Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat grote hoeveelheden muis-monocyten genereert uit heterogeen beenmerg voor translationele toepassingen. In vergelijking met andere methoden helpt deze nieuwe methode het aantal geofferde dieren te verminderen en de kosten te drukken door dure methoden zoals hooggradige magnetische celscheiding (MACS) te vermijden.

Samenvatting

Als subtype van leukocyten en voorlopers van macrofagen, zijn monocyten betrokken bij vele belangrijke processen van organismen en zijn ze vaak het onderwerp van verschillende gebieden in de biomedische wetenschap. De hieronder beschreven methode is een eenvoudige en effectieve manier om murine monocyten te isoleren uit heterogeen beenmerg.

Beenmerg van het dijbeen en scheenbeen van Balb/c muizen wordt geoogst door het spoelen met fosfaat gebufferd zout (PBS). De celsuspensie wordt aangevuld met macrofaag-koloniestimulerende factor (M-CSF) en gekweekt op ultra-lage hechtingsoppervlakken om aanhechting-getriggerde differentiatie van monocyten te voorkomen. De eigenschappen en differentiatie van monocyten worden gekarakteriseerd op verschillende intervallen. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), met markers zoals CD11b, CD115 en F4/80, wordt gebruikt voor fenotypering. Aan het einde van de cultivatie bestaat de suspensie uit 45%± 12% monocyten. Door het verwijderen van adhesieve macrofagen kan de zuiverheid worden verhoogd tot 86%± 6%. Na de isolatie kunnen monocyten op verschillende manieren worden gebruikt, en een van de meest effectieve en gebruikelijke methoden voor in vivo toediening is intraveneuze injectie in de staartvene.

Deze techniek van isolatie en toepassing is belangrijk voor muismodelstudies, vooral op het gebied van ontsteking of immunologie. Monocyten kunnen ook therapeutisch worden gebruikt in muisziektemodellen.

Inleiding

De isolatie van monocyten is belangrijk en cruciaal voor veel in vitro en in vivo studies. Deze cellen zijn doelwitten voor ziekten zoals perifere arteriële ziekte, coronaire hartziekte of andere ischemische ziekten, omdat de groei van zijvaatjes sterk wordt aangedreven door lokale ontsteking. Ontstekingsreacties omvatten endotheliale activering en lokale aanwerving van leukocyten, voornamelijk monocyten, die vervolgens rijpen tot macrofagen en een zeer arteriogeen milieu creëren door het afscheiden van meerdere groeifactoren om de remodellering van een arteriool in een functionele zijslagader te induceren^1-3. Monocyten rijpen ook uit tot dendritische cellen, die vaak worden gebruikt voor immunologische studies^4,5 en kankeronderzoek^6,7.

Problematisch bij de benadering voor monocyte-isolatie uit perifeer bloed⁸ is het hoge aantal donordieren dat nodig is om een voldoende hoeveelheid monocyten te produceren voor de meeste analyses. Eerdere protocollen beschrijven methoden zoals dichtheidsgradientcentrifugatie en celafvoer via MACS⁹ bij het isoleren van monocyten; deze technieken kunnen echter de kenmerken en functionaliteit van monocyten veranderen, wat kan leiden tot problemen bij de interpretatie^10,11. Bovendien zijn deze methoden moeilijk en kunnen ze de experimentele reproduceerbaarheid verminderen.

Ons doel met dit protocol is om een eenvoudige en kosteneffectieve methode te bieden om grote hoeveelheden beenmerg-afgeleide monocyten te genereren. Vanwege de hoge celopbrengst van 11 x 10⁶ ± 3 x 10⁶ cellen die met dit protocol worden verkregen, kunnen we het aantal muizen dat nodig is tijdens de isolatie van beenmerg-afgeleide monocyten aanzienlijk verminderen. De procedure kan binnen een minimale hoeveelheid tijd worden voltooid, en zonder het gebruik van dure en ingewikkelde technieken zoals hierboven vermeld. Hier extraheren we monocyten uit een native beenmergsuspensie van donormuizen, cultiveren de suspensie op ultralage hechtingsplaten en suppleren de oplossing met 20 ng/ml M-CFS. Op dag 5 van incubatie worden cellen geoogst en gekarakteriseerd om functionele en fenotyische eigenschappen te bevestigen.

