Een technisch perspectief in Modern Boom-ring Onderzoek - Hoe Dendroecological en houtanatomische uitdagingen te overwinnen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat beschrijft hoe houten exemplaren moeten worden bemonsterd voor de algehele beoordeling van hun groeistructuren. Macro- en microscopische bereidings- en visualisatietechnieken die nodig zijn om een goed gerepliceerd en zeer gedetailleerd houtanatomisch en dendro-ecologisch dataset te genereren, worden beschreven.

Samenvatting

Dendroecological onderzoek maakt gebruik van informatie die is opgeslagen in boomringen om te begrijpen hoe enkele bomen en zelfs hele bosecosystemen gereageerd op veranderingen in het milieu en om eindelijk te reconstrueren dergelijke veranderingen. Dit gebeurt door analyse groei variaties terug in de tijd correleren verschillende installatiespecifieke parameters (bijvoorbeeld) temperatuurgegevens. Integreren houtanatomische parameters in deze analyses zou versterken reconstructies, zelfs tot intra-jaarlijkse resolutie. Presenteren we daarom een ​​protocol over hoe om te proeven, te bereiden, en houten exemplaar voor gewone macroscopische analyses te analyseren, maar ook voor de daaropvolgende microscopische analyses. Verder introduceren we een mogelijke oplossing voor het analyseren van digitale beelden gegenereerd uit voorkomende kleine en grote exemplaren te ondersteunen tijdreeksen analyseert. Het protocol stelt de basisstappen die nog kunnen worden gebruikt. Afgezien van deze, is er een voortdurende behoefte aan de verbetering van bestaande technieken, en de ontwikkeling van nieuwe techniques, te kwantificeren en de voorbije en huidige ecologische processen. Traditionele houtanatomische onderzoek moet worden uitgebreid met informatie over de ecologie om dit gebied van onderzoek. Dit zou Dendro-wetenschappers die van plan zijn om nieuwe parameters te analyseren en ontwikkelen van nieuwe methoden om de korte en lange termijn effecten van specifieke omgevingsfactoren op de anatomie van houtige planten te begrijpen ondersteunen.

Inleiding

Bomen, evenals struiken, dwerg struiken en zelfs kruiden tonen verdeelstuk reactiepatronen gerelateerd aan veranderingen in hun omgeving. Deze patronen zijn onderworpen aan plantkunde en plantenfysiologie al sinds het midden van de 19 ^{e eeuw.} Destijds onderzoek naar houtige gewassen vooral gericht op bomen en een beschrijvende analyse van de structuur en de variabiliteit van de jaarringen in een ecologische context ^1. Toen Andrew Ellicott Douglass de uitvinder van de cross-dateringsmethode voor boom-ring onderzoek ^2, werd deze ecologische context min of meer onderdrukt door de nieuwe mogelijkheid om nauwkeurig te dateren houten bevindingen in de archeologie. Cross-dating voor de eerste keer kon de precieze datering van boomringen met het kalenderjaar en is tot nu toe beschouwd als de ruggengraat van de boom-ring onderzoek op alle gebieden van de toepassing ervan ^1.

Parallel, sinds het einde van de 19e eeuw, houtanatomie uitgegroeid tot een belangrijk onderzoek discipline betreffend tot vele andere gebieden van de natuurlijke en toegepaste wetenschappen ^3. Twee belangrijkste domeinen zijn gevestigd: de systematische houtanatomie, dat is de basis voor het identificeren van hout in de archeologie ^4, en de toegepaste hout anatomie, met betrekking tot hout technologie, fysiologie, pathologie, en ecologie ^3,5.

In boom-ring onderzoek, dendroecology tegenwoordig wordt gedefinieerd als een onderwerp omvat boom-ring-gerelateerde studies gericht op milieu-studies zoals geomorfologische processen (dendrogeomorphology), temperatuur en neerslag reconstructies (dendroclimatology), water niveau veranderingen (dendrohydrology) of zelfs gletsjer schommelingen ( dendroglaciology) ^6. Aangezien deze definitie geeft, heb boom-ring analyses steeds belangrijker op het gebied van dating en reconstructie van het milieu processen geworden, zoals (i) verleden klimatologische omstandigheden door het analyseren van de jaarlijkse variaties in de ring breedte ^7,8, hout dichtheid ⁹ of isotopen ^10, of (ii) thij herhalingstijden van geomorfologische processen ^11. Deze zeer gedetailleerde studies over ring breedte variaties en hun isotopengehalte tonen aan dat het ringen analyse nader, dat wil zeggen de anatomische structuur van de ringen bestuderen. Echter, gedetailleerde studies van hout anatomische kenmerken binnen de jaarringen in verband met veranderingen in het milieu zijn zeldzaam ^12,13. Hoewel deze microscopische kenmerken zijn bekend ^14, hebben ze zelden toegepast op een microscopisch niveau te dendroecological onderzoek. Bovendien is de nauwkeurige timing van deze groei reacties in natuurlijk gegroeide bomen, van essentieel belang voor de exacte datering doeleinden, is zelden onlangs ¹⁵ gedocumenteerd.

