Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

12.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52353

⸱

4 maart 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Samenvatting

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese in de knaagdierhersenen met de organotypische slice cultuur techniek. Deze methode houdt de karakteristieke topografische morfologie van de hippocampus terwijl directe toepassing van farmacologische middelen om de ontwikkeling van de hippocampus dentate gyrus. Daarnaast kan slice culturen worden gehandhaafd voor maximaal 4 weken en dus mogelijk maken om het rijpingsproces van de pasgeboren korrel neuronen te bestuderen. Plak kweken een doelmatig farmacologische manipulatie van hippocampale plakjes met uitsluiting complexe variabelen zoals onzekerheden betreffende de diepe anatomische locatie van de hippocampus en de bloed-hersenbarrière. Daarom wilden we organotypische slice cultures specifiek optimaliseren postnatale neurogenese onderzoek.

Inleiding

Volwassen neurogenese in de hippocampus van zoogdieren vertegenwoordigt een opmerkelijk voorbeeld van de aangeboren aanpassingscapaciteit en plasticiteit van de hersenen. Dentate granule cellen (DGC's) worden gegenereerd uit een hernieuwbare pool van neurale voorlopercellen in de dentate gyrus van de hippocampus, die een van de twee momenteel goed gekarakteriseerde neurogene gebieden in de zoogdierhersenen is en waarvan wordt gedacht dat het bijzonder belangrijk is voor leren en geheugen. De hippocampus maakt deel uit van het limbische systeem en heeft een diepe locatie in de hersenen van zoogdieren, wat het een moeilijk doelwit maakt voor nauwkeurige farmacologische manipulatie. Bovendien is afwijkende neurogenese geïmpliceerd in aandoeningen zoals epilepsie, schizofrenie en de ziekte van Alzheimer, wat de belangstelling heeft gewekt om de invloed van verschillende farmacologische middelen te begrijpen tijdens de rijping en overleving van pasgeboren neuronen. Het onderscheid tussen postnatale en volwassen neurogenese is vervaagd en eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat veel kenmerken van in vivo neuronale ontwikkeling in de vroege postnatale periode en volwassenheid vergelijkbaar zijn25. Hier benadrukken we postnatale neurogenese en suggereren we mogelijke toepassingen op volwassen neurogenese.

Organotypische plaksnede culturen bieden een efficiënte in vitro methode voor het bestuderen van verschillende fysiologische eigenschappen van de zoogdierhersenen. De waarde van plaksnede culturen bereid uit hersenen van knaagdieren kan worden samengevat in drie hoofdkwaliteiten: 1) het protocol is eenvoudig en vereist gemakkelijk verkrijgbare materialen; 2) plaksnede culturen staan farmacologische studies toe die complexe variabelen elimineren, zoals de diepe anatomische locatie van de hippocampus en omzeilt de bloed-hersenbarrière1; en 3) de goed gekarakteriseerde structuur van de hippocampus en tri-synaptische circuit wordt behouden2. Eerdere onderzoekers hebben de organotypische hippocampale cultuur gebruikt om synaptische ontwikkeling en fysiologie3,4, gliogenese5-7, ischemische hersenbeschadiging8,9, neuroprotectie en neuroreparatie10-12 en epilepsie13-15 te bestuderen. De plaksnede culturen kunnen ook een nuttig modelsysteem bieden dat het mogelijk maakt om de ontwikkeling van cellen te monitoren in combinatie met het labelen van cellen met groen fluorescent eiwit (GFP) of andere vitale markers.

Plaksnede culturen zijn ook eerder gebruikt om postnatale hippocampale neurogenese te bestuderen16-19, maar een belangrijke factor in de meeste van deze onderzoeken is de goed gekarakteriseerde degeneratie die resulteert uit het explanteren van weefsel van volwassen dieren na ongeveer 2 weken in vitro20,21. Om deze reden worden plaksnede culturen meestal bereid uit vroeg postnataal (P5-P10) muizen of rattenpups, die gebruikmaken van de verbeterde levensvatbaarheid van vroeg postnataal hersenweefsel voor het kweken22. Hoewel eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat de vroeg postnatale en volwassen hippocampus verschillen met betrekking tot synaptische fysiologie en de expressie van specifieke neuronale subtypen23,24, is er een substantiële conservering van het gekoreografiede ontwikkelingsprogramma dat pasgeboren dentate granule cellen doorlopen tijdens de rijping25. Bovendien hebben recente onderzoeken gesuggereerd dat de fysiologische kenmerken van pasgeboren DGC's in cultuur zeer vergelijkbaar zijn met onrijpe neuronen in de acute hippocampale plaksnede voorbereiding16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures gelijkvormig aan de diergezondheid en het welzijn richtlijnen van de afdeling Vergelijkende Geneeskunde aan de Universiteit van Toronto.