Voor experimenten op het gebied van arteriogenese is intraveneuze transplantatie van deze beenmerg-afgeleide monocyten in muizen een effectieve methode voor systemische medicijnafgifte, die kan worden gecombineerd met femorale arteriële ligatie in gangbare perifere arteriële ziektemodellen.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd met toestemming van de deelstaat Saksen en Saksen-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, volgens artikel 8 van de Duitse wet voor de bescherming van dieren (24D-9168,11-1 / 2008-24).

1 celisolatie

1.1 Voorbereiding van het femur en de tibia

1. Verdoven van de muis met behulp van een 5% isofluraan concentratie door verdampen isofluraan in een gesloten bak. Nadat de muis is gestopt met bewegen gedurende 3 sec, voer dan de cervicale dislocatie.
2. Ontsmet de achterste ledematen met ethanol (96%). Verwijder de huid en de spieren en de botten te scheiden met een steriel scalpel.
   1. Begin met een lies incisie en verlengt de incisie naar de mediale malleolus en voer een cirkelvormige dissectie van de huid rond het onderste kuit. Schil de benen volledig door pellen proximaal.
   2. Maak de quadriceps spier uit het dijbeen met een scherp scalpel, verwijder zowel de voorste peroneusen de gastrocnemius spiergroepen en ontleden het been bij het heupgewricht door het lokaliseren en het ontleden van de ligamenten.
   3. Start naar voren en ga rond het gewricht door voorzichtig draaien van het been en transecting de ligamenten, waardoor het gewricht disarticulating.
3. Was femur en tibia met 96% ethanol gedurende tenminste 90 sec aseptische celpreparaat garanderen. Blijven het wasproces met steriele PBS te spoelen resterende ethanol.
   Opmerking: Alle volgende stappen moeten steriel om verontreiniging te voorkomen.

1.2 Het oogsten van Bone Marrow

1. Knip het proximale en distale uiteinde van elk been met een paar fijne schaar om toegang tot de femorale en tibiale schachten krijgen. Wees voorzichtig met deze stap, omdat deze botten breken heel gemakkelijk.
2. Spoel de botten met warme medium (M199 + 10% foetaal kalf serum (FCS), + 1% penicilline / streptomycine). Gebruik een steriele 28-G naald, een 1 ml spuit, en tussen 10-15 ml medium perbot voor het spoelen.
3. Houd het bot met een fijn pincet en spoel één voor één, totdat het blijkt semi-doorzichtig. Breng zorgvuldig druk op het uiteinde van de zuiger om celstress minimaliseren.
4. Filter het beenmerg door een 70 micrometer nylon web en het verzamelen van het filtraat. Om de maximale hoeveelheid beenmerg halen, herhaaldelijk spoelen van de distale en proximale uiteinden.
5. Spoel de zeef met PBS en het verzamelen van het filtraat. Voorzichtig los puin en cellulaire conglomeraten door zacht roeren en pipetteren.

1.3 Teelt

1. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met ongeveer 25 ml medium. Herhaal een keer.
2. Resuspendeer de cellen in 6 ml van medium na de tweede wasstap. Meng 50 ul van de cel oplossing met 50 ul van trypan blauw. Tel de cellen in een telkamer onder een lichtmicroscoop. Bereken het aantal Cellen in de oplossing met deze formule:
   
3. Zaad de cellen op 6 putjes oppervlak ultra-low-bevestigingsplaten permanente hechting aan de onderzijde van de plaat te voorkomen. Gebruik een concentratie van 10 ⁶ cellen per ml met 6 ml per putje.
4. Aanvullen van de ophanging met 20 ng / ml M-CSF om celdifferentiatie te bevorderen.
5. Culture de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C en 5% kooldioxide en dagelijks observeren.