Over de effecten van de opwarming van de aarde ^16, de verbetering van bestaande en ontwikkeling van nieuwe technieken om op te nemen en te kwantificeren de voorbije en huidige ecologische processen is nodig, vooral in termen van impact op het klimaat onderzoek ^11.Door het uitbreiden van traditionele houten anatomisch onderzoek naar een ecologisch gebaseerd houtanatomie ^17, kan dendro-wetenschappers analyseren nieuwe parameters en nieuwe methoden om de korte en lange termijn effecten van specifieke omgevingsfactoren op de anatomie van houtige gewassen ¹⁸ begrijpen ontwikkelen. Gedetailleerde kennis over variaties in de andere cel parameters binnen de afzonderlijke ringen met betrekking tot specifieke drivers (bv mechanische krachten, klimaat variaties) is de basisvoorwaarde voor het begrijpen van de variabiliteit in de boom ring formatie. In vergelijking met gewone ring breedte metingen, het identificeren van hout anatomische variaties vereist meer complexe en uitgebreide voorbereiding technieken die veel arbeid en tijd vergen. Gedetailleerde procedures van het monster snijden, kleuring, en inbedding zijn talrijk en zijn altijd afhankelijk van het doel van het onderzoek ^19.

Voor macroscopische analyse van de ring breedte in coniferen of zelfs structuren voor het aantal, de grootte of de distribution van schepen in hardhout, wordt het oppervlak van een monster vaak gepolijst met fijn schuurpapier of speciale slijpmachines ^20. Een nadeel van deze procedure is het vullen van de afzonderlijke cellen met stof dat verdere halfautomatische microscopische analyse ²¹ voorkomt. De beste resultaten voor macroscopische monstervoorbereiding worden bereikt als monster oppervlak worden gesneden met een scheermesje of een ander scherp mes.

Terwijl voor kleine monsters, scheermesjes zijn een perfect hulpmiddel; grotere monsters als kernen vereisen het snijden van platte oppervlakken over de gehele omvang van de kernen. In tegenstelling tot schuren worden de cellen niet gevuld met stof, die verdere voorbereiding voor de opeenvolgende beeldanalyse maakt. Bovendien is de open cel lumen, de goed gesneden celwanden, en het vlakke oppervlak van het gehele monster mogelijk de toepassing van hoogfrequente densitometrie ²² de gehele omvang van de kern. Voor beeld analyseert, het oppervlak van de monsters (cellwanden) kunnen worden gekleurd met donkere inkt en de open cellen lumen kan vervolgens worden gevuld met wit krijt om het contrast tussen de celwand en het lumenoppervlak ^19,23 verbeteren. Deze vrij eenvoudige techniek maakt een basis macroscopische beoordeling van grotere celstructuren voor grootte van het vaartuig metingen.

Deze technieken voor het snijden van vlakke oppervlakken zijn voldoende voor macroscopische analyses. Voor een gedetailleerde houtanatomische (dwz microscopisch) analyse, doorvallend licht microscopie is de meest voorkomende methode toegepast in Dendro wetenschappen. Xylem cellen differentiëren door middel van complexe processen omvat celtype vastberadenheid, celdeling, celdifferentiatie, en geprogrammeerde celdood ^24. Omdat de timing en de snelheid waarmee deze processen voordoen, te bepalen cel anatomische kenmerken, kunnen milieu-omstandigheden die deze processen anatomische afwijkingen in de ringstructuur te genereren. Als een belangrijke voorwaarde voor deze analyses, moeten micro-secties worden voorbereid met een microtoom ^19. Bij de voorbereiding van monsters voor het snijden, de zichtbaarheid van de tracheide of vezelrichting is cruciaal. Het gebruik van de hand aangedreven schuifmechanisme microtomen wordt aanbevolen om micro secties te snijden, omdat deze techniek faciliteert hoogwaardige onderdelen als nodig is voor het analyseert ^19. Afhankelijk van het specifieke doel van een bepaalde studie worden micro secties gesneden loodrecht of evenwijdig aan de langsrichting van de cellen. Deze secties worden vervolgens gefotografeerd onder een microscoop en celafmetingen gemeten met behulp van gespecialiseerde beeldanalyses software.

Tot voor kort, de mogelijkheid om micro secties bereiden werd beperkt tot kleine steekproeven slechts (ongeveer 1 cm x 1 cm). Dit is aanvaardbaar voor enkele evenementen zoals verstoringen in specifieke jaren te analyseren, maar deze techniek is niet de uitgebreide analyse van tijdreeksen die nodig is voor het milieu reconstructies mogelijk te maken. Deze inspanning kan alleen realiserend door de ontwikkeling van nieuwe, efficiënte en economische procedures voorbereiding en analysetechnieken. In de afgelopen jaren hebben de leden van de boom-ring lab in het Zwitserse Federale Instituut WSL in Zwitserland intensieve werkzaamheden gestart over dit onderwerp. Dientengevolge zijn nieuwe inrichtingen en analysetechnieken ontwikkeld om het idee integreren houtanatomische functies om een ​​breed scala van milieu onderzoekstopics ondersteunen.

