in Caenorhabditis elegans, voor expressie van het prion-domein van het cytosolische gist-prioneiwit Sup35, gevestigd. Dit prionmodel biedt verschillende voordelen, aangezien het directe monitoring van het fluorescerend gelabelde prion-domein in levende dieren mogelijk maakt en genetische benaderingen vereenvoudigt. Hier worden methoden beschreven om prionachtig gedrag van eiwitaggregaten te bestuderen en om modifiers van prion-geïnduceerde toxiciteit te identificeren met behulp van C. elegans.

Inleiding

Vele neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), en overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's), worden geassocieerd met aggregerende eiwitten en daarmee gezamenlijk bekend als eiwit misfolding stoornissen (PMDs ). TSE of prion ziekten vormen een unieke klasse van PMDs doordat zij infectieuze bij mens en dier 1 kan zijn. Op moleculair niveau, prionen repliceren door het aantrekken en het omzetten van monomere α-helix-rijk-gastheer gecodeerd cellulaire PrP (PrP C) in de pathologische β-sheet-rijke Prpsc conformatie 2,3. Zelf propageren eiwit aggregaten zijn ook geïdentificeerd in schimmels, die belangrijke kenmerken van zoogdieren prionen 4,5 delen. Daarnaast zoogdieren prionen kunnen verplaatsen van cel tot cel en infecteren naïeve cellen 6,7.

Terwijl PMDs other dan TSE's zijn niet besmettelijk, ze delen een gemeenschappelijke pathogene principe met prionziekten 8,9. Hoewel de eiwitten verbonden aan elk van de PMDs niet verbonden zijn in structuur of functie, ze vormen aggregaten via een kristallisatieproces-achtige proces genaamd kiemvorming of geënt polymerisatie; bovendien eiwithoudende zaden te laten groeien door het aantrekken van hun oplosbare isovormen 2,10,11. De efficiëntie zichzelf propageren varieert in vivo afhankelijk van de intrinsieke eigenschappen van het eiwit, die samen met andere cellulaire factoren zoals moleculaire chaperones tarieven aggregaat kiemvorming, zaaien, fragmentatie en verspreiding 12-15 uiteindelijk bepalen. Daarom moet er een goede balans tussen deze factoren efficiënte propagatie van eiwit aggregatie toelaat bestaan. Dit zou ook verklaren waarom slechts enkele amyloïdogene aggregaten haven de kenmerken van een prion, en dus niet alle PMDs zijn besmettelijk. Prionen lijken o 'top-performers' vertegenwoordigenfa breed spectrum van zelfreplicerende eiwitachtige aggregaten, waardoor ze een krachtig hulpmiddel om PMDs 8,13 studeren maakt.

Intrigerend de toxiciteit geassocieerd met ziekte gerelateerde aggregaten vaak niet cel autonoom component 16,17. Dit betekent dat zij invloed naburige cellen die geen expressie het overeenkomstige gen, in tegenstelling tot een strikt cel autonoom effect, wat impliceert dat alleen de cellen die het gen vertonen specifieke fenotype. Deze werd overtuigend aangetoond door weefsel-specifieke expressie of neerhalen van de respectievelijke eiwitten in tal van modellen van neurodegeneratieve ziekten 18-26. Verschillende mechanismen zijn voorgesteld als basis voor deze niet-cel autonome toxiciteit in PMDs, waaronder verminderde toevoer van voedingsstoffen, onbalans in neuronale signalering, glutamaat excitotoxiciteit en neuroinflammation 16,27,28. Bovendien, een prion-achtige beweging van ziekte gekoppelde aggregaten tussen cellen might dragen bij aan dit aspect 29,30. Meer bewijs suggereert dat andere eiwitten insluitsels dan prionen kan overbrengen van cel-cel, wat kan verklaren de karakteristieke verspreiding pathologie waargenomen in vele PMDs 30-36. Echter, het is nog te bepalen of er een duidelijk oorzakelijk verband tussen de intercellulaire beweging van ziekte-eiwitten en het toxische effect op naburige cellen. Daarom is een beter begrip van de cellulaire routes die cel tot cel transmissie en niet cel autonoom toxiciteit grondslag liggen noodzakelijk en essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutica. Maar veel aspecten van prion-achtige verspreiden en cellulaire factoren die cel tot cel transmissie van verkeerd gevouwen eiwitten beïnvloeden metazoa niet goed begrepen, in het bijzonder op organismale niveau.