1. Bereiding van hippocampus Plakjes

  1. Steriliseren de volgende instrumenten met behulp van de droge autoclaaf bij 125 ° C: Scalpel handvat (# 3) (2), Standard patroon tang, groot (1), Kleine dissector schaar (schuin naar rechts) (1), Micro lepel (lepel en een flatscreen spatel uiteinden) (1), Micro-spatels (afgeronde en afgeronde taps toelopende uiteinden) (2), Fijn penseel (1), Vuur gepolijste Pasteur pipet (2), gaas pleinen, 2 x 2 inch (5).
  2. Als steriel, zet de instrumenten in een steriele container en houd overdekt tot gebruik. Onmiddellijk voor dissectie, dompel instrumenten in een 70% ethanol oplossing.
  3. Bereid een 6-well kweekplaat met kweekinsertie alvorens met de dissectie procedure door toevoeging van 1 ml kweekmedium / putje en opslaan van de plaat in de incubator bij 35 ° C eennd 5% CO2.

2. Schik Dissectiemateriaal in steriele laminaire stroming kap

  1. Spuit de laminaire stroming kap met 70% ethanol en verwijder gesteriliseerde dissectie instrumenten van alcohol. Laat de instrumenten te drogen terwijl het rusten op een steriele petrischaal om het contact tussen de alcohol en de ontleed hersenweefsel te vermijden.
  2. Borg 5-7 ml gesteriliseerd ijskoude ontleden oplossing in 2 grote steriele petrischalen. Een gerecht zal chill en reinig de kop (vuile), de andere voor het koelen en spoelen van de schepte hersenen (schone). Plaats een gesteriliseerd filtreerpapier in een van de petrischaal deksels voor het ontleden van de hersenen.
  3. Plaats een kleine, gesteriliseerd filtreerpapier in een van de kleine petrischaal deksel voor het ontleden van de hippocampus. Borg 3-5 ml gesteriliseerd ijskoude ontleden oplossing in 2 kleine, steriele petrischalen. Een gerecht zal de schepte hippocampus te houden, zal men secties te houden tijdens de scheiding van de hippocampus sectiesonder dissectie microscoop.
  4. Bereid het weefsel chopper met tape een stuk gesteriliseerd filter papier om het uitsnijden en het monteren van een steriele scheermesje. Bevochtig het filter papier met gesteriliseerd ontleden oplossing.
  5. Spuit een schone bio-tas met alcohol en plaats het in laminaire stroming schone werkbank.