Protocol

1. De bemonstering Technieken

1. Kernbemonstering
   1. Voor bemonstering boom stengels, extract minstens twee kernen met behulp van een increment appelboor van elkaar voort om zijn groei ontwikkeling te analyseren. Variëren van de positie van de bemonstering op de onderzoekstaak, bijvoorbeeld voor gemeenschappelijke klimaat reconstructies neem de kernen parallel aan de helling. Bij het werken met tropische soorten, nemen ten minste drie of meer kernen.
   2. Gebruik een scherp increment kernboor (5, 10 of 12 mm in diameter) en plaats de kernboor loodrecht op de groeiende as van de steel.
      OPMERKING: Om een ​​gecontroleerde en stabiele positie van de corer hebt, gebruik dan een duwboot met bewegingen van de andere dan de rotatie appelboor vermijden bij het boren van het in de boom. Boren zich in de stam helemaal in en door het merg. Om de kern zeer dichte hout (dat wil zeggen, tropische soorten), gebruik van speciale opnieuw geconfigureerde kettingzaag organen met een adapter van boorkernen die het mogelijk maken om de kern zelfs dichte bossen als Diospyrus ebenum (Ebony).
   3. Gebruik een afzuigkap en verwijder de resulterende kern van de boom. Blijken de appelboor en verwijder deze uit de stam.
   4. Voeg een specifiek ID om het gewonnen kern met behulp van een zacht potlood door te schrijven op een tape, die vervolgens direct op de kern wordt geplaatst. Herhaal de procedure aan de tegenoverliggende zijde van de steel.
   5. Bewaar de twee monsters van de boom in plastic of papieren buizen of speciale dozen om beschadiging te voorkomen.
      OPMERKING: Papier rietjes zijn gunstig vooral in tropische omgevingen omdat ze voorkomen dat de kernen van gieten.
   6. Breng tot slot de kernen (vezelrichting rechtop) op houten steunbalken. Gebruik koud water houtlijm en laat ze drogen.
      OPMERKING: monteer nooit de kernen op houten dragers, voor zover het doel van het onderzoek omvat verdere chemische, isotopen of dichtheid analyse. Voor deze doeleinden, bevestig de kernen in de open kabelgoten of een enkele faced golfkarton.
2. Micro-core sampling
   1. Gebruik een speciale stansinrichtingof naald met een opening van 2 mm. Afhankelijk van de schors dikte gebruik een beitel een noodzakelijk gedeelte van de schors te verwijderen.
   2. Plaats het apparaat loodrecht op de as aan de groeiende stam zoals hierboven beschreven en met een hamer het xyleem van de stengel doordringen tot ongeveer 2 cm diep.
   3. Draai de naald om het resulterende micro kern binnen de functie te breken en te verwijderen uit de stam. Bewaar de micro kernen in microcentrifugepuls flesjes en ze te labelen.
3. Bemonstering Disc
   1. In bijzondere gevallen (en vooral in de tropen), bijvoorbeeld, bij de bemonstering van stronken en omgevallen bomen of waar mogelijk, neem schijven (doorsneden loodrecht op de groeiende as) met een kettingzaag. Gewoon het etiket van de schijven en bewaar ze tot verdere analyse.
      LET OP: Deze sampling procedure wordt het meest toegepast voor alle droge-dode, historische, archeologische en sub-fossiel materiaal evenals zeer dichte hardhout dat niet het gebruik van increment corers toestaan.

