Voorbereiding, Imaging, en kwantificeren van Bacteriële Surface Motility Testen

Summary

Zwermen motiliteit wordt beïnvloed door fysische en omgevingsfactoren. We beschrijven een tweefasenprotocol en richtlijnen om de uitdagingen die gewoonlijk worden geassocieerd met zwermtestvoorbereiding en gegevensverzameling te omzeilen. Een macroscopische beeldtechniek wordt gebruikt om gedetailleerde informatie over zwermgedrag te verkrijgen die niet wordt geleverd door huidige analysetechnieken.

Abstract

Bacteriële oppervlakte motiliteit, zoals zwermen, gewoonlijk in het laboratorium onderzocht met plaatanalyses die specifieke concentraties van agar en soms opname van specifieke voedingsstoffen in het groeimedium noodzakelijk. De bereiding van dergelijke expliciete media en groeioppervlak voorwaarden dient om de gunstige voorwaarden die niet alleen de groei van bacteriën, maar gecoördineerde beweeglijkheid van bacteriën op deze vlakken binnen dunne vloeibare films toe te staan. Reproduceerbaarheid van zwerm plaat en andere oppervlakte beweeglijkheid plaatanalyses kan een grote uitdaging zijn. Speciaal voor meer "gematigde zwermers" die de beweeglijkheid vertonen alleen binnen agar reeksen van 0,4% -0,8% (gew / vol), kleine wijzigingen in het protocol of het laboratorium omgeving kan een grote invloed hebben zwerm test resultaten. "Bevochtigbaarheid" of watergehalte aan het vloeistof-vaste stof-luchtinterface deze plaatanalyses, vaak een belangrijke variabele te controleren. Een extra uitdaging bij de beoordeling van zwermen is hoe te kwantificeren oBServed verschillen tussen twee (of meer) experimenten. Hier hebben we in detail een veelzijdige twee-fasen-protocol voor te bereiden en het imago zwerm assays. Wij zijn onder andere richtlijnen om de uitdagingen vaak geassocieerd met zwerm assaymedium voorbereiding en kwantificering van de gegevens van deze testen te omzeilen. We specifiek tonen onze methode met behulp van bacteriën die fluorescerende of bioluminescent genetische reporters zoals groen fluorescerend eiwit (GFP), luciferase (lux operon) te uiten, of cellulaire vlekken aan time-lapse optische beeldvorming mogelijk te maken. We het vermogen van onze werkwijze te sporen concurrerende zwermen species in hetzelfde experiment verder aan te tonen.

Introduction

Veel bewegen bacteriën op oppervlakken met behulp van verschillende middelen van zelf-voortstuwing. Sommige beweeglijkheid fenotypes kunnen worden onderzocht in het laboratorium met behulp plaatanalyses die worden beïnvloed door het vloeibare milieu in verband met de halfvaste plate assay samenstelling. Een subset van bruikbare oppervlakte beweeglijkheid plaatanalyses nog meer te betrekken een gasfase-typisch lucht in de ruimte. Bijgevolg is de uitkomst van een bepaald oppervlak beweeglijkheid test, vraagt ​​een zorgvuldige controle van de interface van de drie fasen: het lokale milieu stevige ondergrond, vloeibaar milieu, en gas milieu-eigenschappen.

De meest bestudeerde motiliteit modus dergelijke driefasige assay bekend als zwermen. Zwermen beweeglijkheid is de gecoördineerde groep beweging van bacteriële cellen die worden voortgestuwd door hun flagella door dunne vloeibare films op oppervlakken ^1. Het wordt meestal onderzocht in laboratoria met behulp van semi-vaste plaatanalyses die 0,4% -0,8% (w / v) agar ^1. Een array vanhumane pathogenen benutten deze beweeglijkheid gedrag te verkennen en te koloniseren de menselijke gastheer. Bijvoorbeeld, Proteus mirabilis gebruikt zwermen beweeglijkheid overgaan tot de plasbuis, het bereiken en kolonisatie van de blaas en nieren ^2. Swarming motiliteit wordt algemeen beschouwd als een voorloper stap biofilm vorming, de primaire oorzaak van pathogenese in vele menselijke pathogenen ^3.

De zwermen fenotype is zeer gevarieerd tussen bacteriesoorten; experimenteel succes en reproduceerbaarheid sterk afhankelijk van factoren zoals nutriëntensamenstelling type agar en samenstelling, sterilisatie protocol (bijvoorbeeld autoclaaf), semi-vaste media uitharden en ambient vocht (bijv seizoensinvloeden), onder anderen ^3-5. De variabiliteit van de oppervlakte van de beweeglijkheid reacties benadrukt de uitdagingen in deze studies en de aanmerkelijke invloed media en milieu kan uitoefenen. Voor sommige zwermen soorten, zoals Pseudomonas, zwermen motiliteit kan optreden op een verscheidenheid van media-composities, hoewel de waargenomen fenotype en bijbehorende zwerm uitbreidingstarief sterk ³ zal variëren. Gecombineerd, deze factoren kunnen het oppervlak beweeglijkheid studies zeer uitdagend maken. Seizoensgebonden variabiliteit binnen een laboratorium kan deze drie-fase testen beïnvloeden: testen kunnen beter in de vochtige lucht van de zomer en slechter in de droge lucht van de winter functioneren. Hier presenteren we algemene richtlijnen om een ​​aantal van de meest opmerkelijke uitdagingen omzeilen bij het uitvoeren van het oppervlak beweeglijkheid plaat studies.