3. hippocampus Dissection

  1. Spuit de P7 Sprague Dawley rattenpup met 70% ethanol buitenkant van de laminaire stroming schoon bankje en snel onthoofden het dier met behulp van grote steriele chirurgische schaar in de laminaire stroming bankje. Laat het hoofd laten vallen in ijskoude ontleden oplossing in een van de petrischaaltjes.
  2. In de petrischaal, spoelen het bloed en snel overbrengen het hoofd te gesteriliseerde filterpapier, ventrale zijde naar beneden.
  3. Met behulp van de scalpel, snijd langs de dorsale oppervlak in het sagittale vlak aan de onderliggende schedel bloot te leggen. Knip de huid, maar niet het onderliggende bot, dat zacht en gemakkelijk door ratten aan Tzijn leeftijd. Zet opzij deze "vuile" scalpel en niet te gebruiken op hersenweefsel.
  4. Met behulp van de kleine dissector schaar (schuin naar rechts) en een tang, opengesneden de schedel langs pijlnaad van de schedel naar bregma, de anatomische punt op de schedel waar de coronale hechtdraad loodrecht wordt doorsneden door de pijlnaad. Gebruik een tang om de schedel flappen omhoog en weg te trekken van de middellijn van de schedel.
  5. Plaats de micro lepel op de onderzijde van de hersenen, onder de hersenstam, naar til de hersenen uit de schedel. Til de hersenen naar de oogzenuwen en het reukorgaan op basale oppervlak van de hersenen bloot te leggen. Snijd deze structuren met een kleine schaar om volledig los van de hersenen uit de schedel. Haal en breng de intacte hersenen naar de andere grote petrischaal met ijskoude ontleden oplossing.
  6. Met behulp van de micro Schep de hersenen om een ​​kleine petrischaal deksel, die een steriele filter papier. Met een steriele Pasteur pipet, spoel de hersenen met enkele druppels dissecting oplossing om weefsel vochtig te houden.
  7. Met een "schone" scalpel snijden de twee hersenhelften elkaar. Breng de linker hersenhelft naar grote petrischaal met micro lepel en plaats halfrond pia beneden tegen ijskoude ontleden oplossing voor verder gebruik.
  8. Bekijk de mediale zijde van de rechter hersenhelft en identificeren van de rand fornix, een prominente band van witte stof langs de mediale rand van de hippocampus. Met behulp van een steriel scalpel een sagittale snede door de fornix, maar zorg omdat slechts 0,5 cm van de scalpel tip voldoende om de fornix snijden zal zijn.
  9. Met behulp van 2 micro-spatels, verwijdert u de eerste hippocampus van rechter hersenhelft door het plaatsen van de rechter-spatel op de hersenstam en het opheffen van de bovenliggende cortex met de linker spatel. Til de cortex aan de laterale ventrikel en mediale oppervlak van de hippocampus onthullen. Een witte gebogen lijn, de fimbria, moet nu zichtbaar.
  10. Lijn de kromming van spatel met de curvatuur van de fimbria en druk voorzichtig op de spatel onder de fimbria. Schuif de spatel links en rijden langs rostrale-caudale as en til spatel in dorsale richting hippocampus te verwijderen.
  11. Breng de hippocampus naar een 2 e kleine petrischaal met ijskoude ontleden oplossing. Herhaal dezelfde procedure op de linker hersenhelft aan de linker hippocampus te verwijderen.
  12. Met een micro spatel voorzichtig de hippocampus dragen aan het weefsel chopper fase. Leg ze naast en evenwijdig aan elkaar en loodrecht op de as van de hakblad. Gebruik een penseel om het weefsel te positioneren en enkele druppels van de oplossing ontleden bovenop de hippocampus.
  13. Snijd het weefsel in 400 pm plakjes zonder te pauzeren om afzonderlijke segmenten te verwijderen (meestal zullen ze niet houden aan het blad). Na de hele hippocampus is gesneden, gebruik de verfkwast om voorzichtig overdracht van de sectie om een 2 e kleine petrischaal met dissectie oplossing.
  14. Onder advertentieissecting microscoop, zorgvuldig scheiden de drijvende plakjes met behulp van amicro-spatel en penseel.
  15. Verwijder de voorbereide cultuur plaat met cultuur insert uit de incubator en plaats in een laminaire stroming kap.
  16. Met behulp van een brand gepolijst Pasteur pipet, trek 4-5 sneetjes in de pipet en overdracht plakjes aan het apicale oppervlak van cultuur insert membraan. Vervolgens past u de positionering met een penseel en laat ruimte tussen de afzonderlijke secties en de grens van de cultuur insert.
  17. Met behulp van een steriele Pasteur pipet, verwijder de overtollige ontleden oplossing van apicale oppervlak van het membraan.
    LET OP: bij het verwijderen oplossing vermijden, coupes in de pipet. U kunt ook gebruik maken van een gewone pipet (P200 of P1000) met gesteriliseerde pipet tips om langzaam te verwijderen oplossing.
  18. Plaats de kweekplaat met serum bevattend kweekmedium en de hippocampale plakken terug in de incubator bij 35 ° C en 5% CO2.
    OPMERKING: Als experiment gesprekkenvoor het genereren van culturen uit meerdere dieren, grondig reinigen van de laminaire stroming schoon bankje tussen dissecties. Terug instrumenten om alcohol oplossing en vervang alle Petri-gerechten, filter papers en steriele scheermesjes voorafgaand aan de tweede dissectie.

4. Het voeden en onderhouden Organotypische Slices

  1. Feed culturen in een steriele laminaire stroming schoon bankje.
  2. Voer de eerste voeding van de gekweekte secties 2 dagen na de dissectie. Zuig oude kweekmedium met een gesteriliseerde glazen pipet.
  3. Gebruik steriele 5 ml serologische pipet 1 ml verse, steriele, serum bevattend medium aan de putjes.
  4. Vervang voorzichtig de cultuur insert en zorgen om eventuele luchtbellen die onder membraanoppervlak kan gevormd hebben te verwijderen.
  5. Na de eerste voeding, veranderen medium elke andere dag.