De nematode Caenorhabditis elegans heeft een aantal voordelen die het potentieel heeft ontdek nieuwe facetten van prion-achtige spreading in metazoa 17. Het is transparant, waardoor in vivo volgen van fluorescent gelabeld eiwitten in de levende organisme. Verder veel cellulaire en fysiologische processen die door ziekte zijn geconserveerd tegen wormen menselijke en C. elegans ook geschikt zijn voor een breed scala van genetische manipulatie en moleculaire en biochemische analyses 37-39. Precies 959 somatische cellen vormen de volwassen hermafrodiet met een eenvoudige lichaam plan dat nog steeds heeft een aantal verschillende soorten weefsel, met inbegrip van de spieren, neuronen en darm.

Om een nieuwe prion model in C. vestigen elegans, kozen we ervoor om exogeen drukken de goed gekarakteriseerd glutamine / asparagine (Q / N) rijke prion domein NM van de cytosole gist prion eiwit Sup35, aangezien er geen bekende endogene prion-eiwitten in wormen 4,40. Gist prionen zijn van onschatbare waarde in het ophelderen van fundamentele mechanismen van prion replicatie 41-44 geweest. Bovendien, NM is de sparst cytosolische prion-achtige eiwit dat is aangetoond dat de volledige levenscyclus van een prion recapituleren in zoogdiercelkweek 45,46. Ook bij expressie in C. elegans, het opmerkelijk goed vastgesteld aan de verschillende vereisten voor propagatie in metazoan cellen vergeleken met gistcellen vertoonden belangrijkste kenmerken van prion biologie 40. NM aggregatie geassocieerd met een ernstige toxische fenotype, zoals verstoring van mitochondriale integriteit en het uiterlijk van Sup35 prion domein verschillende autophagy gerelateerde blaasjes op cellulair niveau, alsmede embryonale en larvale arrestatie, ontwikkelingsachterstand en een wijdverspreide verstoring van de eiwitvouwing omgeving op het organismale niveau. Opvallend het prion domein vertoont cel zelfstandige en niet cel autonoom toxiciteit, die naburige weefsels waarin het transgen niet tot uitdrukking. Verder wordt de vesiculaire transport van het prion-domein binnen en tussen cellen gecontroleerd real time In vivo 40.

Hier beschrijven we hoe u prion-achtige verspreiding in C. onderzoeken elegans. We zullen uitleggen hoe de intra- en intercellulaire transport van blaasjes met daarin het prion domein met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie te monitoren. We zullen het gebruik van weefsel-specifieke vouwen sensoren benadrukken en alomtegenwoordig uitgedrukt stress-verslaggevers naar cel autonome en niet-cel autonome effecten op cellulair conditie te bepalen. Ten slotte zullen we de procedure van een onlangs uitgevoerde genoomwijde RNA interferentie (RNAi) scherm te beschrijven om nieuwe modifiers van prion-geïnduceerde toxiciteit identificeren. Tezamen kunnen deze werkwijzen helpen plagen elkaar genetische routes betrokken bij de intercellulaire beweging van eiwitten en hun niet cel autonoom toxiciteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Monitoring transcellulaire Verspreiding van prion-achtige eiwitten door In Vivo Time-lapse Imaging

OPMERKING: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) en transgene lijnen volgens standaardwerkwijzen en de kweektemperatuur 47 zorgvuldig regelen.