Voor sommige oppervlak beweeglijkheid studies, de ontwikkeling van specifieke fenotypes is van groot belang. De meeste, maar niet alle, gepubliceerde studies naar zwermen van P. onderzoeken aeruginosa tonen de vorming van ranken of fractals die uitlopen van een inenting centrum ^3-9. Verschillen tussen P. aeruginosa stammen zijn gedocumenteerd ^5,8, maar veel van de aanwezigheid of afwezigheid van ranken kan worden toegeschreven aan de specificatiesc middelgrote en protocol dat wordt gebruikt voor deze zwerm beweeglijkheid plaatanalyses. Hier behoren we informatie over hoe u-rank vormen zwermen voor P. bevorderen aeruginosa. Omdat P. aeruginosa is slechts een van de vele zwermen bacteriën, we ook informatie voor onze methode om zwermen van Bacillus subtilis en glijden van Myxococcus xanthus onderzoeken. Zoals P. aeruginosa, lopende onderzoek naar B. subtilis en M. xanthus overspant een scala aan onderwerpen als onderzoekers werken aan aspecten van sporulatie, beweeglijkheid, stress respons, en overgangsbepalingen gedrag ^1,10 onderscheiden. Het is noodzakelijk om de patronen en de dynamiek van het specifieke gedrag (en) voor deze cellen kwantificeren zwermen groepen.

Oppervlak beweeglijkheid data-acquisitie, kunnen analyseren en interpreteren omslachtig en kwalitatief zijn. We hebben een protocol ontwikkeld voor de gedetailleerde macroscopische analyse van bacteriële zwermen dat in aanvulling biedt op zone morfologie en s zwermenize (bv diameter), kwantitatieve dynamische informatie met betrekking tot zwerm uitbreidingstarief en bacteriële of bioproduct dichtheid distributie ^7. Verder kan deze werkwijze gebruik maken van beschikbare fluorescerende eiwitten, luminescentie en kleurstoffen om een volledig beeld van bacteriële interacties ⁸ te verkrijgen, alsook de synthese van Bioproducts (bijvoorbeeld P. aeruginosa rhamnolipide ^7,8) binnen een zwerm volgen.