5. Incubatie Tissue segmenten met Thymidine analogen aan Label Pasgeboren Neuronen

  1. Om te onderzoekende rijping en integratie van dentale granule cellen in de hippocampus, incubeer de organotypische plakjes met een analoog van thymidine, zoals Bromodeoxyuridine (BrdU) of Chlorodeoxyuridine (CldU). Hier gebruiken we CldU vanwege de hogere oplosbaarheid in zoutoplossing.
  2. Na 3DIV, voeg 1 ui 10 mg / ml CldU voorraadoplossing in zoutoplossing 1 ml kweekmedium voor een eindconcentratie van 10 ug / ml. Als BrdU wordt gebruikt, corrigeer de concentratie verschillen in molecuulgewicht. Medium toe te voegen met CldU tot cultuur putten en incubeer weefsel met CldU-bevattend medium gedurende 2 uur bij 35 ° C.
  3. Na 2 uur incubatie bij 35 ° C, verwijder de CldU-bevattend medium en vervang regelmatig voedingsmedium normale voedingsschema (hierboven beschreven) te hervatten.

6. Tissue Fixatie en opslag

  1. Opzetten van een tijdlijn voor het toepassen van behandelingen en de vaststelling van weefselmonsters voordat cultuur experimenten (Figuur 2B).
  2. Bij een voorafbepaalde dag na dissectie, bereid de volgende in een laboratorium zuurkast: een bekerglas van 10-50 ml met 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS); een lege beker voor afgedankte kweekmedium; kleine tang; en een pipet 1000 ml met wegwerp tips.
  3. Verwijder de cultuur plaat (s) vanaf incubatiekamer en overbrengen in een zuurkast. Kantel de individuele well plaat inserts met een pincet. Vervolgens gebruikt u een pipet om kweekmedium en overdracht te verwijderen om een ​​verwijdering beker. Kantel de cultuur plaat in een hoek om ervoor te zorgen dat alle kweekmedium wordt verwijderd.
  4. Eindig het verwijderen medium voor één cultuur plaat tegelijk. Als medium is verwijderd, voeg 1 ml van 4% PFA aan elke cultuur goed en sluiten goed plaat met parafilm. Herhaal dit voor kweekplaten als nodig en overdracht platen koelkast bij 4 ° C gedurende 24 uur.
  5. Na 24 uur, de voorbereiding van de volgende in een zuurkast: 10-50 ml bekerglas met 0,1% natriumazide in PBS; een legebeker voor afgedankte PFA (volg de veiligheidsinstructies wanneer zij zich ontdoen van giftige stoffen); kleine tang; en 1.000 ml pipet met wegwerp tips.
  6. Volg de procedure die in 6.4 voor het toevoegen van PFA, maar voeg 1 ml PBS met natriumazide plaats. Eenmaal volledig overgedragen, verbinding putjes voor toekomstig gebruik door het wikkelen randen parafilm en bewaren in de koelkast bij 4 ° C.