  1. Genereren van transgene lijnen van C. elegans uiting van de prion-achtige eiwitten, gelabeld met monomere rood fluorescerend eiwit (mRFP). Bekijk deze video die laat zien hoe micro-injectie 48 gebruiken. Voor verdere details en methoden beschrijven hoe deze extrachromosomal lijnen integreren, zie 49.
  2. Bereid gesynchroniseerd populatie door het leggen van eieren of bleken volgens standaardmethoden 50.
    1. Synchronisatie van de eileg
      1. Transfer 10-20 gravid volwassenen op een bord en laat ze eitjes leggen voor 1-2 uur. Verwijder volwassenen uit de plaat en laat het nageslacht te laten groeien tot de gewenste leeftijd.
    2. Synchronisatie door bleken
      1. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van zwangere volwassenen en bleken ze met alkalische hypochlorietoplossing (250 mM NaOH en 1: 4 (v / v) verdunning van commercieel bleekmiddel in H2O). Was de eieren twee keer (218 g gedurende 1 min) met M9 buffer 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, voeg dH 2 O tot 1 L).
      2. Laat ze uitkomen in M9 buffer zacht schudden O / N bij 20 ° C. Ontwikkeling worm arresteren L1 fase in afwezigheid van een voedingsbron, waardoor een gesynchroniseerde bevolking. Transfer L1s op verse Nematode Growth Media (NGM) platen bezaaid met OP50 E. coli bacteriën en laat het nageslacht te ontwikkelen tot de gewenste 47-jarige leeftijd.
  3. Bereid 2% agarose pads (in H2O) op een microscoopglaasje beschreven 50.
    1. Bereid twee microscope dia etikettering tape die over hun gehele lengte worden gebruikt als afstandhouders. Plaats een derde microscoopglaasje daartussen.
    2. Los 2% agarose in H 2 O en de pipet een druppel op de schone dia.
    3. Plaats een vierde dia loodrecht op de drie glijbanen bovenop de agar vallen. Druk voorzichtig naar het pad plat dezelfde dikte als de etikettering tape.
    4. Laat het drogen gedurende 1 minuut voordat u de afstandhouders en de dia's voorzichtig te trekken uit elkaar. De agarkussen zal vasthouden aan een van hen.
  4. Pipet ~ 10 ul verdoving (2 mM levamisol in M9 buffer) aan de pad en de overdracht ~ 10 dieren met behulp van een platina draad pick. Dek af met een deksel slip (~ 22 x 22 mm) en neem beelden in 1 uur.
  5. Als alternatief, om films te verwerven over een langere periode van tijd of om de mogelijkheid van elke beweging van de dieren verder te verminderen, gebruik maken van een combinatie van verdoving en kraal immobilisatie 51.
    1. Bereid 10% agasteeg pads (in M9 buffer), zoals beschreven 51 en wormen tot 3 pi nanosfeer grootte normen oplossing (polystyreen korrels, 100 nm) plus 3 pi verdoving (4 mM levamisol in M9 buffer) toe te voegen. Bedek voorzichtig met een dekglas. Om uitdroging te voorkomen, sluit de deksel slip met valap (mengsel van gelijke hoeveelheden van vaseline, lanoline, en paraffine).
  6. Afbeelding geïmmobiliseerd wormen met een confocale microscoop.
    NB: resultaten worden verkregen met een draaiende schijf AF confocale microscoop uitgerust met een EM-CCD camera en een Microscopie Automation & Image Analysis Software zoals MetaMorph en schetsen onder de details, maar vergelijkbare confocale beeldvormende systemen kunnen ook worden gebruikt.
    1. Gebruik de 63X of 100X / 1.4NA olie objectief en plaats de microscoop dia met wormen in de houder microscoop dia.
    2. Open de software. Pas laservermogen en filters voor mRFP beeldvorming. Gebruik de 561 nm laser op 10% vermogen en emissie filter> 600 nm.
    3. Open "Multidimensional Acquisition". Onder het tabblad "Main", schakelt u de selectievakjes voor "Timelapse" en "Run Journals" (Hardware Auto Focus: uit).
    4. Onder het tabblad "Opslaan" te selecteren of de map directory waar de bestanden moeten worden opgeslagen creëren. Wijs een naam aan het bestand.
    5. Onder het tabblad "Golflengte" te selecteren voor de juiste belichting en de belichting en gain. Gebruik "YokoQuad Red" (of een gelijkwaardige belichtingsinstelling voor mRFP beeldvorming) met een belichting tussen 100 en 300 msec en een camera versterking tussen 100 en 300, afhankelijk van het individu monster (bepaald door de live image).
    6. Onder het tabblad "Timelapse" selecteer "Aantal tijdstippen" = 301, "Duur" = 5 min en "Time / Interval" = 1 sec.
    7. Onder de "Journals" tab selecteer Journal: "AFC SET Z HOLD" en "AFC Terug naar Z HOLD", Type: &# 8220; Special "(tweemaal), Initial Point:" Begin van tijdstip "en" End of tijdstip ". Deze autofocus optie is belangrijk beeld hetzelfde gedeelte over een langere periode.
    8. Wanneer de installatie is voltooid, drukt u op "Acquire". De timelapse video wordt Safed als afzonderlijke TIFF-bestanden.
    9. Open alle .tiff bestanden van een gegeven tijdreeks in ImageJ. Ga naar "Beeld" → "Stacks" → "Beelden aan Stacks". Eventueel, de helderheid en het contrast, voeg grootte bar, enz. De film onder "File" exporteren → "opslaan als" → "AVI ..." (voor een voorbeeld, zie video 1 en 2 overeenkomt met figuur 1).