Protocol

1. Swarm Assay Media Voorbereiding en Inenting ^4,5,7,8,11

1. Mediavoorbereiding
   OPMERKING: De mediumsamenstelling hieronder beschreven voor P. aeruginosa rank vorming studies. Zie Specificaties afdrukmateriaal op tabel 1 voor P. aeruginosa, B. subtilis, en M. xanthus oppervlak beweeglijkheid testen.
   1. Meng 200 ml FAB-minus _{(NH4) 2 SO4} zwerm medium (Materials Table), 0,9 g Noble agar en 0,2 g Casaminozuren (Tabel 1) door roeren met een magnetische roerstaaf. Gebruik kleine hoeveelheden (100-300 ml) om de samenhang tussen experimenten te verbeteren.
   2. Autoclaaf 200 ml agar / Media mengsel met een belichtingstijd van 22 min, blootstelling temperatuur van 121,1 ° C en een snelle ventilatiestand. De autoclaaf instellingen zal een goede sterilisatie en agar smelten toe te staan, maar voorkomen agar caramellisatie.
      OPMERKING: Noble agar is gevoelig voor caramelsatie; bacteriële beweeglijkheid wordt gewijzigd op gekarameliseerde agar.
   3. Onmiddellijk na de sterilisatie cyclus is afgerond, sluit de dop van de media fles om waterverlies te voorkomen door verdamping. Merk echter op dat strakke aftopping een "vacuumsealing" kunnen veroorzaken achtige effect op de fles.
   4. Koel de media tot 50 ° C onder roeren bij kamertemperatuur (RT) en 2 ml steriele 1,2 M glucose. Als alternatief kunt u de media in een 60 ° C incubator of waterbad tot gebruik (tot 15 uur later) en handel verder als beschreven. Om de vorming van belletjes in de media te voorkomen, meng grondig met de magnetische roerstaaf; bellen op het oppervlak van de agar voorkomt zelfs zwermen.
      OPMERKING: Bij andere testen, voeg in deze stap hittegevoelige componenten die niet kunnen worden geautoclaveerd zoals extra nutriënten of kleurstoffen, indien nodig (bijvoorbeeld toevoeging van 8 pi Invitrogen Syto 63 kleurstof per 100 ml gesmolten agar beeld M. xanthus zoals in Representative resultaten hieronder). Toevoeging van sommige kleurstoffen kunnen basislijn zwermen gedrag, dat moet worden gecontroleerd tegen een niet-kleurstof negatief beïnvloeden.
   5. In een laboratorium kap, aliquot 7,5 ml steriele media per 60 mm polystyreen petrischaal en onderhouden van de platen in een enkele laag (niet gestapeld). Voor grotere zwermen oppervlakte, hoeveelheid 25 ml medium per 100 mm petrischaal. Het is belangrijk om de schotels op een vlakke horizontale oppervlak vullen. Gebruik ooghoogte van een stier om te controleren of het oppervlak wordt genivelleerd.
      OPMERKING: Voor P. aeruginosa assays, met behulp van een specifiek media-volume per plaat zal consistentie en reproduceerbaarheid te verbeteren. Voor B. subtilis en M. Xanthus assays, hand gieten resultaten oplevert die vergelijkbaar zijn met specifieke volume porties.
2. Plaat uitharding
   1. Voor kleine platen (60 mm), zodat het gesmolten agarmedium harden (beide op semi-vaste en droge overmaat vloeistof) in de kap ontdekt (dwz zonder deksel) gedurende 30 min. Groterplaten (100 mm) vereisen een langere uithardingstijd (zie bespreking).
      Opmerking: Als alternatief kunnen sommige testen platen vereisen uitharden op werkblad overnacht (20-24 uur) onder (dwz deksels op) in een enkele laag (tabel 1). Zwermen is gevoelig voor zowel overtollig en onvoldoende vocht. De luchtvochtigheid, luchtstroom, en de temperatuur van een bepaalde lab kan variatie noodzakelijk tot het bord genezen van een optimale zwermen van je bacterie te bevorderen.
   2. Te enten platen onmiddellijk na het drogen periode voorbij is. Laat de platen voor verder gebruik niet bewaren.
      1. Voer de "inkt spread test" door het spotten van een test plaat met 10 pi mengsel van 0,50% (vol / vol) Higgins Waterdichte Zwarte Inkt van India en bacterieel inoculum ^11. Als de inkt / inoculum mengsel verspreidt gemakkelijk (dus niet behouden druppelvorm) op het oppervlak van de media, zal de media extra droogtijd nodig.
         OPMERKING: Voor soorten die bijzonder gevoelig zijn voor vocht ( bijvoorbeeld, P. aeruginosa) KORT "ink spread test" ¹¹ om te bepalen of de platen droog genoeg.
3. Zwerm Assay Inenting
   1. Te enten 6 ml bouillon voedingsbodems (zie tabel 1 voor details) met een geïsoleerde kolonie uit een nieuw (<5 dagen oud als ze op kamertemperatuur) lysogenie bouillon (LB) plaat cultuur. Incubeer overnacht bouillonkweken (≤18 uur) bij 30 ° C of 37 ° C met horizontale schudden (240 rpm).
   2. Te enten zwerm platen door het spotten met 1-5 ul van overnight bouillon cultuur, of door "porren" de agar met een steriele tandenstoker of draad inenting naald.
      LET OP: Wij geven de voorkeur de laatste methode, omdat het vermindert de kans op spatten de entstof en voorkomt het toevoegen van extra vocht aan de zwerm oppervlakte.
4. Zwerm Assay Incubation
   1. Voor algemene assay incubeer zwerm assay platen bij 30 °C of 37 ° C (of 42 ° C voor B. subtilis; Tabel 1) -dit is bacterie specifiek. Inverteer de platen tijdens de incubatie zodat overtollig vocht condenseert op het deksel, niet de agar.
      Opmerking: De temperatuur kan beïnvloeden fenotype en kinetiek. Voor P. aeruginosa zwermen, incubatie bij 37 ° C leidt tot snellere groei en expansie zwerm dan incubatie bij 30 ° C; De morfologie van deze zwermen dikwijls verschilt met deze verandering in temperatuur.
   2. Voor time-lapse imaging, incubeer zwerm platen bij de geschikte temperatuur vóór de overdracht naar het beeldvormende station (zie tabel 1 voor details).
      Opmerking: Deze pre-incubatie imaging maakt zwermen hun ontwikkeling te starten en vestigen voordat ze naar een nieuwe omgeving, al dan niet optimaal zwermen beweeglijkheid zijn.

2. Macroscopische Imaging van Surface Motility Testen ^7,8

1. Voor time-lapse imaging, na de pre-imaging incubatietijd plaats zwerm assayplaten op een duidelijke beeldvorming plaat in een commercieel in vivo beeldvorming station. Afbeelding maximaal zes 60 mm diameter of vier 100 mm platen tegelijk. Omdat de camera legt beelden van onder het beeldvlak, draai de platen, zodat de optische weg niet wordt belemmerd ^8. Alternatief, incubeer bij 30 ° C of 37 ° C (Tabel 1) gedurende de duur van het experiment, en verwijder de platen af te beelden van de incubator op vaste tijdsintervallen.
2. Plaats de deksels van de petrischaaltjes rechtop op de top van de plaat tegenhanger dat de geënte medium houdt. Vul de deksels van de petrischalen met water om uitdroging tijdens de beeldvorming te voorkomen, en omsluiten de gehele set up met behulp van een andere duidelijke lade om de vochtigheid gedurende het experiment te houden.
3. Met Molecular Imaging (MI) software ^12, draaien assay (s) bij kamertemperatuur met behulp van de imaging instellingen in tabel 2 beschreven. Voor time-lapse imaging, het opzetten van een protocol met de nodige stappen en specificaties.