1.4 Het oogsten van Cellen

Opmerking: Deze stappen moeten worden uitgevoerd op ijs. Ga verder met ofwel 1.4.1 of 1.4.2 dienovereenkomstig.

1. Op dit punt, de oogst van de hele cultuur, met inbegrip van gedifferentieerde macrofagen, dat zal zich houden aan de cultuur-platen, zelfs als ze zijn ultra-low-attachment oppervlak platen.
   1. Oogst de hele cultuur door zachte pipetteren en losmaken met een oplossing van 4 ° C PBS, 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA. Herhaal dit totdat de platen vrij zijn van resterende hechtende cellen - bevestigen onder een microscoop als onzeker.
2. Als alternatief, gooi aanhangend macrofagen door het oogsten van de bovenstaande vloeistof met de cellen in suspensie, die voornamelijk bevatten monocyten.
   1. Oogst de niet-hechtende cellen met een oplossing van EDTA-vrij PBS en 0,5% BSA. Oefen niet te veel kracht om te vermijden loskomen mild aanhangend macrofagen.

1.5 FACS-analyse (optioneel)

Opmerking: Het is mogelijk om de celsuspensie van CD117 ⁺ stam- en progenitorcellen verminderen door toepassing van MACS. Gebruik fabrikant protocollen voor deze procedure.

1. Oogst de cellen volgens een stap 1.4.1 of 1.4.2.
2. Centrifugeer de cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en herhaal deze stap.
3. Resuspendeer ten minste 250.000 cellen in 300 pi FACS bUffer per sonde.
4. Transfercel oplossing op een 96-well plaat (30 ui per putje).
5. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
6. Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 25 ul van antilichaam aan elk putje (gebruik fabrikant verdunning).
7. Vlekken op de cellen met antilichamen (volgende protocollen van de fabrikant voor mobiele fenotypering na stappen 1.5.1-1.5.6. Veel gebruikte merkers voor monocyt / macrofaag identificatiegegevens CD11b, F4 / 80 (figuur 3), CD115 (figuur 2), en GR- 1.
   Opmerking: Voor een verdere beschrijving van de mobiele oplossingen, is het gebruik van markers zoals CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G en CD192 aanbevolen. Cellulaire kenmerken werden eerder beschreven ^12.
8. Incubeer de sondes gedurende 20 min bij 4 ° C.
9. Centrifugeer de probes bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer met 200 ui FACS-buffer. Herhaal this stap twee keer.
10. Breng de sondes in FACS buizen en de FACS-analyse ¹² uit te voeren.
11. Voer FACS-analyse ¹² op dag 0, 3 en 5 tot celdifferentiatie analyseren.

2. staartaderinjectie

2.1 Voorbereiding

1. Verwarm de dieren op een verwarmingsplaat bij 37 ° C gedurende ongeveer 10 minuten. Observeer de dieren tijdens het opwarmen om tekenen van oververhitting te herkennen.
2. Resuspendeer de monocyten, geïsoleerd in stappen 1.1- 1.4, in 150 ul van NaCl, en laadt de cellen in een 1 ml insuline spuit met een 30G naald. Lichtjes vortex de oplossing voor het laden van de spuit om ervoor te zorgen alle monocyten worden geïnjecteerd. Ga altijd cellen op ijs om warmte-gemedieerde gehechtheid en activering van monocyten te vermijden.

2.2 Tegenhouden

1. Te storen andere muizen in de kooi bij het kiezen van een muis voor intraveneuze injectie.
2. Plaats de muis in de restrainer. Vermijd te veel prEssure en wees voorzichtig met de achterpoten. (Figuur 4)
   Opmerking: U kunt ook gebruik maken van algemene anesthesie om stress vrije omgang met de dieren te garanderen.
3. Zorg ervoor dat de muis heeft ruimte om te ademen voor het sluiten van de restrainer.