2. Met behulp van Folding Sensoren en Stress Reporters om Cell autonome en niet-autonome cel beïnvloedt op Proteostasis en toxiciteit Onderzoek

  1. Genereren van transgene lijnen die een opvouwbare sensor of stress reporte coexpressr samen met de prion-achtige eiwit. Voor methoden over hoe te kruisen vestigen of het genereren van transgene lijnen, zie 48,49,52. Zie tabel 1 voor een overzicht van C. elegans stammen die gebruikt kunnen worden.
  2. Bereid gesynchroniseerde populaties van transgene dieren en groeien ze tot de gewenste leeftijd als hierboven (paragraaf 1.2) 50 beschreven.
  3. Met een stereomicroscoop, onderzoekt de respectievelijke fenotype van de vouwen sensor of stress reporter.
    1. Voor het vouwen sensor bepaalt het aantal dieren herbergen aggregaten op elke dag na synchronisatie (voor een voorbeeld zie Figuur 2E en F).
    2. Voor de stress reporter, indien aan de co-expressie van het prion-achtige eiwit resulteert in een verhoogde fluorescentie van de reporter (voor een voorbeeld zie figuur 3).

3. Genoom-brede scherm voor Onderdrukking van-Prion geïnduceerde toxiciteit in C. elegans

figure-protocol-1
Figuur 4. Schematische weergave van de RNAi screening protocol. Zie protocol hoofdstuk 3 voor een gedetailleerde beschrijving van de verschillende stappen.