7. Snijden Tissue voor Immunohistochemistry

  1. Voeren weefsel snijden met behulp van een vibratome. De volgende reeks stappen helpen maximaliseren van de opbrengst van bruikbare coupes van organotypische culturen.
    OPMERKING: Onmiddellijk na hippocampale dissectie en plating van segmenten, het weefsel heeft een dikte van ongeveer 400 pm. Na 2-3 weken in de incubatiekamer zal weefselcoupes begint af te vlakken, hetgeen uiteindelijk een snijdikte van 150-300 urn.
  2. Bereid de volgende items te vinden in hoofdstuk gekweekte weefsel: een # 11 scalpel blade en handvat, een glazen petrischaal met ijskoude PBS, een micro-dissectie tang, en een schone vibratome uitsnijden om weefsel te monteren.
  3. Gebruik een scalpel zorgvuldig snijden langs de omtrek van de cirkelvormige insert membraan zodat het kan worden losgemaakt van het kunststof inzetstuk behuizing. Verlaat voldoende ruimte tussen de gekweekte slice en de scalpel.
  4. Breng de vrijstaande insert membraan naar een petrischaal met PBS. Na spoelen met PBS, een tang om het membraan te dragen aan de vibratome montage fase.
  5. Vervolgens gebruikt de scalpel om overtollig membraan rond gekweekte plakjes te elimineren en weggesneden overtollig materiaal om schone randen te creëren. Deze stap zorgt het membraan vlak en kan gemakkelijk hechten aan het snijoppervlak.
  6. Plaats 1-2 druppels lijm op de vibratome uitsnijden en verspreid in gelijkmatige laag met behulp van een 22 G naald. Verspreid lijm in een rechthoekige vorm met de lange zijde evenwijdig met het zaagblad van de vibratome. Voer deze stapsnel de lijm uitdroogt.
  7. Gebruik een tang om de bijgesneden membraan dat de hippocampus plakjes over te dragen aan het uitsnijden en voorzichtig te positioneren het membraan op de lijm en ervoor zorgen dat er geen luchtbellen.
  8. Zoals de superlijm droogt, overdracht van de vibratome podium met de gelijmde membraan terug naar het PBS met petrischaal. Bereid de vibratome blad en een 48 wells plaat met natriumazide om weefsel secties te slaan.
  9. Gebruik de vibratome tot 30 urn van de organotypische slice weefsel en overdracht genereren van een 48 wells plaat met natriumazide voor opslag en daaropvolgende immunohistochemische kleuring.
  10. Verwijzen naar reeds bestaande protocollen voor immunohistochemische kleuring 26,29.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bepalen of organotypische culturen geschikt voor volwassen neurogenese onderzoek nodig zou zijn dat zij voldoen aan twee belangrijke criteria: 1) dat de schijfjes te onderhouden karakteristieke morfologische kenmerken van de hippocampus plakjes na 10-21 dagen in vitro (DIV), en 2) dat pasgeboren DGCs kunnen worden gekwantificeerd met behulp van standaard immunohistochemische technieken die gewoonlijk in volwassen neurogenese onderzoek. Ten aanzien van het eerste criterium, Figuur 1A en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Volgende CldU (of BrdU) administratie, kan de tijdlijn van toepassing van farmacologische middelen worden gekozen om pasgeboren DGCs tijdens bepaalde ontwikkelingsstoornissen ramen richten. Bijvoorbeeld kan een hypothetische middel worden toegepast tijdens de tweede week na CldU injectie, die wordt voorgesteld samenvallen met de leeftijd van onvolwassen neuronen die in een ontwikkelingsfase waarin GABA is depolariserende. Toekomstige studies met dit protocol kan de farmacologisch middel en het raam van blootstelling aan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een onderzoekssubsidie MOP 119271 aan JMW door het Canadese Instituut voor Gezondheidsonderzoek. De auteurs willen mevrouw Yao Fang Tan bedanken voor haar uitstekende technische assistentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU)MP Biomedicals105478Gevaarlijk, Carcinogeen
Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore sizeThermo scientific 140660Nuclon delta coating op deze inserts zorgt voor betere weefselhechting en verbetert de kwaliteit van de plakjes.
Conical Centrifuge tubes (sterile)Fisher Scientific14-432-22
Dissector schaar (zijdelingse hoek)Fine Science Tools 14082-09
Minimum essential medium (MEM)Gibco11095; vloeibaarBewaar bij 4 °C
Eclipse Ni-U fluorescente microscoopNikon
Lijm voor weefselKrazy GlueKG585Gebruik een minimale hoeveelheid lijm om hechting te bereiken, aangezien elk weefsel dat aan lijm is blootgesteld onbruikbaar zal zijn voor IHC.
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml)Gibco14025-092Bewaar bij 4 °C
Horse Serum Heat Inactivated (500 ml)Gibco16050-122Maak 50 ml aliquots en bewaar bij -20 °C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
Gemodificeerde glazen pipetten (bodem van Pasteur-pipet verwijderd en rand gladgemaakt met Bunsen-vlam)
Petrischaal (100 mm x 15 mm) en (60 mm x 15 mm)Fisher BrandFB0875712 en FB0875713A
Scalpel bladen #11Fine Science Tools10011-00
Scalpel handvat #3Fine Science Tools10003-12
Serologische pipettenSorfa Medical Plastic Co.P8050
Standard Pattern pincettenFine Science Tools11000-12
Steriele vacuümfilterThermo-Scientific565-0020
Chirurgische schaarFine Science Tools14054-13
Spuitgedreven filtereenheidMillipore-MillexSLGP033RS
Weefselknipper met beweegbare tafelStoelting 51425
Fijne punten verfkwast

Referenties

  1. Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
  2. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  3. Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  4. Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
  5. Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
  6. Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
  7. Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
  8. Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
  9. Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
  10. Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
  11. Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  13. Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
  14. Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271(2012).
  15. Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
  16. Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
  17. Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
  18. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).
  19. Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
  20. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  21. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
  22. Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
  23. Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
  24. Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
  25. Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409(2006).
  26. McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
  27. Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
  28. Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
  29. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  30. Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
  31. Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
  32. Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
  33. Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
  34. Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
  35. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  36. Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
  37. Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Organotypische plakcultuurhippocampale neurogenesegyrus dentatuslabeling met mitotische markersimmunohistochemische kleuringweefselsectievibratoomsectieceltellingsanalysefarmacologische manipulatiepostnatale neuronale rijping
Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.