3. dataverwerking en interpretatie van ^7,8

1. Beeldverwerking
   1. Gebruik MI software om batch afbeeldingen exporteren als 16-bits TIFF-bestanden: Bestand> Exporteer of Exporteer meerdere> Selecteer bestand (en) te exporteren en export locatie.
   2. Gebruik ImageJ om een ​​enkele afbeelding te openen of importeren een time-lapse-serie:
      1. Open een enkel beeld: File> Open
      2. Import time-lapse beeldsequentie: Bestand> Importeren Sequence, en selecteer "Sorteren namen numeriek".
         1. Voor grotere time-lapse-bestanden, selecteer "Gebruik virtuele stack" in het venster "Importeren Sequence" om de geëxporteerde afbeeldingen stapelen in de juiste categorieën (dwz, GFP, RFP, etc.).
   3. Desgewenst beelden van 16-bits bestanden 8-bits bestanden veranderen: Afbeelding> type> 8-bit
      OPMERKING: Sommige ImageJ gereedschap nodig 8-bits afbeeldingen.
   4. Bepaal of de intensiteit signaal voor een beeld of time-lapse sequence moet worden omgekeerd. Plaats de cursor op een lichte plek in het beeld (bijvoorbeeld, fluorescent gelabelde groei) en let op de intensiteit van het signaal "Waarde" van de werkbalk ImageJ. Vervolgens plaatst u de cursor op een donkere plek buiten de plaat gebied en let op de intensiteit van het signaal. Als de signaalintensiteit voor de donkere vlek groter is dan de intensiteit van het lichtpunt, het beeldsignaal intensiteit dient te worden geïnverteerd (volg substappen 1-2 hieronder).
      1. Keer de intensiteit signalen: Bewerken> Omkeren
      2. Keer de opzoektabel: Image> Lookup Tables> Omkeren LUT
   5. Aftrekken van de achtergrond: Proces> Aftrekken achtergrond, en gebruik een "rollende bal radius" met een pixel straal dat is de ene helft van het ene beeld dimensie (bijvoorbeeld 1000 pixels voor een 2000 x 2000 pixel afbeelding).
   6. Kunstmatig kleur een beeld of time-lapse filmpje: Image> Lookup Tafels, en selecteer de gewenste kleur uit de lijst met opties.
   7. Voor films met twee of meer kanalen, samen te voegen en de balans van de kleuren voorafgaand aan het opslaan als een film (Image Processing, Stap 8). Om beelden samen alle image stapels in ImageJ fuseren, open, selecteer vervolgens Afbeelding> Kleur> Kanalen samenvoegen, en wijst elke stapel om een ​​kleur kanaal.
   8. Bespaar tijd-lapse volgorde als AVI of QuickTime-film: Bestand> Opslaan als en kies de gewenste indeling en specificaties.
2. Data-Analyse
   1. Verwerven Bacteriële Surface groeigebied te kwantificeren Uitbreiding Rate
      1. Open afbeelding (en) in ImageJ
      2. Aan de diameter van de plaat in pixels berekenen, trek een lijn over het midden van een assay plaat met de "Straight" tool van de en meet de lengte: Analyze> Measure
      3. De standaard meeteenheid in ImageJ is de piXel. Verkrijgen van een omrekeningsfactor van delen van de diameter van de testplaat (bijvoorbeeld 60 tot 60 mm plaat) van de pixel lengte verkregen in de vorige stap.
      4. Verander de maateenheid van pixel naar mm: Beeld> Eigenschappen
         1. Verander de "eenheid van lengte" naar "mm", en de "Pixel Breedte", "Pixel Hoogte" en "voxel Depth" om de conversie factor berekend in de vorige stap. Selecteer de "Global" vakje aan om deze omrekeningsfactor over meerdere afbeeldingen te behouden.
            OPMERKING: Als ImageJ is gesloten en heropend, of het gezichtsveld van een afbeelding wordt gewijzigd (dat wil zeggen, het ene beeld wordt ingezoomd meer dan de andere), dient de omrekenfactor worden herberekend. Als alternatief voer alle analyses in pixels en vervolgens omgezet in mm.
      5. Voor elk frame, sporenelementen en meet de zwerm gebied met behulp van de "Freehand Selecties" tool in de werkbalk aan de ou tracerentline van de zwerm en meet het gebied met behulp van: Analyze> Meet. Dit zal leiden tot een metingen log dat kan worden opgeslagen voor verdere analyse in Microsoft Excel of soortgelijke programma's: Bestand> Opslaan als
   2. Verwerven Bacteriële Surface Groei Intensity te kwantificeren Surface Growth Rate
      1. Zodra de achtergrond is afgetrokken (Image Processing, stap 5), gebruikt het laatste frame van de reeks om de maximale oppervlakte van zwerm (Data Analysis, Stap 1) te bepalen.
      2. Gebruik de "Oval" selectie gereedschap in de werkbalk om een ​​vak te tekenen rond de bacteriegroei oppervlak.
      3. Stel de gemiddelde intensiteit meting van pixels in de doos met: Analyze> Set Metingen en selecteer "Mean grijswaarde".
      4. Om de intensiteit signaal metingen te verkrijgen voor elk frame in de time-lapse sequence, terwijl op de eerste frame van de reeks ga naar: Analyze> Meet. Dit zal leiden tot een metingen log dat kan worden opgeslagen voor verdere analyse in Mitevens het programma Microsoft Excel of soortgelijke programma's: Bestand> Opslaan als
   3. Alternatief voor de vorige sectie (Data Analysis, stap 2). Gebruik de ImageJ Macro's plugin te installeren en uitvoeren van een macro groeioppervlak verschillende meetwaardes script.
      1. Setup een geautomatiseerde meting script om meerdere frames te analyseren tegelijk: Plugin> Nieuw> Macro, en plak het script van (onder) in het vak en opslaan als een ImageJ Macro's tekstbestand: Bestand> Opslaan en opslaan in de map ImageJ aanvraag op grond van " macros ".
         numberOfFrames = N
         for (i = 0; i lopen ('Measure');
         lopen ('Next Slice [>]');
         }
         LET OP: Hier de variabele "N" is voor onbepaalde aantal frames.
      2. Bewerk het "numberOfFrames" in de macro plugin voor elk experiment om het aantal frames in de reeks beelden voor het script weerspiegelen. Gebruik: Plugin> Macro's>Bewerken en typ het juiste aantal frames in de sequentie en opslaan (Bestand> Opslaan).
      3. Volg deelstappen 1-3 in Data Analysis-Step 2, en terwijl op de eerste frame van de reeks lopen de Macro's plugin: Plugin> Macro's> Uitvoeren. Dit zal leiden tot een metingen log dat kan worden opgeslagen voor verdere analyse in Microsoft Excel of soortgelijke programma's: Bestand> Opslaan als