  1. Synchronisatie van C. elegans wormen en duplicatie van RNAi bibliotheek
    1. Voor het scherm RNAi, gebruik dan de Ahringer RNAi bibliotheek (of de Vidal RNAi bibliotheek) 53,54. Rearray de RNAi bibliotheek van de oorspronkelijke 384 putjes in platen met 96 putjes door het vullen van de platen met 100 pi LB-amp medium (50 ug / ml ampicilline in LB) aangevuld met 10% glycerol en beënt met een 96-pin replicator. Kweek bij 37 ° CO / N onder roeren en bewaar bij -80 ° C.
    2. Onderhouden C. elegans WT en transgene lijnen bij 20 ° C op NGM platen geënt met OP50 E. coli volgens standaardwerkwijzen 47.
    3. Synchroniseer prion domein transgene en WT (controle) nematoden door bleken (zie paragraaf 1.2).
    4. Op dezelfde dag dat de wormen worden gebleekt, bereiden LB media aangevuld met 50 ug / ml ampicilline. Gebruik een geautomatiseerde reagens dispenser te zien (of pipet handmatig) 65 pl van de LB-amp medium in elk putje van een plaat met 96 putjes.
    5. Verwijder 96 goed Ahringer RNAi bibliotheek platen van -80 ° C en breng ze naar een steriele kap bekleed met keukenpapier. Verwijder direct de seal-tape door het vasthouden van de plaat ondersteboven terwijl platen zijn nog bevroren, let daarbij goed op besmetting door het ijs aan de buitenkant van de platen te voorkomen. Reinvert de platen en laat ze ontdooien voor ongeveer 30 min.
    6. Dompel een steriele 96 pin replicator in een RNAi bibliotheek plaat, en dan in één vers LB-amp plaat. Gebruik een verse steriele replicator voor elke plaat. Dicht alle platen met zelfklevende folie tape en de terugkeer van de bibliotheek platen tot -80 ° C. De replicators kan worden gedrenkt in bleekwater, gespoeld,en geautoclaveerd opnieuw gebruiken.
    7. Laat gedupliceerd RNAi platen groeien O / N in een incubator op 37 ° C en 300 rpm. Om HT115 E. gebruiken coli bacteriën die de lege vector (L4440) als controle, groeien afzonderlijk een kweekbuis en pipetteer 65 pl van de kweek met een multichannel pipet in een kwart van twee 96 well platen.
  2. Inductie van bacteriële dsRNA productie en toevoeging van wormen
    1. Verdun isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tot een 5 mM concentratie DDH 2 O. Gebruik een geautomatiseerd werkstation met een meerkanaals kop te zien (of pipet handmatig) 10 pl verdund IPTG in elk putje van de RNAi bacteriën en controle platen. Hersluiten en plaats de platen weer in de incubator. Laat ze schud gedurende 3 uur bij 37 ° C.
    2. Terwijl bacteriën worden schudden, de voorbereiding van de wormen. Meng de M9 / worm ophanging goed, en pipet een kleine steekproef (~ 5-10 ul) om een ​​glas microscoop dia. Tellenhet aantal wormen onder een stereomicroscoop en bereken het aantal wormen per pi.
    3. Met steriele techniek wordt een oplossing van aangevuld M9 (M9 +) met de volgende uiteindelijke concentraties: 0,20 mg / ml IPTG, 8,0 ug / ml cholesterol, 50 ug / ml ampicilline, 9,6 ug / ml tetracycline, 0,0835 ug / ml Fungizone, en 15 wormen per 50 pi.
      1. Maak afzonderlijke oplossingen voor prion domein transgene en WT wormen. Het uiteindelijke volume van M9 + worm oplossing nodig is afhankelijk van het aantal platen RNAi gekopieerd (zie hieronder), plus ~ 30 ml dode volume in het reservoir blijft, indien een automatische dispenser wordt gebruikt.
    4. Na de 3 uur inductie van bacteriële dsRNA productie, neem de platen uit de couveuse en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur (~ 30 min) om warmte te worden voorkomen dat het dier.
    5. Pipetteer 50 ul M9 + prion domein transgene worm oplossing in elk putje van de RNAi platen en een van de lege vector controle platen. MakenZorg ervoor dat de worm oplossing voor elke stap samen, aangezien de dieren hebben de neiging om te bezinken naar de bodem van het reservoir.
    6. Doseer WT wormen in de tweede controle bord. Laat de platen ontzegeld om beluchting mogelijk te maken. Om de vloeistof cultuur verdampt houden, stapelen 4-5 platen samen en wikkel met een vochtige papieren handdoek en aluminiumfolie. Incubeer bij 200 rpm bij 20 ° C gedurende 4 dagen.
  3. Scoren
    OPMERKING: Na 4 dagen in de couveuse, zullen de wormen zijn op de tweede dag van de volwassenheid en zijn klaar om te screenen. Laat de dieren aan te passen aan niet schudden voorwaarden gedurende 30 minuten voordat het screenen om ongestoord pak slaag te garanderen.
    1. Met behulp van een Falcon 4M60 camera aangesloten op een computer met een monitor, scherm visueel voor verhoogde pak slaag in vergelijking met controle behandelde prion domeinbeheer transgene dieren.
    2. Opstelling van een lijst van voorlopige treffers te bevestigen met behulp van wrMTrck (zie volgende paragraaf).