2. Monstervoorbereiding

1. Schuurschijven
   1. Leg de schijfjes op een schuurmachine en maal het oppervlak met behulp van een opeenvolging van steeds fijne schuurmiddelen, te beginnen met schuurpapier van korrel 80, gevolgd door 120, 220, 300-grit. Een laatste polijsten met 400-korrel is voldoende voor de meeste coniferen. Voor hardhout en vooral tropische soorten, gebruik schuren grutten tot 1200 aan de groei-ring grenzen te onderscheiden.
2. Snijden platte oppervlakken op kernen
   1. Bevestig de boorkernen in de kern houder van een nieuw ontwikkelde kern microtoom waardoor aan platte oppervlakken op kernen over hun gehele omvang te snijden.
      Opmerking: Corrigeer de oriëntatie van de kern binnen de houder aan de vezelrichting van het monster staander, die in een rechte hoek op het mes van de microtoom hebben.
   2. Til de kern tot hij iets raakt het mes. Trek het mes, die is bevestigd op kogellagers leiding over de omvang van de kern cutoff een eerste deel van de top.
   3. Duw het mes achter de kern, til de monsterhouder met de kern ongeveer 10 pm en herhaal de snij-procedure. Doe dit tot ongeveer een derde van de diameter van de kern wordt gekapt resulteert in een doorlopend vlak oppervlak.
3. Het voorbereiden van micro secties door het toevoegen van maïszetmeel oplossing.
   1. Voor gedetailleerde beeldanalyse van de anatomische structuur, fix kernen of andere monsters afgesplitst van schijven in de houder van een microtoom. Plaats de microtoom blad, begeleid door een kogellager begeleiding van een nieuw ontwikkelde slee microtoom op de bovenste rand van het monster en trek er overheen.
   2. Duw het mes op te tillen het monster met ongeveer 20 tot 30 micrometer en trek het blad over het monster opnieuw. Herhaal deze procedure tot een continu oppervlak boven het monster wordt gecreëerd.
   3. Bedek het resulterende oppervlak met een maïszetmeel oplossing (10 g maïszetmeel, 8 ml water en 7 g 100% glycerol) met een gemeenschappelijke borstel.
      OPMERKING: De zetmeelkorrels vul de cellen van het monster de structuur stabiliseren de volgende snijden van de dunne secties.
   4. Til het monster door 15 urn, plaats een borstel op het oppervlak van het monster en trek het blad langzaam naar het monster begint af te snijden dunne gedeelte (onder de borstel). Tijdens het snijden, het resulterende deel schuift op het blad geleid door de borstel.
   5. Wanneer de hele sectie wordt gesneden, verwijder de micro gedeelte van het mes met een borstel en water (om wrijving te verminderen) en plaats de sectie op een glasplaatje voor verdere voorbereiding. Om uitdrogen te voorkomen, bedek ze met een kleine hoeveelheid glycerol (33% = enerzijds 100% glycerol en twee delen water).

3. microglaasje Voorbereiding

1. Voor de volgende bereiding van vaste slides, wassen op de glycerol van het micro gedeelte met een pipet en water.
2. Bedek de natte sectie met enkele druppels Safranine (1 g safranine poeder + 100 ml water) en Astrablue (0,5 g Astra blauw poeder + 2 ml 100% azijnzuur + 100 ml water) te onderscheiden verhout en niet-verhoute structuren, maar ook om het contrast van de daaropvolgende beeldanalyse verbeteren.
3. Laat de sectie rusten gedurende 5 minuten onder de kleurstof en dan was het weg met een pipet en weer water.
4. Zodra de overmatige kleurstof wordt verwijderd, dehydrateren het gedeelte met pipetten door wassen met een sequentie van 75% verdund, 96% en ten slotte 100% ethanol.
5. Gebruik pipetten de monsters op het glazen objectglaasje plaatsen van de monsters in een bad om de verwerkingstijd ongeveer twee tot 3 min verminderen het gehele droogproces spoelen.
   OPMERKING: Uitdroging met ethanol voorkomt kwetsbare monsters uit te breken.
6. Daarna spoel de sectie met 100% xyleen.
   OPMERKING: Xyleen is kankerverwekkend en ventilatie is verplicht in het lab bij het gebruik ervan. Anderproducten bestaan ​​vervanging xylol, maar als er bedoeling de monsters gedurende langere tijdsperioden (jaren decennia) voor een mogelijke heranalyse opslaan Canadabalsem (stap 3.5.2) het enige inbeddingmedium dat helder zonder kleur veranderen in de tijd blijft. Helaas Canadabalsem moet worden gebruikt in combinatie met xylol.
7. Zolang de xyleen blijkt melkachtige (wittig), herhaal dan de uitdroging proces want het is niet voldoende uitgedroogd.
8. Zodra de xylol vrij blijft, bedekken de sectie met een druppel van 100% Canadabalsem en bedekken met een dekglas van ten minste de grootte van de sectie.
   LET OP: Wees je bewust van de luchtbellen te verwijderen door zachtjes te drukken op de dekking van glas naar beneden.
9. Plaats het resulterende micro slide tussen twee stroken van hittebestendig plastic en leg het op een metalen plaat. Plaats een gewicht (bijvoorbeeld een magneet) bovenop de slede te drukken naar het gedeelte in de volgende droogproces plat te houden.
10. Plaats de objectglaasjes in een oven bij60 ° C gedurende ongeveer 12 uur. Na 12 uur, neemt u de dia's uit de oven en leg ze op een plank om hen te laten afkoelen tot kamertemperatuur (ongeveer 20 ° C). Wanneer ze afgekoeld zijn, verwijder het gewicht en de plastic strip en reinig de dia met behulp van scheermesjes om het overschot Canadabalsem verwijderen.