2.3 Injection

1. Ontsmet de injectieplaats met desinfectiemiddel. Spray op de staart van de muis en laat minstens 1 min.
2. Stop veneuze bloedstroom van de staart door het toepassen van lichte druk op de laterale zijde staart boven de injectieplaats, voor een betere zichtbaarheid van de aderen.
3. Draai de staart 90 graden, vóór de injectie. (Figuur 5)
4. Injecteer een hoek van 45 graden. Langzaam injecteren en niet meer dan 5 ul per g tot nadelige gevolgen voor dieren te voorkomen.
5. Als er een blaar, wat een teken is van een mislukte injectie, stop dan onmiddellijk en herhaal de injectie meer proximaal.
6. Stop het bloeden op de injectieplaats naast het toepassen van lichte pressure gedurende ongeveer 1 min.
7. Aan het einde van de procedure, opent het oprolmechanisme en plaats de muis in de kooi.
8. Neem de muis gedurende 20 minuten zodat het dier niet werd aangetast door de injectie en borstligging wordt gehandhaafd. Verleng de tijd van de waarneming, totdat de muis herwint voldoende bewustzijn. Zet de muis om het gezelschap van andere dieren pas nadat deze volledig is hersteld.

Resultaten

De celoplossing uit het murine beenmerg voor verschillende celtypen. De belangrijkste celtypen zijn lymfocyten, granulocyten en monocyten. Celtypen kan worden geschat op grootte en granulariteit, die wordt getoond in figuur 1 voor zowel natief suspensies en cellen geoogst na 5 dagen differentiatie. Let op de verschuivende cellulaire samenstelling tijdens de teelt. Echter, moet nauwkeurige classificatie van de bevolking rekenen op de kenmerkende expressie van cellulaire merkers.

Discussie

We beschrijven een eenvoudige en kosteneffectieve methode om grote hoeveelheden muizen monocyten uit beenmerg te isoleren. In vergelijking met andere protocollen gebruiken perifeer bloed, die monocyt opbrengsten ⁵ 1,4 x10 ⁶ te verkrijgen, kunnen we hogere opbrengsten te verkrijgen van 11 x 10 ⁶ ± 3 x 10 ⁶ monocyten van een enkele donor muis.

Bij het overwegen problemen met deze methode is het belangrijk om de mogelijkheid te vermelden vervuiling bi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6-well-ultra-low-attachment plate	Corning Incorporated, NY, USA		6-well-ultra-low-attachment plate, met dop, steriele
8- 12 week old, male, balb/c mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
96-well-plate	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Blue dead cell stain	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany
Bovine serum albumine	GE Healthcare, Freiburg, Germany		Fractie V, pH 7.0
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		28G, 30G
CD115	eBioscience, San Diego, USA	12-1152
CD11b	eBioscience, San Diego, USA	53-0112
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Met dop, steriele
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra® X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany		Kodan Tinktur forte
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Ethanol 96%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Extraction unit Pipetus	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany
F4/80	AbD Serotec, Düsseldorf, Germany	MCA497APC
FACS buffer	Vervaardigd door onze groep met afzonderlijke componenten		PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3
FACS device	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		BD FACS Canto II
FACS tubes	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Falcon® pipette	Becton Dickenson Labware, NY, USA
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Gr1	eBioscience, San Diego, USA	53-5931
Heating plate	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany		Incu safe
Isofluran	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 °C
Macrophage-Colony Stimulating Factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Mechanical shaker	IKA, Staufen, Germany		ms2 minishaker
Medium 199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria		Voor gebruik opwarmen in 37 °C waterbad
Micro test tubes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Monocyte wash buffer	Vervaardigd door onze groep met afzonderlijke componenten		PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
Mouse restrainer	Verschillende
NaCl	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
NaN3 (sodium acide)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Nylon cellsieve	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA		Cell strainer, 70 µm mesh size
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Phosphate buffered saline	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		pH 7.4, steriele
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µl/100µl/200µl/1.000µl
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Serological pipette	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 5 ml, 10 ml
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		1 ml Omnifix® -F insulinesyringe
Tubes with cap	Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany		15 ml/50 ml Cellstar tubes
Warm water bath	Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany		Julabo SW22