4. Bevestiging van de VoorlopigeScreen Hits

  1. Beweeglijkheid test op vaste platen
    1. Bereid platen met NGM aangevuld met 100 ug / ml ampicilline, 12,5 ug / ml tetracycline en 1 mM IPTG, volgens standaardmethoden 47. Indien mogelijk, gebruik maken van een plaat gieten machine om te verzekeren alle platen hebben dezelfde hoogte van de media, die zal zorgen voor een meer gestroomlijnde video overnameproces.
    2. Groeien de verschillende RNAi klonen in ~ 1 ml LB + 50 pg / ml ampicilline, O / N bij 37 ° C en 250 rpm.
    3. De volgende dag, induceren de expressie van het dsRNA met 1 mM IPTG gedurende 3 uur. Zaad van de platen met 150 pi van elk RNAi bacteriële kloon, verspreid in een dunne laag. Laat de bacteriën droog gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur in het donker. Bereid 3 platen per RNAi kloon.
    4. Synchroniseer de worm bevolking door het bleken volgens standaardmethoden 50 (zie paragraaf 1.2), en laat de eieren uitkomen O / N in M9 media.
    5. Neem een ​​monster van de worm suspensie en het bedrag van nematodes per ul in de stereomicroscoop. Dan, pipet van de juiste omvang van de M9 plus wormen in elke experimentele plaat, zodat het bevat 25 - 30 L1 wormen. Groeien de nematoden bij 20 ° C gedurende 4 dagen tot de wormen bereiken dag 2 van volwassenheid.
  2. Kwantitatieve analyse van de worm beweeglijkheid met de wrMTrck plugin voor ImageJ
    OPMERKING: De video's zijn opgenomen met een stereomicroscoop bij 10x vergroting met een Hamamatsu Orca-R2 digitale camera C10600-10B en de Hamamatsu Eenvoudige PCI-imaging software.
    1. Schakel de camera en de Simple PCI imaging software. Klik op "live" om afstelling van de beeldvorming voorwaarden.
    2. Het opzetten van de video voorwaarden als volgt: Gain = 0; Light Mode = High; Speed ​​index = 1; Binning = 2. Klik op "Auto Expose" en pas dan de lichtomstandigheden, het verplaatsen van de microscoop spiegels en de helderheid en het contrast wijzerplaten.
      OPMERKING: De video moet op een hoog contrast zonder OVEREXP hebbenosed, zodat de dieren als zwarte vormen op een heldere achtergrond.
    3. Klik op "Time Scan" en kies een map en een bestandsnaam. Stel "Field Delay" tot 20 msec en "Stop bij Time" tot 30 sec. Druk op "Live-beoordeling" om de oppervlakte van de plaat ervoor kiezen om op te nemen (waar de meeste wormen zijn). Tik op de plaat 3 of 4 keer op het podium, snel te bevestigen haar positie op het gebied van uitzicht en druk op "Start".
    4. Na het einde van de film opnemen, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en kies "Exporteren Montage Sequence" om de film uit een .cxd formaat te exporteren naar een .avi.
  3. Het analyseren van de beweeglijkheid video
    1. Open de ImageJ software, ga naar het tabblad "Plugins", dan "wrmtrck" en selecteer "wrMTrck Batch". Selecteer de map met alle bestanden te analyseren.
    2. In de belangrijkste ingang raam van wrMTrck_Batch, laadt de input waarden zoals beschreven in Figure 5C. Verklaring voor elk van de parameters vindt u in de instructies die de plugin te begeleiden. Klik op "OK" en laat de bewegingsanalyse run.
    3. Om de resultaten samen te stellen en te bevestigen dat alle gedetecteerde tracks zijn van de werkelijke C. elegans en elimineren van artefacten, opent elk van de .txt-bestanden die zijn gemaakt voor elke film en kopieert de gegevens naar een data-analyse software-bestand. Open het "* _labels.zip" bestanden die zijn gemaakt en voer het resulterende "* _labels.tif" om handmatig te controleren en valse worm tracks te elimineren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Monitoring intercellulaire verspreiding van prion-achtige eiwitten door in vivo time-lapse imaging