Results

Variatie in plaat voorbereiding kan een grote invloed zwermen beweeglijkheid. Het uitharden of droogtijd na het gieten van gesmolten agar medium beïnvloedt de dunne vloeistof die aanwezig is op het oppervlak beweeglijkheid assays en de bacteriële beweeglijkheid in de tijd. Verloop in voedingsstoffen beïnvloeden ook zwermen enkele bacteriën. Figuur 1A toont een korte termijn effect van droogtijd op verspreiding van India Inkt en verspreiding van een initiële inoculum van Bacillus subtilis ^11. Figuur 1B toont het effect van de droogtijd en Figuur 1C toont de effecten van ammoniumsulfaat _{[(NH4) 2 SO4]} bij aansluitende rank ontwikkeling door zwermen P. aeruginosa ^5.

Kwantificeerbare gegevens kunnen worden verkregen uit eindpunt beelden van het oppervlak beweeglijkheid gebruik van meerdere beeldvorming strategieën. Figuur 2 toont vertegenwoordiger groeioppervlak resultaten voor P. haar imago geassocieerd GFP fluorescentie aeruginosa zwermende en B. haar imago geassocieerd bioluminescentie subtilis zwermen en; en Myxococcus xanthus de bijbehorende rode fluorescentie beeld van SYTO oppervlak groei en de 64-gekleurde cellen.

Uitbreiding van data acquisitie dan alleen controle en beeldvorming van eindpunt resultaten mogelijk is voor de studie van dynamische gedrag (en) voor oppervlakte groeiende bacteriën. Figuur 3 ⁷ toont een voorbeeld van P. aeruginosa zwermen (afgebeeld voor GFP tot expressie cellen) en de bijbehorende rhamnolipide productie (afgebeeld met behulp van Nile Red lipide vlek) -het kwantificering van de gegevens van deze beelden wordt ook weergegeven op de uitbreiding snelheid van P. tonen aeruginosa zwermen. Video 1 toont een time-lapse van B. subtilis zwermende afgebeeld met behulp van luminescentie van een lux -waar stam. Video 2 ⁸ toont een time-lapse van P. aeruginosa (groen die GFP) en Salmonella enterica serovar Typhimurium (rood-uiting lux) in een competitieve zwerm assay.

Figuur 1: Voorbeelden van factoren oppervlak motiliteit assay preparaat assay resultaat Effect van (A) agar droogtijd op agar oppervlak vocht beïnvloeden en verspreiding van inoculum voor B.. subtilis (Ref ^8), (B) agar droogtijd op blz aeruginosa zwermen (Herdruk van Ref ⁵ met toestemming), en (C) de aanwezigheid of afwezigheid van ammoniumsulfaat op P. aeruginosa swarming en rank formatie.

Figuur 2: Alternative aanpak voor groei beeldvorming oppervlak en de beweeglijkheid van bacteriën met een Bruker afbeelding (rechts) Bruker imaging station. Side kant beeld van een camera (links) door en het tonen van (A) P. aeruginosa expressie GFP afgebeeld met behulp van groene fluorescentie instellingen (B) B. subtilis tot expressie lux bioluminescentie-reporter afgebeeld met behulp Luminescentie instellingen, en (C) M. xanthus gekleurd met SYTO 64 afgebeeld met behulp instellingen rode fluorescentie II. Zie tabel 2 voor het instellen van details.

Figuur 3:. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van een oppervlakte beweeglijkheid test (A) Time-lapse analyse van de distributie celdichtheid, rhamnolipide productie (Nile Red lipide vlek in beeld gebracht met behulp van de rode fluorescentieIk instellingen; schaal bar = 15 mm), en (B) kwantificering van de expansie vanaf distributie celdichtheid beelden van een P. aeruginosa zwerm. (Overgenomen uit Ref ⁶ met toestemming.)