4. Visualiseren Cel Inhoud

1. Bereid Nawashin oplossing ^25.
   1. Bereid een oplossing (A) met 5 g chroomzuur, 50 ml 96% azijnzuur en 320 ml gedeïoniseerd water. Bereid een andere oplossing (B) met 200 ml formaline met 175 ml gedeïoniseerd water.
   2. Meng oplossing A en oplossing B in een 1: 1 verhouding tot de Nawashin oplossing te creëren.
2. Om de celinhoud te visualiseren, repareren van het monster met Nawashin oplossing gedurende 10 minuten om alle degradatie processen in de cel stoppen.
   OPMERKING: De fixatie behoudt celkernen waardoor een schatting van cel levensduur (cel levensduur = kernen aanwezig / kernen afwezig; de aanwezigheid or afwezigheid van de kern geeft aan of de cel is levend of dood).
3. Na fixatie, wassen de secties met water om de Nawashin oplossing volledig verwijderen voordat kleuring ze met Safranine-Astra blauw en voor hen bovendien kleuring met picrinezuur-aniline blauw (1 deel verzadigd water oplosbare aniline blauw + 4 delen van 10% picrinezuur) .
4. Verhit voorzichtig het monster tot ongeveer 80 ° C (in ieder geval onder kookpunt) van kleuring versnellen. Voor uitdroging en inbedding van de monsters volgen het protocol stappen 3,4-3,8.

5. Voorbereiding Digital Images van anatomische kenmerken

1. Maak digitale beelden van de kern van oppervlakken voor analyse vat.
   1. Snijd de kern oppervlak vliegtuig met behulp van de kern microtoom en vlekken op de resulterende oppervlak zwarte gewoon op basis van een vilten stift.
   2. Zodra de kleurstof wordt gedroogd, wrijf het oppervlak van de kern met wit krijt. Druk op de krijt in de cellen door simpelweg te wrijven het krijt over deoppervlak met een vinger. Verwijder ook het overschot krijt door deze procedure.
      Opmerking: Door de celwanden zwart en het lumen delen van de vaten zijn wit. Deze tegenstelling is een voorwaarde voor een geautomatiseerde beeldanalyse.
   3. Plaats de kern bereid onder een binoculaire microscoop uitgerust met een digitale camera. Neem een ​​reeks enigszins overlappen (ong. 10%) beelden vanaf één zijde van de kern tot het gehele oppervlak wordt vastgelegd. Steek de afzonderlijke beelden tot een compleet beeld van de kern oppervlak te creëren.
2. Maak digitale beelden van micro slides
   1. Leg de schoongemaakte micro dia onder een microscoop en neem overlappende beelden uit de hele sectie.
   2. Definieer een specifieke versterking afhankelijk van de structuur te analyseren, variërend van 40x en 1000x.
   3. Steek de afzonderlijke beelden op één volledig beeld van de afdeling te creëren. Om mogelijke verstoringen tijdens het naaien proces te voorkomen, gebruikt "; Plan "-type objectieven met de microscoop.

6. Het kwantificeren anatomische kenmerken

1. Cellen en ring randen met het beeldanalyse gereedschap ROXAS18 of soortgelijke software detecteren, laadt een volledig beeld van een micro sectie en de bijbehorende ruimtelijke ijking kwantitatieve resultaten in metrische eenheden verkrijgen. Bereken de ruimtelijke ijking door meting van het aantal pixels tussen de schalen van een micrometer fase opnamen met dezelfde vergroting en de verkregen waarde te delen door het schaaldeel in metrische eenheden (bijv 1000 pm).
2. Selecteer uit de verstrekte lijst (mits in de software) een geschikte configuratie voordat u de automatische deel van de analyse.
   OPMERKING: Een configuratie is een eerder geoptimaliseerde reeks programma-instellingen die bijvoorbeeld rekening houdt met de kleuring kleur van het monster en de grootte en vorm bereik van cellen te detecteren. Toegesneden configuraties dustoelaten om optimale resultaten erkenning voor de verschillende soorten en beeldkwaliteit te produceren.
   1. Selecteer meer opties, zoals het gebruik van gebieden in de afbeelding die moeten worden opgenomen of uitgesloten te vermijden, bijvoorbeeld, blanco afbeelding marges of scheuren in de steekproef, indien nodig.
3. Start de analyse door op de knop Analyseren. Indien gekozen, definiëren gebieden in de afbeelding die moeten worden opgenomen of uitgesloten met behulp van de veelhoek, rechthoek of cirkel tool. De volgende automatische analyse maakt gebruik van flexibele algoritmen om enkele afbeelding tekortkomingen (bijvoorbeeld slecht contrast) te corrigeren en verbeteren van het contrast op basis van de kwaliteit van het beeld.