Transgene C. elegans lijnen expressie de prion domein zijn bijzonder geschikt voor de analyse van bepaalde aspecten van prion-achtige eiwitten, bijvoorbeeld cel tot cel transmissie en niet cel autonoom toxiciteit. De transparantie van de dieren maakt het bijhouden van fluorescent gelabelde eiwitten vanuit het levende organisme in elke fase van het lev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methoden helpen om te illustreren de verspreiding en de complexe cel autonome en niet-autonome cel toxiciteit van prion-achtige eiwitten. We hebben onlangs ontdekt dat een aggregatie-gevoelige cytosole prion domein wordt opgenomen in membraangebonden blaasjes in een autofagie gerelateerde proces. Een specifieke subgroep van deze vesicles transporteert het prion domein binnen en tussen cellen en weefsels 40. De sleutel tot hun beweging in het levende dier volgen is dat het eiwit moet worden ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

We danken Cindy Voisine en Yoko Shibata voor nuttige discussies en kritische opmerkingen over het manuscript. We erkennen de High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) en de Biological Imaging Facility (BIF) aan de Northwestern University voor hun hulp. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), de Ellison Medical Foundation en de Daniel F. en Ada L. Rice Foundation (aan R.I.M.). C.I.N.-K. werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagent
Nanosphere size standards 100 nmThermoScientific3100A
LevamisoleSigmaL-9756
IPTGSigma15502-10G
Ahringer RNAi librarySource BioScience LifeSciences http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VACThermoScientific75004521http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator Scionomix  http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker Digilabhttp://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser Titertrekhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation Beckman Coulterhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shakerNew Brunswickhttp://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA Leicahttp://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD cameraHamamatsuhttp://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope Leicahttp://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera Teledyne Dalsa http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis SoftwareMolecular Deviceshttp://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis SoftwareMeyer Instrumentshttp://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJNIHhttp://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJhttp://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                     rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]Morimoto labavailable from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

Referenties

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2 (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75 (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79 (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274 (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286 (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123 (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179 (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7 (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22 (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302 (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46 (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22 (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16 (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45 (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97 (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209 (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33 (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11 (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12 (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9 (3), e1003351(2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400 (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482 (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6 (11), e294(2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. , (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8 (1), e53419(2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5 (1), e8568(2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16 (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5 (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12 (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31 (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840(2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5 (3), e1000399(2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283 (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71 (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. , (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

C elegans modeltime lapse fluorescentiemicroscopiegenoombrede RNAi screeninganalyse met Worm Trackercelautonome toxiciteitniet celautonome effectenmonitoring van vesikeltransportassay voor thrashing motiliteitoxidatieve stressrespons

Gerelateerde artikelen