Video 1. Time-lapse beeldvorming van een B. subtilis zwerm. B. subtilis uiten lux en opgenomen met de Luminescentie instellingen. Zie tabel 2 voor het instellen van details.

Video 2. Interspecies concurrentie gevisualiseerd door time-lapse imaging. Zwermen P. aeruginosa (groen; die GFP en vastgelegd met behulp van de groene fluorescentie-instellingen) en S. enterica serovar Typhimurium (rood; expreszingen lux en opgenomen met de Luminescentie instellingen). Zie tabel 2 voor het instellen van details. (Herdruk met toestemming van Ref. ⁷⁾

	P. aeruginosa	P. aeruginosa rank vorming studies	B. subtilis	M. xanthus
Overnachting bouilloncultuur media	FAB plus 30 mM Glucose	FAB plus 30 mM Glucose	POND	CTT
Overnachting bouilloncultuur incubatie temperatuur	37 ° C	37 ° C	37 ° C	30 uur bij 30 ° C
Zwerm media	FAB	FAB minus (NH4) 2 SO4	2% (gew / vol) LB	CTT
Zwerm media: extra onderdelen	12 mM Glucose een	10% (gew / vol) CAA, 12 mM Glucose een	n / a	SYTO® 64 een
Agar soort	Agar, Noble	Agar, Noble	Kristalsuiker agar	Agar, Noble Affymetrix
Agar concentratie (gew / vol)	0,45%	0,45%	0,60%	1,50%
Zwerm plaatgrootte	60 mm	60 mm	100 mm	150 mm
Media volume per plaat	7.5 ml	7.5 ml	Hand Gegoten	Hand Gegoten
Swarm media-instelling / drogen methode	Hood; platen ontdekt	Hood; platen ontdekt	Tafelmodel; platen bedekt	Tafelmodel; platen bedekt
Swarm media-instelling / droogtijd	30 min	30 min	Overnachting (20 -24 uur)	Overnachting (20 -24 uur)
Zwerm assay incubatie temperatuur	30 of 37 ° C	30 ° C	37 ° C	30 ° C
Incubatietijd voor time-lapse imaging	30 ° C gedurende ten minste 4 uur	30 ° C gedurende ten minste 4 uur	37 ° C gedurende 2 uur	RT gedurende 12 uur
Time-lapse-opname lengte	24 hr	24 hr	10 hr	66 hr
Time-lapse-instelling	1 frame / 10 min	1 frame / 10 min	1 frame / 6 min	1 frame / 10 min
een Toegevoegd na het autoclaveren.

Tabel 1:. Specificaties voor Surface Motility Assay Voorbereiding Inclusief oppervlakmotiliteit assay voorbereiding specificaties voor P. aeruginosa, B. subtilis, en M. Xanthus.

Signaal	Groene fluorescentie	Rode fluorescentie I	Rode fluorescentie II	Luminescentie
Eiwit of kleurstofvoorloper	Groene Fluorescentie Eiwit (GFP)	mCherry eiwit of Nile Red rhamnolipide vlek	SYTO® 64	Luciferase van lux operon
Golflengte (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Af
Emissie golflengte (nm)	535 ± 17,5	600 ± 17,5	670 ± 17,5	Geen filter
Belichtingstijd (sec)	30	60	60	240
f- stop	4.0	4.0	2.5	1.1
FOV (mm)	190	190	140	120
Focal plane (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Binning (pixels)	Geen Een	2 x 2	Geen Een	8 x 8

Tabel 2: Imaging Specificatie Bruker imaging station specificaties voor rode en groene fluorescentie en luminescentie beeldvorming van bacteriële groei oppervlak..

Discussion

Het bereiken van reproduceerbare zwermen in een laboratorium kan lastig zijn, zoals zwerm assays zijn zeer gevoelig voor omgevingsfactoren, zoals vochtigheid en beschikbare nutriënten. De meest kritische aspect van een oppervlak motiliteit plaatassay is vocht op het agar oppervlak. Voorafgaand aan inoculatie, moet zwerm media droog genoeg om te voorkomen bacteriële cellen van zwemmen over het oppervlak vloeistof, maar niet zo droog remmen zwermen motiliteit ⁵ zijn. Incubatie dient plaats te vinden in een voldoende vochtige omgeving: te weinig vocht kan leiden tot de test uitdrogen tijdens de incubatie, terwijl te veel vocht kan leiden tot kunstmatige of artefactuele oppervlak verspreiden. Tenzij een luchtvochtigheid gecontroleerde incubator is bij de hand, kan incubator en laboratorium luchtvochtigheid sterk variëren. Bijgevolg zou een extra waterreservoir, een luchtbevochtiger, of een ontvochtiger in de incubator worden verplicht om te voorkomen dat over het drogen of de ophoping van overtollig vocht terwijl de relative luchtvochtigheid in de buurt van 80%. Het handhaven van deze ideale luchtvochtigheid evenwel geen sinecure als seizoensgebonden luchtvochtigheid wijzigingen aanzienlijk zijn. Als dit het geval is, zal de zwerm testprotocol enige aanpassingen te verantwoorden seizoensgebonden veranderingen in de luchtvochtigheid. We hebben ontdekt dat het wijzigen van de zwerm media droogtijd is de eenvoudigste manier om te corrigeren voor seizoensgebonden veranderingen in de luchtvochtigheid. Constant vochtigheidsmeting, zowel binnen als buiten de incubator, wordt aanbevolen. Verder is het raadzaam dat onderzoekers kalibreren en valideren van hun instrumenten, incubators, schalen, enz. Als kleine fouten in temperatuur, volume of de hoeveelheden van de media onderdelen kan beïnvloeden reproduceerbaarheid van deze testen.