Resultaten

Alle dendroecological analyses afhankelijk nauwkeurige monsters, ongeacht of schijven, kernen of micro kernen worden genomen. Voor deze, de apparaten moeten worden in perfecte vorm (nauwkeurig geslepen) naar micro scheuren binnen de houten monster te voorkomen. Bij het opstellen oppervlakken boorkernen, het gebruik van een kern microtoom noodzakelijk. De mogelijkheid open cellen, die verder kan worden behandeld om het contrast te verbeteren voor het analyseert en omvang van het schip metingen (figuur 1), hebben een eerste belangrijke stap op weg naar de aanpassing van anatomische structuren in tijdreeksanalyses. Soms is de dichtheid van een hardhouten monster voorkomt het gebruik van een microtoom. In dat geval is een goede polijsten en daarop volgende verwijdering van overmatig zaagsel van de schepen met een compressor of stofzuiger is de beste optie.

Voor meer gedetailleerde analyses van kleinere celstructuren als voorjaarshout en zomerhouttracheiden in coniferen, zijn van hoge kwaliteit micro secties nodig. Hier, potential artefacten zoals secundaire celwanden ontdaan van de primaire wand moeten worden vermeden (Figuur 2). Indien deze artefacten optreden in de digitale beelden, een geautomatiseerde analyse van de celgrootte niet meer mogelijk. De voorwerpen moeten dan handmatig worden gecorrigeerd, hetgeen tijdrovend en veelal resulteert in foutieve metingen van celgrootte. De eenvoudige toepassing van een niet-Newtonse vloeistof, dwz een maïszetmeel oplossing aan de bovenzijde van het monster steunt de stabiliteit van de structuur terwijl het verminderen van het optreden van artefacten tot een minimum (figuur 2) ^26. Deze toepassing van maïszetmeel, geschikt voor alle houten monsters waaronder soorten, maakt de toepassing van de inbedding procedure om de monsters voor het snijden overbodig.

Micro secties maken een veiliger bepaling van jaarringen. Dit is vooral het geval voor coniferen groeien op hun natuurlijke grenzen, dwz </ Em>, bij de boomgrens in het hooggebergte waar. Extreem smalle ringen zijn frequente en moeilijk te detecteren macroscopisch (figuur 3). In extreme gevallen, de ringen uit één of twee rijen voorjaarshout cellen en een rij afgeplatte zomerhout cellen die missen (in tegenstelling tot conventionele zomerhout cellen) verdikte celwanden. Hiervoor zijn ze beter of zelfs alleen zichtbaar bij het gebruik van micro-secties. Bovendien kan dichtheidsfluctuaties worden van ring grenzen duidelijker, waarbij de detectie van jaarringen name in het Middellandse en de tropen (figuur 3) vereenvoudigt.

Bij het analyseren van beelden bij een vergroting van 40X of hoger, enkele cellen zijn zichtbaar en de dikte van de celwanden is detecteerbaar. Semi-automatische analyse software kan de meting van specifieke parameters langs bepaalde wegen in de richting van de temporele en ruimtelijke ordening (figuur 4). Hiermee Changes van enkele parameters zoals de cel lumen of celwand dikte worden bepaald over de gehele omvang van een jaarlijkse ring (figuur 4). Dit kan gedaan worden voor alle ringen zichtbaar in het beeld en dit staat volledig achter de noodzaak voor een uitgebreide analyse van tijdreeksen.

Afbeelding analyses kunnen ook worden gebruikt om de ontwikkelingsfasen van jaarringen binnen het groeiseizoen (figuur 5) te bepalen. Bij het analyseren van het beeld van een deel gekleurd met Safranine en Astra-blauw met behulp van gepolariseerd licht, zelfs de verschillende stadia van lignification, te beginnen in de uiterste hoeken van de celwanden, totdat de volledige lignificatie van de secundaire celwand, worden zichtbaar. Dit is omdat de verhoute (rijpe) celwanden schijnen in gepolariseerd licht (figuur 5). Gedetailleerde informatie kan worden gerelateerd aan milieugegevens gedocumenteerd voor de betreffende vegetatie periode te bepalen bijvoorbeeld een meer gedetailleerde klimaat-groei relati onship.