Ook moet worden opgemerkt dat het type en de grootte van de plaat die in de test beïnvloeden plaat vocht en dus zwermen. Luchtdichte platen hebben geen vent het overtollige vocht, dus bemoedigend zwemmen beweeglijkheid. In tegenstelling openliggend platen laten te veel vocht kan ontsnappen. Een petrischaalbiedt een ideale omgeving, omdat het vents off genoeg overtollig vocht te voorkomen dat vloeistof bouwen, maar behoudt voldoende vocht om de media niet uitdroogt. Deze methode Gegevens van een oppervlak beweeglijkheid test protocol dat zorgt voor een hoge beeldkwaliteit. Om de agar duidelijk voor de beeldvorming van 60 mm diameter gerechten worden gevuld met 7,5 ml agar media te houden. Als gedetailleerde beeldvorming niet vereist, kunnen volumes tot 20 ml tevens reproduceerbare resultaten.

Terwijl zwermen beweeglijkheid kan worden bereikt op een breed scala van agar-concentraties, het optimale bereik van agar vereist voor zwermen is afhankelijk van de soort. Kortom, agar hogere concentraties remmen zwermen beweeglijkheid, en bijgevolg de tijd die nodig is om een beeld ready zwerm toeneemt produceren. P. aeruginosa wemelt het algemeen op agar concentraties van 0,4-0,7% ^1, maar we vinden dat optimaal zwermen voorkomt in een veel beperkter assortiment (0,4-0,5%). Anderen, zoals B. subtilis en S. enterischeeen zwerm op 0,6% agar, en Vibrio parahaemolyticus op 1,5% agar ^10. De benodigde agar concentratie wordt ook bepaald door het type en merk van agar. Hogere zuiverheid agars, zoals Noble agar, sterk verbeteren zwermen in P. aeruginosa en voorkeur boven gegranuleerd agar ^13,14. Echter, deze gezuiverde versies agar zijn ook meer vatbaar voor caramelization in de autoclaaf sterilisatie cyclus; afhankelijk van het instrument, een verkorte / gewijzigde sterilisatie reeks (om eventueel de uitlaat cyclus veranderen om langdurige blootstelling aan hitte te voorkomen) kan worden verplicht om zwerm media bereiden met behulp van Noble agar.

Media samenstelling speelt ook een rol in de waargenomen zwerm fenotype ^3. P. aeruginosa zwermen beweeglijkheid studies worden meestal uitgevoerd met behulp van minimale voedingsbodems. Wij geven de voorkeur FAB medium ^4,8 (Materials tabel), maar ook andere media, zoals M9, LB, of lichte variaties op deze gemeenschappelijke media,zijn met succes toegepast ^9,15,16. Rank vorming best verwezenlijkt FAB minimaal medium aangevuld met glucose als koolstofbron en casaminozuren (CAA), maar zonder extra stikstofbron (dwz, _{(NH4) 2 SO4)} ^6,13. Als rank vorming of de morfologie is niet de belangrijkste focus van de studie, dan is FAB minimaal medium (Materials tabel; tabel 1) verstoken van CAA wordt aanbevolen, zodat de effecten van specifieke koolstof bronnen en / of aanvullende voedingsstoffen kunnen in detail bestudeerd worden. Andere soorten, zoals B. subtilis (hier voorgesteld), zijn veelzijdig zwermers, staat zwermen op LB en kristalsuiker agar. Deze soorten zwerm gemakkelijk, waarvoor slechts ~ 10 uur om een ​​volledige zwerm ontwikkelen. Deze snelle zwermen tarief maakt naar aanleiding van de progressie van de zwerm potentieel moeilijke maar ons protocol maakt zoals het bijhouden van zeer haalbaar. De mogelijkheid om zwerm time-lapse imaging uitvoeren biedt een substantietieel gemak in zwerm data-acquisitie, met name uit zulke fanatieke zwermers.

We introduceren een robuuste, uitgebreide, twee-fasen-protocol en richtlijnen die gericht zijn op het verbeteren van de uitvoering en de reproduceerbaarheid van bacteriële oppervlakte beweeglijkheid onderzoek en zijn in de eerste plaats benadrukt aspecten belangrijk om-flagellaire gemedieerde zwermen onderzoeken. Deze zwerm assay protocol Gegevens belangrijke aspecten van media samenstelling en de behandeling van het oppervlak beweeglijkheid platen te zorgen voor meer consistentie en reproduceerbaarheid binnen en tussen onderzoeksgroepen. Dit zal de basis van de vergelijking tussen de verschillende onderzoeken te verbeteren. Bovendien, de gepresenteerde aanpak en protocol verschaft middelen voor onderzoek zwermen en oppervlakte beweeglijkheid minder gevoelig omgevingvariaties maken door onderzoekers bekend dat dergelijke factoren beïnvloeden hun werk te verlenen oplossingen (bijvoorbeeld hoe kleine veranderingen in agar beïnvloeden zwermen ^4,5 ). Bovendien, het protocol verstrektkwantificeren macroscopische aspecten van zwermen, biedt de mogelijkheid om vele attributen van de bacteriële groei oppervlak die voorheen als onberekenbare meten.