Figuur 1. Voorbeelden van een micro-sectie en een voorbereide vlak oppervlak van een eik, waaronder ring-breedte en de grootte van het vaartuig metingen Links:. Buitenste deel van een eik increment kern. De 5 mm diameter kern werd gesneden met behulp van een kern microtoom. Het oppervlak werd vervolgens gekleurd zwart met een stift en cellen werden gevuld met wit krijt na de vlek was droog. Rechts: de grafiek aangeeft ring breedte en maat verblijf metingen uitgevoerd op het oppervlak van het aan de linkerzijde kern. Geen micro secties waren nodig om deze metingen te doen vanwege de heldere oppervlak gecreëerd door de kern microtoom (gewijzigd na ^21). Bottom: Micro sectie afgesneden een increment kern, gekleurd, uitgedroogd en in Canadabalsem vast. Dikte: 20 pm, lengte: 25 cm. g "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Afbeeldingen van micro secties snijden zonder stabilisatie ten opzichte van een sectie cut behulp van de maizena oplossing Links:. Micro sectie toont het snijden van artefacten in de voorjaarshout tracheiden van een conifeer. Het monster werd gesneden zonder inbedding en daardoor het vrij dun secundaire wanden van de voorjaarshout cellen werden afgesplitst de primaire wand (blauwe pijlen). Rechts: Micro sectie zonder artefacten in de voorjaarshout tracheiden van een conifeer. Dit gedeelte (hetzelfde monster zoals aangegeven aan de linkerkant) werd gesneden na het toepassen van de maïzena-oplossing met een borstel op de top van het monster oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
. Figuur 3. Voorbeelden van nauwelijks waarneembare jaarring grenzen Links: Micro gedeelte van een increment kern (hier: Larix decidua) toont een ring grens (zwarte pijl) door een enkele rij afgeplatte zomerhoutzone cellen aangegeven zonder verdikking van de celwanden. Deze ring zou niet macroscopisch zichtbaar zijn. Rechts: Intra-jaarlijkse dichtheidsfluctuaties (witte pijl) komen vaak voor in mediterrane soorten (micro sectie: Quercus ilex). De geleidelijke verandering van de celstructuur richting zomerhout en terug naar voorjaarshout structuur (witte pijl) maakt het mogelijk om een onderscheid te dichtheidsfluctuaties van echte ring grenzen (zwarte pijl). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Illustratie van lumen gebied en wanddikte metingen binnen een jaarring van een conifeer Top:. Cut-out beeld tonen een voorbeeldige resultaten van Roxas analyse in een boom-ring van Pinus sylvestris (grove den). Ring grenzen worden getoond in het geel en schetst van tracheide lumina in cyaan. Voor één radiale bestand (blauw tracheide lumina) de gemeten cel wanddiktes wordt vertegenwoordigd door rode cirkels. Zwarte schaal bar = 100 micrometer. Bottom:. De intra-jaarlijkse veranderingen in tracheide lumengebied en tracheide cel-wanddikte voor het gehele jaarring Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5. example van een vormende jaarring. De foto is genomen onder een lichtmicroscoop met gepolariseerd licht van een Safranine en Astra-blauw gekleurde micro-sectie verkregen uit een micro-core bemonsterd op ⁷ juli 2007 uit een Larix decidua groeien in de Lötschental op 1.300 meter boven de zeespiegel. Op micro-sectie cambial cellen, de cellen in de uitbreiding fase, de cellen in de verdikte fase en de rijpe cellen herkennen. De tangentiële breedte van het beeld beslaat ~ 1 mm van de houtvaten doorsnede. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

De uitdagingen van een succesvolle en duurzame integratie van houtanatomie in dendroecological onderzoek zijn, afgezien van spruitstuk analytische problemen, vooral te wijten aan technische aspecten. Deze uitdagingen variëren van principe bemonstering benaderingen van het creëren van een hoge kwaliteit micro secties en hun daaropvolgende analyse ^19.

Op het eerste gezicht, de bemonstering van kernen of zelfs schijven is een eenvoudige procedure die bekend is geweest voor vele jaren. Er zijn veel dingen die fout gedaan kan worden en een kleine onnauwkeurigheid in de steekproef kan leiden tot ernstige problemen tijdens de verdere uitwerking en analyse fasen. Kleine onnauwkeurigheden zoals uitboren dat niet precies loodrecht op de steelas hetzij met een onvolmaakt scherp kernboor zijn geen probleem als het doel van het onderzoek is beperkt tot de vereiste breedte over. Wanneer echter het streven naar microscopische analyse van de monsters, kan een verkeerde samplingrichting leiden optische vervormingen vancelwanden, terwijl het gebruik van stompe corers resultaten microscheurtjes in de kern. Hierdoor wanneer het proberen om micro gedeelten van deze kernen gesneden, de dunne secties gewoon uit elkaar vallen en efficiënte bereiding niet meer gewaarborgd. Hetzelfde geldt voor micro-core sampling. Een stompe punt zal resulteren in hoge druk wanneer de puncher wordt gehamerd in de steel hout. Bijgevolg de cambial laag wordt gecomprimeerd. De cambial cellen (figuur 5) zijn derhalve geperst en kan niet worden geanalyseerd.

Bemonstering schijf is inderdaad de beste strategie bij het analyseren van de groei variaties in relatie brengen met veranderingen in het milieu. Helaas is het simpelweg onmogelijk om schijven te nemen van alle bomen die bestemd zijn om te worden bemonsterd voor verdere analyses. Niettemin, vooral bij tropische dendrochronology, een bepaalde hoeveelheid steel schijven nodig in combinatie met boorkernen. De schijven worden gebruikt als basis om de ring grenzen te bepalen en om deze aan de boundar ondersteunenies gedefinieerd op basis van de analyse van boorkernen ^12,27,28.