We hebben nog niet alle oppervlakte-beweeglijke bacteriën onderzocht in de ontwikkeling van dit protocol. Als zodanig wordt verwacht dat protocol aanpassingen nodig zijn voor soorten hier gepresenteerd. De efficiëntie van dit protocol wordt beperkt door de inherente beperkingen van de apparatuur en materialen gebruikt. Bijvoorbeeld, temperatuur gerelateerde studies niet mogelijk doch met Bruker imaging station, aangezien temperatuurregeling is geen kenmerk van de apparatuur. Bovendien kan het gebruik van kleurstoffen (zoals Nile Red te rhamnolipiden vlekken) kinetica en concentratie beperkingen ⁸ hebben. Deze techniek sterk afhankelijk van de verwerking en analyse van digitale beelden; verbeterde automatisering van gegevensanalyse (bijvoorbeeld middels aanvullende Macro scriptfunctie in ImageJ) zou de tijd die nodig is voor de analyse te beperkenen uitbreiden van de bruikbaarheid van de gegevens. Tenslotte vanwege de robuustheid van de beeldvormende protocol moet toekomstige toepassingen gericht op de uitbreiding van deze techniek tot minder uniforme groei oppervlakken die relevanter oppervlakken gekoloniseerd door milieu- en pathogene bacteriën te onderzoeken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentsa
FAB Minimal Media:			Bereid elke ~4 weken. Breng aan tot 1 L met nanopure H2O.
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	2 g. Niet gebruikt in P. aeruginosa tendrilvormingsstudies.
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	P5655	3 g
NaCl	BDH	BDH8014	3 g
MgCl2 x 6H2O oplossing (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml
CaCl2 x 2H2O oplossing (14 g/L)	Fisher Scientific	C79	1 ml
Spoormetaaloplossing (zie hieronder)	n/a	n/a	1 ml
Spoormetaaloplossing:			Breng aan tot 1 L met nanopure H2O. Bewaar in een glazen fles, roerend en afgedekt met folie.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientific	C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
CTT Media:			Bereid naar behoefte. Breng aan tot 100 ml met nanopure H2O.
Tris-HCl, 1 M oplossing (aanpassen naar pH 8.0)	Amresco	0234	1 ml. Bereid een 1 M stockoplossing in nano puur H2O. Pas pH aan naar 8.0 en filter steriliseer (0.2 μm poriën).
K2HPO4, 1 M oplossing (aanpassen naar pH 7.6)	Sigma-Aldrich	P3786	0.1 ml. Bereid een 1 M stockoplossing in nano puur H2O. Pas pH aan naar 7.6 en filter steriliseer (0.2 μm poriën).
MgSO4 oplossing	Fisher Scientific	M65	0.8 ml. Bereid een 1 M stockoplossing in nano puur H2O. Filter steriliseer (0.2 μm poriën).
Casitone	BD Diagnostics	225930	1 g
Aanvullende Reagentia:
LB Broth, Lennox	BD Diagnostics	240230	2% (wt/vol)
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM voor overnachtelijke bouillonculturen; 12 mM voor zwermmedia. Bereid een 1.2 M filter gesteriliseerde stockoplossing in nano puur H2O. Voeg toe aan media na het autoclaven.
Casamino zuren (CAA)	Amresco	J851	0.10% (wt/vol). Aanbevolen voor P. aeruginosa tendrilvormingsstudies. Voeg toe aan media vóór het autoclaven.
Agar, Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0.45% (wt/vol). Voorkeurs Noble agar voor P. aeruginosa oppervlakte motiliteitsstudies. Voeg toe aan media vóór het autoclaven.
Agar, Noble	Affymetrix	10907	1.50% (wt/vol). Gebruikt in M. xanthus oppervlakte motiliteitsstudies. Niet aanbevolen voor P. aeruginosa motiliteitsstudies. Voeg toe aan media vóór het autoclaven.
Agar, Gegranuleerd	Fisher Scientific	BP1423	0.60% (wt/vol)
Higgins Waterproof Black India Ink	Higgins	HIG44201	0.50% (vol/vol). Meng inkt met inoculum om zwermmedia oppervlakte vocht te testen.
SYTO® 64 Rood Fluorescerende Nucleïnezuurkleuring	Invitrogen	S-11346	Gebruik 4 μl (voor P. aeruginosa) of 8 μl (voor M. xanthus) van SYTO® 64 per 100 ml van smeltende agar (toegevoegd na het autoclaven).
Relevante materialen en apparatuur
Petrischaal, steriel, 150 mm x 15 mm (Dia. x H)	VWR	25384-326
Petrischaal, steriel, 100 mm x 15 mm (Dia. x H)	VWR	25384-342