De voors en tegens van het schuren versus snijden worden besproken ^1,11,21. Zoals hierboven is vermeld, is de beste procedure is altijd afhankelijk van de onderzoeksvraag en de parameters te analyseren (macroscopische of microscopische). Als isotopische of chemische analyses worden geprojecteerd in een verdere werkstap, is het van groot belang dat de schurende stof door schuren die kunnen vullen in cel lumina over het gehele monster wordt voorzichtig opzuigen of perslucht.

Cutting micro secties is voor alle microscopische analyse van de meest geschikte manier van voorbereiding monsters voor verdere analyses. Allereerst wordt het gedeelte afgesneden het monster, dat vervolgens zonder verontreiniging van mogelijke verdere analyses worden gehouden. Tweede deze secties zorgen voor een hoge resolutie metingen van enkele cel parameters. Bovendien vermijden de tijdrovende inbeddingtechniek met een maïszetmeel oplossing ²⁶ de cellen te stabiliseren is een groot voordeel in micro snijden.

Een nadeel van micro snijden is nog steeds de beperkte steekproefgrootte resulterend in lange bereidingstijden. Voor real-time serie analyses gaan terug in de tijd door de eeuwen of zelfs millennia, is er een noodzaak om de bestaande snijinrichtingen ^17,19, maar ook beeldverwerking en analyse ¹⁸ verder te ontwikkelen. Een eerste stap in deze richting is de ontwikkeling van de kern microtoom ²¹ aanvankelijk vervaardigd platte oppervlakken op kernen (figuur 1) snijden. Recente tests bleek het vermogen om micro gedeelten van complete cores gebruik van dit apparaat (figuur 1) snijden.

Hoge kwaliteit micro secties vindt het uitgangspunt voor een effectieve beeldanalyse. Het nemen van de foto's onder een microscoop is een gemeenschappelijke procedure ^19, maar hun effectieve analyse is nog steeds een taak die moetverder worden ontwikkeld ^17. Alle bestaande beeldanalyse systemen semi-automatische, dat wil zeggen ze moeten meer of minder intens gecontroleerd door de technicus. In veel gevallen moet de beelden worden gecorrigeerd of zelfs nieuwe beelden moeten worden gedaan om het contrast voor een betere registratie van de structuren die door de software te verbeteren zonder dat de cel wanddikte in het beeld.

Gespecialiseerde beeldanalyse tools als Roxas ^18, WinCell of specifieke scripts voor ImageJ ²⁹ zijn in staat om fundamentele anatomische gegevens zoals het aantal cellen, cel dimensie, celwand dikte en cel positie binnen de jaarring bieden. Verscheidene extra anatomische statistieken die relevant in een dendroecological benut kan worden berekend uit deze basismetingen zoals grootte van de grootste leidingen, grootteverdeling van leidingen, grootte van voorjaarshout of de eerste rij van leidingen, (optische) hout dichtheid, intra-jaarlijkse profielen van Wartelmaat en celwanddikte en groeperen patronen leidingen (solitair, veelvouden, etc.).

Met behulp van de software Roxas ^18, worden de contouren van de leiding lumina (dat wil zeggen, water uitvoeren cel) en jaarring grenzen automatisch herkend en visueel voorgesteld als overlays op de oorspronkelijke afbeelding. Detectie-algoritmen voor leidingen zijn gebaseerd op de kleur, grootte en informatie vorm, algoritmen voor ring grenst aan de lokale context van elke leiding. Een toolbox stelt ons in staat om deze resultaten handmatig te verbeteren door het direct bewerken van de overlay-functies, dat wil zeggen, het verwijderen, het toevoegen en wijzigen van de ring grenzen en conduit schetst. Na het bewerken van de laatste data-uitgang, zoals mobiele wanddikte (coniferen), wordt automatisch gegenereerd en opgeslagen in een spreadsheet. Volledig geautomatiseerde systemen zijn momenteel niet beschikbaar, ook niet voor coniferen met een relatief eenvoudige structuur, maar dit is een doel voor toekomstige ontwikkelingen. Dit zou een groot voorstander van de full integratie van houtanatomische parameters in tijdreeksanalyses.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Increment corer			http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en
Core-Microtome			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Laboratory microtome			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Trephor micro corer			http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
Nawashin solution			Tien delen 1% chroomzuur, vier delen 4% formaldehyde en één deel azijnzuur
Picric-Anilin blauw			Eén deel verzadigde aniline blauw en vier delen Trinitrofenol opgelost in 95% ethanol
Safranine			Empirische formule (Hill-notatie) C20H19ClN4
Astra-blauw			Empirische formule (Hill-notatie) C47H52CuN14O6S3
Ethanol			Lineaire formule CH3CH2OH
Xylol (Xyleen)			Lineaire formule C6H4(CH3)2
Canada Balsam			Inbeddingsoplossing voor microscopie
Roxas Software			http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software			http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell			http://imagej.nih.gov/ij/